復(fù)合植物水提物對(duì)奶牛乳房炎致病菌的體外抑制效果

■鐘華晨 王麗芳 張三粉 宋 潔 郭晨陽 黃 潔

（內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院 資源環(huán)境與檢測(cè)技術(shù)研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特010031）

奶牛乳房炎是由于微生物入侵乳腺組織引發(fā)的乳房炎癥，分為臨床型乳房炎和隱性乳房炎。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌是公認(rèn)的奶牛乳房感染的病原體，金黃色葡萄球菌引發(fā)傳染性乳房炎主要是通過擠奶工人以及擠奶工具等方式傳播，大腸桿菌屬于環(huán)境致病菌主要是通過墊料、糞便等途徑感染[1]。

目前，關(guān)于奶牛乳房炎的預(yù)防和治療主要使用抗生素以及非甾體類抗炎藥。治療效果主要取決于疾病的嚴(yán)重程度，藥物選擇，合理的藥物用法和劑量，以及對(duì)誘發(fā)原因的抑制。關(guān)于使用抗生素來治療乳房炎仍存在很多問題，持續(xù)存在的細(xì)菌以不同形式保護(hù)了它免受抗生素和宿主防御機(jī)制的侵害，它們可以復(fù)發(fā)為更具感染力的野生型表型，可能引起復(fù)發(fā)性感染[2]。此外，濫用抗生素會(huì)導(dǎo)致多重耐藥性的發(fā)生，以及增加牛奶中存在抗菌素殘留的風(fēng)險(xiǎn)，這使乳房炎成為對(duì)公共衛(wèi)生極為重要的疾病[3]。長(zhǎng)期大量使用抗生素會(huì)導(dǎo)致金黃色葡萄球菌和大腸桿菌攜帶有對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性的基因，并且這種耐藥性會(huì)傳播，引發(fā)更多的細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，并且會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥，增加治療成本[4]。

植物水提物具有無毒或低毒、不產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)[5]。植物水提物中富含有豐富的化學(xué)活性物質(zhì)，主要包括黃酮類、皂甙、萜類、生物堿、有機(jī)酸等，具有提高機(jī)體免疫力、抗氧化能力、抑菌、抗炎、清熱解毒等功效，逐漸被人們重視。

抗生素濫用亂用導(dǎo)致超級(jí)細(xì)菌及耐藥性問題產(chǎn)生，因此國家出臺(tái)政策明確了飼料端“禁抗”、養(yǎng)殖端“減抗、限抗”，并在194 號(hào)公告中規(guī)定2020 年藥物飼料添加劑全部退出市場(chǎng)。鑒于此，本試驗(yàn)針對(duì)引發(fā)奶牛乳房炎的主要致病菌金黃色葡萄球菌和大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)研究，旨在研究用植物水提物代替抗生素抑制和殺滅病原菌，為防控奶牛乳房炎提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株采用本實(shí)驗(yàn)室凍存的標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球菌（ATCC29213）、大腸桿菌（ATCC25922）。培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，均購于北京陸橋技術(shù)股份有限公司；植物水提物購于南京澤朗公司；諾氟沙星膠囊購于石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

主要儀器包括：恒溫培養(yǎng)箱（SPH150 型）購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；振蕩培養(yǎng)箱（FMS-100型）購自東京理化；高壓蒸汽滅菌鍋（MJ-54A）購自于美國STIK 公司；無菌操作臺(tái)（YJ-875 型）購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；牛津杯等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 植物水提物的制備

將蒲公英提取物、金銀花提取物、連翹提取物、益母草提取物分別選擇其中四種、三種、兩種按相同質(zhì)量比為1∶1均勻混合配置成復(fù)合物，分別稱取20 g溶解于超純水中，配置成濃度為1 g/ml的混合植物水提物溶液，121 ℃、20 min超高壓滅菌，后置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 供試菌液制備

將置于-80 ℃的菌株解凍后于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h。將活化好的菌液劃線于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃24 h 靜置培養(yǎng)。挑取純化后的單個(gè)菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h，作為原菌液。用滅菌生理鹽水將金黃色葡萄球菌菌液濃度調(diào)節(jié)至1×106CFU/ml，大腸桿菌菌液濃度調(diào)節(jié)至1×105CFU/ml，作為供試菌液，備用。

1.3.3 牛津杯法體外測(cè)定抑菌活性

將制備好的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的供試菌液移取0.1 ml于制備好的營養(yǎng)瓊脂平板上，用無菌涂布棒將菌液涂勻，待其干燥后，用鑷子將滅菌后的牛津杯放置于平板中，輕輕加壓使其與培養(yǎng)基無縫接觸，每個(gè)平板放置4個(gè)牛津杯，將其中3個(gè)牛津杯中加入相同的復(fù)合植物水提物作為試驗(yàn)組，另一個(gè)牛津杯中加入等體積的營養(yǎng)肉湯作為陰性對(duì)照，同時(shí)使用諾氟沙星作為陽性對(duì)照。將平板置于37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h，按十字交叉法使用游標(biāo)卡尺測(cè)量其抑菌直徑，判斷抑菌效果。

判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌效果判定標(biāo)準(zhǔn)均按《中藥藥理學(xué)》標(biāo)準(zhǔn)，即：抑菌直徑≥20 mm 為極敏，15～19 mm 為高敏，10～14 mm為中敏，10 mm以下為低敏。

1.3.4 最小抑菌濃度（MIC）值的測(cè)定

采用二倍稀釋法進(jìn)行最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定，取10支滅菌后的試管，分別將其中加入2 ml營養(yǎng)肉湯，在第一支試管中加入配置好的濃度為1 g/ml復(fù)合植物水提物溶液制成水提物終濃度為500 mg/ml的培養(yǎng)液，均勻混合，吸取2 ml移入2號(hào)試管中，以此類推，稀釋至第8 號(hào)試管，充分搖勻之后棄去2 ml。水提物濃度依次為500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91 mg/ml。第9支為陽性對(duì)照，第10支為空白對(duì)照。在1～9號(hào)試管中分別加入制備好的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌供試菌液50 μl，每種藥物做3個(gè)重復(fù)，37 ℃振蕩培養(yǎng)18～24 h。觀察并且記錄細(xì)菌生長(zhǎng)結(jié)果，將試管內(nèi)液體清澈明亮的濃度視為最小抑菌濃度。

1.3.5 最小殺菌濃度（MBC）值的測(cè)定

在MIC 值的基礎(chǔ)上，吸取澄清透亮試管內(nèi)的培養(yǎng)液50 μl 均勻涂抹于營養(yǎng)瓊脂平板上，每個(gè)濃度重復(fù)3 次。37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，以殺滅99.9%數(shù)量級(jí)細(xì)菌(或活菌數(shù)≤5 個(gè))的最小濃度視為最小殺菌濃度（MBC）[6]。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合植物水提物體外抑菌效果

不同復(fù)合植物水提物對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出不同的抑制效果，對(duì)大腸桿菌的抑制效果不明顯（見表1）。

圖1 不同復(fù)合植物水提物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果

圖2 不同復(fù)合植物水提物對(duì)大腸桿菌的抑制效果

由表1、圖1、圖2 可知，金黃色葡萄球菌對(duì)復(fù)合植物水提物表現(xiàn)出高敏和中敏性，其中對(duì)金銀花+蒲公英+益母草+連翹、連翹+蒲公英、金銀花+蒲公英復(fù)合物高度敏感，抑菌圈直徑分別為(15.70±0.60)、(15.33±0.29)、(15.17±0.76) mm；對(duì)連翹+益母草和金銀花+連翹+益母草復(fù)合物的敏感性相對(duì)較低。大腸桿菌對(duì)復(fù)合物連翹+蒲公英、金銀花+蒲公英+益母草+連翹表現(xiàn)出低敏性，抑菌圈直徑為(9.67±0.58)、(9.30±0.60) mm，對(duì)其他復(fù)合植物水提物表現(xiàn)出耐藥性。

2.2 最小抑菌濃度（MIC）值

采用二倍稀釋法測(cè)定不同復(fù)合植物水提物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度結(jié)果見表2、表3。

表2 不同復(fù)合植物水提物對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC和MBC

表3 不同復(fù)合植物水提物對(duì)大腸桿菌的MIC和MBC

由表2可知，不同的復(fù)合植物水提物對(duì)奶牛乳房炎主要致病菌金黃色葡萄球菌均有一定的抑制作用，其中復(fù)合物金銀花+蒲公英+益母草+連翹對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果明顯，將1 g/ml的復(fù)合植物水提物稀釋256倍添加至培養(yǎng)液中，18 h之后培養(yǎng)液依然澄清透明，即有抑菌效果，MIC值為3.91 mg/ml，經(jīng)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)之后得出MBC值均為3.91 mg/ml；其次復(fù)合物金銀花+連翹+益母草、金銀花+連翹+蒲公英、蒲公英+金銀花+益母草、金銀花+蒲公英對(duì)金黃色葡萄球菌較為敏感，稀釋256 倍時(shí)出現(xiàn)混濁，MBC值均為7.81 mg/ml。復(fù)合植物水提物連翹+益母草、蒲公英+益母草對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果相對(duì)較弱，稀釋16倍時(shí)培養(yǎng)液出現(xiàn)渾濁，即為有菌生長(zhǎng)，MIC值均為125 mg/ml，經(jīng)營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)之后得出MBC值為125 mg/ml。

由表3可知，不同的復(fù)合植物水提物對(duì)奶牛乳房炎致病菌大腸桿菌存在一定的抑制效果，其中復(fù)合物連翹+益母草+蒲公英、連翹+蒲公英、金銀花+蒲公英+益母草+連翹對(duì)大腸桿菌的抑制效果相對(duì)較為明顯，將1 g/ml 的復(fù)合植物水提物稀釋8 倍添加至培養(yǎng)液中，培養(yǎng)18 h 后，培養(yǎng)液澄清透明，視為無菌生長(zhǎng)，MIC 值均為125 mg/ml，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)24 h 后無活菌存在，得出MBC 值均為125 mg/ml；復(fù)合物金銀花+連翹+益母草、金銀花+連翹+蒲公英、金銀花+益母草對(duì)大腸桿菌對(duì)的抑制相對(duì)不明顯，MIC 值均大于500 mg/ml，經(jīng)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基劃線之后得出MBC值均大于500 mg/ml。

3 討論

抗生素是目前治療奶牛乳房炎最普遍的藥物，但是長(zhǎng)期大量使用抗生素會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的耐藥問題，導(dǎo)致乳房炎治愈率下降為奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[7]。植物水提物具有抑菌、消炎、抗氧化、不產(chǎn)生耐藥性等功效，因此采用植物水提物預(yù)防和治療奶牛乳房炎成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)[8]。試驗(yàn)通過對(duì)不同復(fù)合植物水提物對(duì)奶牛乳房炎主要病原微生物金黃色葡萄球菌和大腸桿菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，同時(shí)以普通營養(yǎng)肉湯作為陰性對(duì)照，諾氟沙星作為陽性對(duì)照，確保試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。研究結(jié)果顯示不同成分的復(fù)合物對(duì)不同病原微生物的抑制效果存在差異性。

3.1 牛津杯法測(cè)定抑菌活性

試驗(yàn)采用牛津杯法測(cè)定不同復(fù)合植物水提物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌進(jìn)行體外抑菌效果的研究，結(jié)果顯示，復(fù)合物金銀花+蒲公英+益母草+連翹、連翹+蒲公英、金銀花+蒲公英對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果相對(duì)較好，復(fù)合物蒲公英+金銀花+益母草、金銀花+連翹、金銀花+益母草抑菌效果次之，復(fù)合物連翹+益母草+蒲公英、金銀花+連翹+蒲公英、蒲公英+益母草、金銀花+連翹+益母草效果一般，復(fù)合物連翹+益母草相對(duì)于其他復(fù)合物而言對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制最低；復(fù)合物金銀花+蒲公英+益母草+連翹、連翹+蒲公英對(duì)大腸桿菌具有一定的抑制效果，而其他復(fù)合物對(duì)其抑制效果相對(duì)不明顯。從以上結(jié)果分析可得，對(duì)兩種主要病原微生物抑制效果較好的復(fù)合物中都存在蒲公英。研究報(bào)道，蒲公英具有抗病毒、抗腫瘤、降血脂等功能，特別是抗菌和抗炎作用[9]。金銀花性寒具有清熱解毒、抗炎抑菌以及治療猩熱等作用。連翹中的連翹苷脂和連翹酚對(duì)金黃色葡萄球菌具有很好的抑制作用[10]。因此，理論上將以上幾種植物水提物作為抑制奶牛乳房炎病原微生物的首選藥物。孟靜思等[11]研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都具有一定的抑制作用，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。曹文斌等[12]研究表明，具有清熱解毒類的連翹、金銀花、蒲公英的復(fù)合物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有一定的抑制效果?；艏验猍13]研究得出，蒲公英提取物可以有效的抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，并且能降低生物膜的形成和促進(jìn)成熟生物膜的消除進(jìn)一步減少耐藥性的產(chǎn)生。此外，蒲公英還可以減少促炎因子的表達(dá)抑制核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB、腫瘤壞死因子(TNF)-α和白介素(IL)-1β，以及減少誘導(dǎo)型一氧化氮合酶/一氧化氮(iNOS/NO)和環(huán)氧合酶2/前列腺素E2(COX)的表達(dá)和產(chǎn)生，進(jìn)一步抑制奶牛乳房炎的發(fā)生[14-16]。國內(nèi)外很多學(xué)者關(guān)于植物水提物的抑菌作用做了大量研究但是結(jié)果不盡相同，可能是由于植物水提物的提取工藝不同，操作者熟練程度不同，以及采用不同的藥敏試驗(yàn)方法，但是總體的敏感性區(qū)間大致相同，能夠?yàn)橹参锼嵛镏委熀皖A(yù)防奶牛乳房炎提供一定的參考價(jià)值。

3.2 二倍稀釋法測(cè)定MIC和MBC值

采用二倍稀釋法測(cè)定復(fù)合植物水提物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC 和MBC 值，可以較為直觀和準(zhǔn)確的判斷出不同的復(fù)合物對(duì)其的敏感性。試驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)合物金銀花+蒲公英+益母草+連翹對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果相對(duì)明顯，MBC 值為3.91 mg/ml，復(fù)合物金銀花+連翹+益母草、金銀花+連翹+蒲公英、蒲公英+金銀花+益母草、金銀花+蒲公英對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果次之，MBC 值均為7.81 mg/ml，復(fù)合物連翹+益母草、蒲公英+益母草對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果相對(duì)較弱，MBC 值均為125 mg/ml；復(fù)合物連翹+益母草+蒲公英、連翹+蒲公英、金銀花+蒲公英+益母草+連翹對(duì)大腸桿菌的抑制效果相對(duì)較為明顯，MBC值均為125 mg/ml，復(fù)合物金銀花+連翹+益母草、金銀花+連翹+蒲公英、金銀花+益母草對(duì)大腸桿菌對(duì)的抑制不明顯，MBC 值均大于500 mg/ml。根據(jù)以上結(jié)果分析可知，復(fù)合植物水提物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果優(yōu)于大腸桿菌，可能是由于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)不同，藥物的穿透力存在差異性導(dǎo)致抑制效果出現(xiàn)明顯的區(qū)別。此外，研究結(jié)果表明含有蒲公英和金銀花的復(fù)合物抑菌效果較為明顯，可能是由于二者本身富含有豐富的黃酮類、精油、生物堿、有機(jī)酸等活性成分可以很好地發(fā)揮抑菌作用；但是也存在金銀花與蒲公英和其他植物水提物同時(shí)存在的情況下抑菌效果出現(xiàn)降低的情況，可能是由于不同植物水提物混合之后發(fā)生相互作用，導(dǎo)致活性成分的功效下降，不能有效的發(fā)揮抑菌作用。本試驗(yàn)采用牛津杯和二倍稀釋法兩種方法測(cè)定復(fù)合植物水提物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制效果，結(jié)果有相似性但也存在一定的差異性，可能是由于牛津杯中藥物不能完全滲透于培養(yǎng)基中，不能很好的起到抑菌作用；而二倍稀釋法可以很好的將復(fù)合植物水提物與培養(yǎng)液以及菌液大面積接觸，使藥物能夠充分的發(fā)揮其藥效，因此出現(xiàn)較為明顯的抑菌效果。

4 結(jié)論

不同的復(fù)合植物水提物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制效果存在差異性，其中含有蒲公英或金銀花的復(fù)合物抑菌效果較為明顯；11種復(fù)合植物水提物中金銀花+蒲公英+益母草+連翹的抑菌效果最好；復(fù)合植物水提物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果相對(duì)于大腸桿菌更為明顯。