甘蓼復合微生態(tài)制劑對凡納濱對蝦生長性能及其相關酶活性的影響

■匡 娜 朱 瑜 謝小東 覃志彪 施 君 于美玲胡庭俊 韋英益

（廣西大學動物科學技術學院，廣西南寧530005）

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei），屬于節(jié)肢動物門（Arthropoda）甲殼動物亞門（Crustacea）軟甲綱（Malacostraca）十足目（Decapoda）對蝦科（Penaeidae）濱對蝦屬（Litopenaeus），原產地為中南美洲，因此又被稱為“南美白對蝦”[1]。凡納濱對蝦是世界第一養(yǎng)殖蝦類，約占全球對蝦養(yǎng)殖產量70%，占我國對蝦養(yǎng)殖產量80%～90%，目前我國凡納濱對蝦種苗生產量已超過7 000億尾[2]。由于養(yǎng)殖規(guī)?；陌l(fā)展和集約化養(yǎng)殖模式的擴大，凡納濱對蝦病害流行日益加劇，給對蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來了較大的經濟損失。此外，市場上化學藥物和抗生素的濫用，不僅導致病原菌耐藥性，還會對養(yǎng)殖環(huán)境造成污染和破壞，給食品安全帶來巨大的安全隱患。因此，尋求或開發(fā)高效、低毒、純天然的復方微生態(tài)制劑，是目前水產養(yǎng)殖中亟待解決的問題。

我國中草藥在水產養(yǎng)殖中的應用較為廣泛，與其他藥物相比，其具有利用率高、預防效果好、無毒、環(huán)境友好、成本低[3]等特點，因此研發(fā)有效的中草藥來預防和治療對蝦疾病，促進對蝦養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展是近年來的研究熱點。中草藥復合微生態(tài)制劑作為一種促生長飼料添加劑或藥物，不僅可以避免藥物殘留和耐藥性等問題，還能調整水體生態(tài)環(huán)境的菌群，顯著提升水產養(yǎng)殖產量。有研究報道，中草藥和益生菌聯合使用能促進養(yǎng)殖動物生長，增強機體免疫功能及抗病力等[4-6]。因此，復合微生態(tài)制劑的研究與開發(fā)在水產養(yǎng)殖應用中具有良好的前景[7-9]。本試驗旨在以辣蓼、甘草、甘露寡糖（MOS）、地衣芽孢桿菌等為主要成分的復合微生態(tài)制劑對凡納濱對蝦的生長性能和相關酶活性的影響研究，探討其作用與效果，以期為中草藥復合微生態(tài)制劑在對蝦養(yǎng)殖業(yè)中的推廣應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑

甘草（飲片）和辣蓼（全草），購于廣西玉林中藥市場；甘露寡糖（含量99.2%），購于河南貴之恒食品添加劑有限公司；基礎飼料為海大牌2 號料；恩諾沙星（浙江國邦藥業(yè)有限公司）；益菌多（廣西正格農牧科技有限公司）；地衣芽孢桿菌（活菌數1011個/g以上，購于山東中科嘉億生物工程有限公司），地衣芽孢桿菌菌種由本實驗室保存；酸性磷酸酶測試盒（ACP）、總抗氧化能力測試盒（T-AOC）、谷胱甘肽測試盒（GSH）、一氧化氮合酶測試盒（iNOS）、酚氧化酶測試盒（PO）均購自南京建成生物工程研究所；左旋多巴（L-DOPA）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗動物

540尾凡納濱對蝦購于廣西防城港市凡納濱對蝦種蝦基地。

1.3 甘蓼復合制劑的制備

1 g/ml 甘草提取液：稱取30 g 甘草，按照料液比1∶12 加入360 ml 雙蒸水，浸泡半小時，武火煮沸后調至文火煎煮1 h。200目紗布過濾水煎液，濾渣再次加入360 ml雙蒸水，重復前述煎煮步驟，水煎煮共3次。合并濾液，濃縮至30 ml，即得到生藥含量為1 g/ml甘草提取液，放置4 ℃保存。

1 g/ml 辣蓼提取液：將曬干的辣蓼全草粉碎為粗粉備用。參照本實驗室先前研究，稱取30 g 辣蓼粗粉，按照料液比1∶30 加入900 ml 雙蒸水，浸泡半小時，武火煮沸后調至文火煎煮1 h。200目紗布過濾水煎液，濾渣再次加入900 ml 雙蒸水，重復前述煎煮步驟，水煎煮共3 次。合并濾液，濃縮至30 ml，即得到生藥含量為1 g/ml辣蓼提取液，放置4 ℃保存。

甘蓼復合制劑的組成：2%甘露寡糖、1%辣蓼、0.1%甘草、地衣芽孢桿菌（106cfu/ml）按比例配比制備。

1.4 試驗分組

試驗設置6 個組即對照組和5 個試驗組，每組3個重復。將凡納濱對蝦放置于200 L 塑料箱內，盛水1/2，每組90 尾，經暫養(yǎng)穩(wěn)定后，分別投喂添加0.5%、1%、2%的甘蓼復合微生態(tài)制劑的基礎飼料，空白對照組飼喂基礎飼料，益生菌組飼喂添加市售產品益菌多的基礎飼料，抗生素組飼喂添加恩諾沙星的基礎飼料。

1.5 飼養(yǎng)管理

定時投喂（8：00、13：00、18：00），投喂量為蝦體重的5%～8%，根據攝食情況具體調整。試驗周期為3周，每天清污，兩天換水1 次，換水30%左右，水溫28 ℃，24 h充氧，養(yǎng)殖用水為鹵水配置，鹽度為25.0‰，自然光周期，對蝦適應環(huán)境一周后，開始試驗。

1.6 樣品采集和檢測指標

試驗至第14 d 和21 d 對各組蝦進行采樣，測定凡納濱對蝦體重、血清酚氧化酶（PO）、肝胰臟相關酶活性等。

1.6.1 血液采集

抽血前用一次性無菌注射器預先抽取0.2 ml 預冷的抗凝劑（100 mmol/l 葡萄糖、30 mmol/l 檸檬酸三鈉、26 mmol/l檸檬酸、510 mmol/l氯化鈉、10 mmol/l乙二胺四乙酸二鈉），酒精消毒后，從腹血竇抽血至1.5 ml 滅菌EP 管內，每組抽血完畢后，抗凝劑補足體積至與血液體積比為1∶1，然后1 500 r/min、4 ℃、離心10 min，取上清液低溫（4 ℃）保存待測。

1.6.2 肝臟采集及處理

每尾蝦在無菌環(huán)境下，剖取整個肝臟，置于無菌離心管（15 ml）加入9倍體積的預冷生理鹽水，冰水浴中研磨，用冷凍離心機于4 ℃、1 500 r/min離心10 min，吸取上清進行分裝，保存在-80 ℃，用于測定相關酶活性。

1.6.3 生長指標測定

養(yǎng)殖試驗結束后，將試驗蝦饑餓24 h 后進行采樣，測定每個養(yǎng)殖箱中試驗蝦總質量，記錄蝦尾數，測量所有試驗蝦個體體質量，用以計算增重率、特定生長率指標參數。

增重率(WGR，%)=(Wt-W0)/W0×100

特定生長率(SGR，%/d)=(LnWt-LnW0)/t×100

式中：Wt、W0——分別為終末均重和初始均重（g）；

t——試驗天數（d）。

1.6.4 非特異性免疫指標測定

于養(yǎng)殖第14 d與21 d時分別采樣測定。血清酚氧化酶（PO）測定以左旋多巴（L-dopa）為底物，參照Ashida[10]的方法做適當修改后進行。室溫下，96 T 板內，依次加入100 μl 的磷酸鉀鹽緩沖液（0.1 mol/l，pH 值6）和100 μl 的L-DOPA（0.01 mol/l 水溶液），再加入100 μl血清。28 ℃，測OD490，每2 min測一次，測10次，每分鐘變化0.001為一個酶活性單位。

總抗氧化能力（T-AOC）、酸性磷酸酶（ACP）活性、一氧化氮合酶（iNOS）活性、谷胱甘肽（GSH）含量均采用試劑盒并嚴格按照說明書方法測定，以考馬斯亮藍法蛋白定量。

1.7 數據統(tǒng)計與分析

試驗所得數據采用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計分析。試驗數據以“平均值±標準差（Mean±SD）”表示。

2 結果

2.1 甘蓼復合微生態(tài)制劑對凡納濱對蝦生長的影響(見表1)

表1 凡納濱對蝦生長性能

由表1 結果可知，各試驗組凡納濱對蝦在21 d養(yǎng)殖試驗結束時，平均體重均有所上升，其中低劑量組的增重率和特定生長率較高。表明，一定濃度的甘蓼復合微生態(tài)制劑具有促進對蝦生長的作用。

2.2 甘蓼復合微生態(tài)制劑對凡納濱對蝦相關酶活性的影響

各試驗組凡納濱對蝦在養(yǎng)殖14 d和21 d的免疫酶活性如表2、表3所示。在試驗14 d時，高劑量組和益生菌組對蝦iNOS活性均顯著高于空白組（P＜0.05），試驗21 d時，低劑量組對蝦iNOS活性與空白對照組相比顯著升高（P＜0.05），其余組與空白組相比差異不顯著（P＞0.05），中劑量組、高劑量組、益生菌組和抗生素組對蝦iNOS 活性無顯著差異（P＞0.05），在養(yǎng)殖14 d、21 d時，中劑量組對蝦T-AOC水平均顯著高于空白對照組（P＜0.05），而益生菌組則顯著低于空白對照組（P＜0.05）。其余各組對蝦T-AOC水平在兩個時期與空白組差異均不顯著（P＞0.05）。在養(yǎng)殖14 d、21 d時，抗生素組對蝦ACP活性顯著低于空白組（P＜0.05），其余各試驗組與空白對照組無顯著差異（P＞0.05）。各試驗組對蝦GSH水平在養(yǎng)殖14 d與21 d時，與空白組相比均無顯著差異（P＞0.05）。在養(yǎng)殖14 d時，各試驗組PO活性與空白組相比無顯著差異（P＞0.05），養(yǎng)殖21 d時，中劑量組對蝦的PO活性顯著高于空白對照組（P＜0.05），其余各組與空白組無顯著差異（P＞0.05）。

表2 甘蓼復合微生態(tài)制劑對凡納濱對蝦相關酶活性的影響（試驗14 d）

表3 甘蓼復合微生態(tài)制劑對凡納濱對蝦相關酶活性的影響（試驗21 d）

3 討論

3.1 甘蓼復合微生態(tài)制劑對凡納濱對蝦生長性能的影響

動物的生長受自身因素和外周因素影響，自身因素如種類、發(fā)育階段和生理狀態(tài)等，外在因素主要為環(huán)境因素，水生動物對環(huán)境因素變化更為敏感[11]。本研究在凡納濱對蝦的基礎飼料中添加不同劑量的甘蓼復合微生態(tài)制劑，均能促進凡納濱對蝦的平均體重，其中添加0.5%甘蓼復合微生態(tài)制劑對凡納濱對蝦的生長最有利。結果與郭慧等[9]在飼料中添加濃度為0.2%的水解單寧對凡納濱對蝦的研究結果相似，其增重率、特定增長率和肥滿度與0.1%添加組相比均有下降趨勢。

3.2 甘蓼復合微生態(tài)制劑對凡納濱對蝦相關酶活性的影響

凡納濱對蝦為低等甲殼動物，其主要通過非特異性免疫系統(tǒng)起防御作用。對蝦體液免疫系統(tǒng)包括酚氧化酶原激活系統(tǒng)、活性氧和活性氮生成系統(tǒng)等。PO是反映機體抗氧化、氧化機體有害物質能力的酶，在對蝦免疫系統(tǒng)中具有重要作用[12]。本試驗結果顯示，連續(xù)飼喂21 d 添加1%甘蓼復合制劑能顯著提高凡納濱對蝦血液中PO活性。李軍濤等[13]研究發(fā)現隨著杜仲葉提取物添加量的增加，對蝦血清PO 活性呈先增加后降低的變化趨勢，以0.3 g/kg組的PO活性最高，達3.77 U/mg。ACP是巨噬細胞溶酶體的標志酶，能夠水解病原菌細胞表面的磷酸酯，從而發(fā)揮免疫功能[14]。本試驗中，連續(xù)21 d在飼料中添加0.5%甘蓼復合制劑使對蝦血液中ACP活性高于同期空白組，且各試驗組ACP 活性在試驗后期高于前期，這與王明華等[15]、郝凱[16]的研究趨勢是一致的。

總抗氧化能力（T-AOC）常被用于綜合評價機體總抗氧化系統(tǒng)功能狀態(tài)。本試驗中添加1%甘蓼復合制劑，連續(xù)飼喂21 d，對蝦肝胰腺內T-AOC 水平顯著高于同期空白對照組。胡俊茹等[17]研究發(fā)現黑水虻幼蟲粉替代飼料中15%～20%的魚粉可顯著增強凡納濱對蝦幼蝦血清中抗氧化酶的活性，進而提高機體的抗氧化能力。GSH 是水生無脊椎動物體內重要的非酶性抗氧化物，在機體清除氧自由基時發(fā)揮關鍵作用[18]。但本試驗結果顯示，在基礎飼料中添加試驗劑量范圍內的甘蓼復合制劑，不會抑制對蝦機體通過GSH 發(fā)揮抗氧化的作用。其原因可能與諸多因素有關，袁宏利等[19]發(fā)現氨氮脅迫會誘導黃河鯉幼魚肝組織中還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量升高，影響水生動物體內的GSH含量變化。在養(yǎng)殖前期，基礎飼料中添加2%甘蓼復合制劑顯著提高對蝦的iNOS活性，但在養(yǎng)殖后期，添加0.5%甘蓼復合制劑能顯著提高對蝦的iNOS活性。也許是因為在飼養(yǎng)早期階段，甘蓼復合制劑的有效成分在對蝦體內積累較少，故添加量較高的試驗組表現出較明顯的免疫效果。隨著飼養(yǎng)時間的增長，添加量較少的試驗組其有效成分在對蝦體內積累到一定量時，發(fā)揮出明顯促進效果，而添加量較高的試驗組由于對蝦體內過多的有效成分反而起抑制效果，其免疫性能相對于添加量少的組有所下降。

益生菌、益生元與中草藥的復配應用因具有促進養(yǎng)殖動物生長、增強機體免疫功能及抗病力等功效，廣泛應用于水產養(yǎng)殖業(yè)。湯菊芬等[20]將中草藥與益生菌復配使用，有效提高了吉富羅非魚的生長性能及抗病力。文國樑等[21]、于明超等[22]的研究顯示，芽孢桿菌作為益生菌與中草藥復配作為飼料添加劑，可有效提高南美白對蝦的免疫相關酶活性，且效果優(yōu)于單一使用組。本研究發(fā)現甘蓼復合制劑對南美白對蝦各免疫指標具有不同程度的積極作用且效果在部分免疫指標方面優(yōu)于同期使用抗生素、市售益生菌組。甘蓼復合制劑在養(yǎng)殖的不同時間階段作用也有所不同，這可能是由于其成分種類多，包括寡糖、兩味中草藥以及地衣芽孢桿菌。

4 小結

飼料中添加適量甘蓼復合微生態(tài)制劑能提高凡納濱對蝦的生長性能，增強機體的非特異性免疫功能，對其抗病力具有積極作用，該研究結果能夠為凡納濱對蝦健康生態(tài)養(yǎng)殖的臨床應用提供理論依據，并具有重要的意義。