改進(jìn)高效液相色譜法 快速準(zhǔn)確地測(cè)定辣椒粉中蘇丹紅含量

蘇丹紅又名蘇丹，是一種人工合成的化工染料，主要用于油彩、機(jī)油、蠟和鞋油等產(chǎn)品的染色。蘇丹紅是親脂性偶氮化合物，主要有蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ四種物質(zhì)。毒理學(xué)研究表明，蘇丹紅具有致突變性和致癌性，我國(guó)已經(jīng)禁止在食品中使用。由于使用蘇丹紅染色的食品顏色非常鮮艷且不易褪色，一些不法食品生產(chǎn)者把蘇丹紅添加到食品中，常見(jiàn)的可能非法添加蘇丹紅的食品有辣椒粉、辣椒油、紅心禽蛋等。

現(xiàn)階段，食品中蘇丹紅含量的測(cè)定主要使用GB/T？19681-2005《食品中蘇丹紅染料的檢測(cè)方法？高效液相色譜法》，但由于其使用的中性氧化鋁需要進(jìn)行復(fù)雜的活度調(diào)節(jié)和活性測(cè)試，使得實(shí)驗(yàn)過(guò)程繁瑣且耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)檢驗(yàn)人員自身的實(shí)操經(jīng)驗(yàn)有一定要求。本文旨在使用一種蘇丹紅專用的固相萃取小柱，開發(fā)辣椒粉中蘇丹紅含量測(cè)定的高效液相色譜分析方法。樣品經(jīng)正己烷提取，提取液濃縮后經(jīng)專用的蘇丹紅固相萃取小柱凈化，乙腈定容后上機(jī)分析。C18色譜柱，乙腈和水梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)478nm、520nm。實(shí)驗(yàn)證明，四種蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，具有較好的回收率和精密度。

一、實(shí)驗(yàn)部分

1.儀器、試劑和耗材。Waters高效液相色譜儀（e2695）：配PDA檢測(cè)器，梅特勒電子天平（ME403），昆山超聲波清洗器（KQ-500DE），步琦旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R-300），IKA渦旋混勻器（天才3）；蘇丹紅Ⅰ（100μg/mL）、蘇丹紅Ⅱ（1000μg/ mL）、蘇丹紅Ⅲ（100μg/mL）、蘇丹紅Ⅳ（1000μg/mL）標(biāo)準(zhǔn)溶液均購(gòu)自壇墨質(zhì)檢；乙腈、正己烷、二氯甲烷均為色譜純?cè)噭?；?shí)驗(yàn)用水為GB/ T？6682-2008規(guī)定的一級(jí)水；安譜蘇丹紅專用固相萃取小柱：500mg/6mL（活化方法：依次用5mL二氯甲烷和5mL正己烷活化小柱）。

2.色譜條件。液相色譜柱：TechMate？ C18色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈和水梯度洗脫（0-2min：乙腈85%+水15%；2-6min：乙腈95%+水5%；6-15min：乙腈95%+水5%；15-17min：乙腈85%+水15%；17-25min：乙腈85%+水15%）；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：478nm、520nm。采用色譜峰的保留時(shí)間定性，外標(biāo)峰面積法定量。

3.標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。取蘇丹紅Ⅰ（100μg/mL）和蘇丹紅Ⅲ（100μg/mL）各1.0mL，蘇丹紅Ⅱ（1000μg/mL）和蘇丹紅Ⅳ（1000μg/mL）各0.10mL于10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度混勻，得到濃度為10μg/mL的四種蘇丹紅混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確移取不同體積的上述四種蘇丹紅混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈稀釋配制成一系列的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

4.樣品處理。稱取1g辣椒粉樣品（精確至0.001g）于15mL離心管中，加入10mL正己烷，超聲5min，過(guò)濾。用10mL正己烷洗掉殘?jiān)鼣?shù)次，至洗出液無(wú)色，合并正己烷液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5mL。濃縮液上固相萃取小柱，用2mL正己烷洗滌濃縮瓶，洗滌液也一并上樣到小柱上。用5mL正己烷淋洗小柱，5mL二氯甲烷洗脫小柱。洗脫液在40℃下氮?dú)獯蹈桑?.0mL乙腈定容，超聲1min，漩渦混合10s，過(guò)0.45μm一次性有機(jī)濾器后上機(jī)測(cè)定。

二、結(jié)果與討論

1.樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化。蘇丹紅是一種親脂性的化合物，使用正己烷作為樣品中蘇丹紅的提取溶液并配合超聲波萃取，可以很好地提取辣椒粉樣品中的蘇丹紅。實(shí)驗(yàn)采用蘇丹紅專用的固相萃取小柱，方法簡(jiǎn)單快速，不需要對(duì)中性氧化鋁進(jìn)行復(fù)雜的活度調(diào)節(jié)和活性測(cè)試，整個(gè)前處理時(shí)間不超過(guò)1h；溶劑消耗少，國(guó)標(biāo)GB/T？19681-2005使用60mL的丙酮正己烷溶液進(jìn)行洗脫，本方法只用5mL二氯甲烷進(jìn)行洗脫，不僅節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本，還減少了有機(jī)試劑對(duì)環(huán)境的污染。

2.色譜條件的優(yōu)化。（1）檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇：經(jīng)PDA檢測(cè)器全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)蘇丹紅Ⅰ的最大吸收波長(zhǎng)為478nm，蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ的最大吸收波長(zhǎng)均在520nm左右，因此PDA的檢測(cè)波長(zhǎng)確定為478nm和520nm。（2）流動(dòng)相的選擇：由于辣椒中含有大量色素等內(nèi)源性干擾物質(zhì)，基質(zhì)成分極其復(fù)雜。使用高比例乙腈和低比例水相，雖然可以提高檢測(cè)效率，但是這樣的洗脫條件會(huì)造成目標(biāo)物質(zhì)和雜質(zhì)共同流出的情況。因此，為避免雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)分析物的干擾，實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了流動(dòng)相洗脫條件，使用乙腈和水的梯度洗脫程序。

3.標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限。將配制好的系列蘇丹紅混合標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)分析，以峰面積對(duì)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ的線性相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.999以上，檢出限均為0.01mg/kg。詳見(jiàn)表1。

4.回收率與精密度。取市售的辣椒粉樣品，加入蘇丹紅混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，與辣椒粉樣品進(jìn)行相同的前處理步驟，平行測(cè)定五次，計(jì)算方法的回收率和精密度。詳見(jiàn)表2。

辣椒粉樣品采用專用的蘇丹紅固相萃取小柱凈化，高效液相色譜法進(jìn)行分離和測(cè)定。方法前處理步驟簡(jiǎn)便、快速，節(jié)省溶劑，重現(xiàn)性好，有較好的回收率，非常適合辣椒粉中蘇丹紅含量的測(cè)定。

作者簡(jiǎn)介：侯冰（1983-），女，籍貫：遼寧撫順，民族：漢族，職稱：高級(jí)工程師，學(xué)歷：研究生，研究方向：食品檢驗(yàn)。