降解黃曲霉毒素B1土曲霉發(fā)酵工藝優(yōu)化的研究

寧夢鴿，謝巖黎?，孫淑敏，馬衛(wèi)賓，李 倩，衛(wèi) 敏，何保山，任文潔

（河南工業(yè)大學 糧油食品學院，河南省糧油食品安全檢測與控制重點實驗室，河南 鄭州 450001）

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是一組由黃曲霉（Aspergillusflavus）和寄生曲霉（A.nomius、A.parasiticus、A.tamarii）等多種真菌經(jīng)過聚酮作用途徑產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，且包含多種衍生物，目前已分離鑒定出 20余種，主要有黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q1、H1、黃曲霉毒醇等。使用波長為365 nm的紫外光照射AFT時，AFB發(fā)出藍色（Blue）熒光，AFG發(fā)出綠色（Green）熒光，AFM是AFB在動物肝臟內(nèi)經(jīng)過羥化而衍生的代謝產(chǎn)物，分泌到乳汁（Milk）中，故而得名[4-6]。其中黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）毒性最強、分布范圍最廣且化學性質(zhì)最穩(wěn)定，雙呋喃環(huán)上雙鍵極易與 DNA 和 RNA結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)的合成，從而抑制免疫機能，也是致畸致癌致突變的主要功能基團[7-8]。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)和IARC人類致癌風險評價工作組分別將AFB1認定IA級危險物和Ⅰ類致癌物，對人和動物具有強烈的致癌性、致毒性、致突變性、抑制免疫力、肝損傷等毒害作用[9-10]。

前期研究發(fā)現(xiàn)實驗室保存的菌株土曲霉（Aspergillusterreus）HNGD-TM15具有降解AFB1的能力，通過優(yōu)化發(fā)酵工藝，可提高其降解AFB1的能力，主要包括培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件。培養(yǎng)基種類：牛肉膏蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基；培養(yǎng)基成分：碳源、氮源；發(fā)酵條件：接種量、裝液量、起始pH、溫度，并更好地了解其降解特性和分析降解機理。在單因素實驗基礎(chǔ)上，運用Box-Behnken的中心組合實驗設(shè)計原理，采用響應(yīng)面設(shè)計，對HNGD-TM15發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以獲得最佳發(fā)酵參數(shù)，提高菌株HNGD-TM15降解AFB1的能力。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株土曲霉 HNGD-TM15（Aspergillusterreus）：實驗室保存。

AFB1標準品：美國Sigma公司；甲醇、乙腈：色譜級，天津市四友精細化學品有限公司。

Agilent 1260高效液相色譜儀：美國Agilent公司。

種子培養(yǎng)基（L–1）：3 g牛肉膏，10 g蛋白胨，5 g NaCl，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基1（L–1）：3 g牛肉膏，10 g蛋白胨，6 g葡萄糖，5 g NaCl，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基 2（馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，簡稱PDB）（L–1）：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，pH 自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基3（L–1）：20 g葡萄糖，10 g蛋白胨，pH自然。

1.2 方法

1.2.1 AFB1檢測

AFB1檢測方法參考文獻[11-12]。反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)體系1 mL于15 mL離心管中，加入3 mL的二氯甲烷渦旋震蕩萃取60 s，將水層取出棄去，將二氯甲烷層置于氮吹儀中，35 ℃下氮氣緩慢吹干，用0.5 mL流動相（水：甲醇：乙腈=6∶2∶2）溶解殘余物（濃縮一倍），渦旋震蕩60 s，0.22 μm有機相濾膜過濾，混勻進樣。

液相色譜條件如下：色譜柱為 Agilent Proshell120（4.6 μm×150 mm，4 μm），流動相為水∶乙腈∶甲醇=60∶20∶20（V/V/V），柱溫30 ℃，流速1 mL/min，進樣量：20 μL。檢測器：熒光檢測器，激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm。

AFB1降解率的計算方法如下公式[13-14]：

1.2.2 發(fā)酵工藝的優(yōu)化

1.2.2.1 不同葡萄糖添加量對 AFB1降解率的影響 在前期培養(yǎng)基種類、碳源、氮源、接種量、裝液量、初始pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間等單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上（如圖 1所示）選出對 AFB1降解率影響顯著的因素為碳源、初始pH和發(fā)酵溫度，以下對著三個因素進行詳細描述。首先對最佳碳源葡萄糖的添加量進行優(yōu)化，其添加量梯度設(shè)為：0.3%、0.5%、0.7%、1.0%、1.3%和1.5%。

圖1 不同因素對AFB1降解率的影響

1.2.2.2 不同發(fā)酵溫度對 AFB1降解率的影響溫度設(shè)為 25、30、35、40、45、50 ℃，菌懸液接種量為0.006%，于37 ℃下發(fā)酵72 h，其它條件參照1.2.2。

1.2.2.3 發(fā)酵液不同初始pH對AFB1降解率的影響 發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH值設(shè)為2、3、4、5、6、7、8，菌懸液接種量為0.006%，于37 ℃下發(fā)酵72 h，其它條件參照1.2.2。

1.2.3 發(fā)酵工藝的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，在Design-Expert 8.0軟件中，運用Box-Behnken設(shè)計原理，以葡萄糖（A）、pH（B）和溫度（C）設(shè)計響應(yīng)面實驗，以 AFB1降解率為響應(yīng)值，對發(fā)酵條件進行最優(yōu)化分析，并驗證此條件下的 AFB1降解率，同時反映不同條件間的交互作用。各因素及變量水平見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計的各因素及變量水平Table 1 Various factors and variable levels of response surface design

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵工藝單因素分析

由圖 1可知，在單因素優(yōu)化實驗中，最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為（牛肉膏+蛋白胨）0.3%，發(fā)酵液起始pH為3.0，發(fā)酵溫度為34 ℃，接種量為0.006%的菌懸液，裝液量為100 mL/250 mL，發(fā)酵時間為72 h。以下對三個影響顯著的因素（碳源、pH和發(fā)酵溫度進行單獨描述。首先對最佳碳源葡萄糖添加量進行優(yōu)化。

2.1.1 不同葡萄糖添加量對AFB1降解率的影響

在發(fā)酵過程中，碳源不僅為微生物生長、繁殖、代謝提供所需能量，還可以在一定程度上誘導(dǎo)菌體產(chǎn)酶。在發(fā)酵過程中不同的碳源會影響微生物的生長、酶活性和產(chǎn)酶量，即使同一種碳源不同濃度對菌體形態(tài)和所需產(chǎn)物產(chǎn)量也會有很大影響。所以說碳源的選擇和其用量的確定對微生物發(fā)酵的代謝產(chǎn)物的量的多少有一定的關(guān)系[15]。前期的研究結(jié)果表明對于菌株HNGD- TM15，采用葡萄糖作為碳源時降解率最高，達到96.13%。由圖2可知，當葡萄糖的添加量為0.7%，發(fā)酵液對AFB1的降解率最高，達到了99.19%。

圖2 不同葡萄糖添加量對AFB1降解率的影響

2.1.2 不同發(fā)酵溫度對AFB1降解率的影響

溫度是影響微生物生長繁殖的重要環(huán)境因素之一。溫度通過影響微生物細胞膜的液晶結(jié)構(gòu)、酶和蛋白質(zhì)的合成和活性、RNA結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)錄等影響微生物的生命活動。每種微生物基本上都有一個適應(yīng)溫度范圍，過高或過低的溫度都會對微生物的生長繁殖造成不利的影響。當溫度低于最低生長溫度時，微生物的生長停止。超過了微生物生長的最高溫度會引起細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固，使酶變性失活，代謝停滯而死亡。在發(fā)酵過程中，溫度影響微生物細胞的生長和代謝產(chǎn)物的合成量，因此，需要找出發(fā)酵的最適溫度，不僅能夠促進微生物的生長和繁殖，也能較大程度上促進所需代謝產(chǎn)物的合成[16]。如圖 3所示，HNGDTM15在溫度為 35 ℃時，AFB1降解率最高達到了99.19%。

圖3 不同發(fā)酵溫度對AFB1降解率的影

2.1.3 不同初始pH對AFB1降解率的影響

發(fā)酵過程中酸堿度對微生物的生命活動有很大影響[17]。一般來講，每種微生物的生長都有一個最適生長 pH范圍，不同種類的微生物對環(huán)境pH適應(yīng)的范圍不同，即使同一種微生物在不同的生長階段、不同的生理生化過程中，也有不同的最適pH值要求。pH對微生物生長的影響是多方面的，pH通過引起細胞膜電荷變化、改變營養(yǎng)物離子化程度，來影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。其次，還可以通過改變培養(yǎng)基中有機物的離子化程度，改變某些化合物分子進入細胞的狀態(tài)，從而促進或者抑制微生物的生長。除此之外，pH還對一些生物合成途徑有著顯著影響，因此，對于同一微生物，pH不同，形成的發(fā)酵產(chǎn)物也會不同。如圖4所示，菌株HNGD-TM15在發(fā)酵液起始pH為3時，AFB1降解率最高，達到了99.59%。

圖4 不同初始pH對AFB1降解率的影響

2.2 發(fā)酵工藝響應(yīng)面分析

2.2.1 發(fā)酵工藝響應(yīng)面結(jié)果

在單因素考察的基礎(chǔ)上，以葡萄糖（A）、pH（B）和溫度（C）為自變量，AFB1降解率（R）為響應(yīng)值，響應(yīng)面分析實驗設(shè)置為三因素三水平。應(yīng)用Design-Expert 8.0軟件對表2數(shù)據(jù)進行擬合，回歸方程如下：

Y=99.87+4.09A+0.002 5B+2.28+0.61AB–0.89AC–0.51BC–6.70A2–1.95B2–1.88C2

表2 響應(yīng)面設(shè)計和各實驗結(jié)果Table 2 Response surface design and experimental results

由表3的方差分析結(jié)果可知，模型（P=0.002 8）在1%水平上具有極顯著性，失擬項不顯著（P=0.063 5＞0.05），其R2=0.929 9，R2Adj=0.839 9，說明該模型擬合程度良好，可以模擬 92.99%的 AFB1降解率變化。各因素對降解率的影響順序為B＞A＞C，即pH＞葡萄糖添加量＞溫度。

2.2.2 響應(yīng)面的分析

響應(yīng)面分析是將體系相應(yīng)建立成一個或多個因素的函數(shù)，運用圖形技術(shù)將這種函數(shù)關(guān)系顯示出來，以供憑借直觀的觀察來選擇實驗設(shè)計中的最優(yōu)化條件[18]。根據(jù)回歸方程所得出的響應(yīng)面圖，即可對任何兩因素交互作用進行分析和評價，由圖5可以直觀看出影響因素與響應(yīng)面之間的關(guān)系，即曲線越陡峭，在該因素對 AFB1降解率的影響越大。圖 4a～c反映了各因素交互作用對 AFB1降解率的影響，可以看出因素A（pH）對響應(yīng)值的影響最大，表現(xiàn)為曲線陡峭，因素C（葡萄糖）和因素B（溫度）次之，因素B表現(xiàn)的曲線最為平滑，這與方差分析中的結(jié)果一致。

表3 回歸模型方差分析及顯著性檢驗Table 3 Regression model analysis of variance and significance test

2.2.3 最優(yōu)培養(yǎng)基配方的確定

使用Desgin Expert 8軟件對回歸方程進行分析，得到最佳降解條件為：pH=3.19、溫度為36.51 ℃、葡萄糖為0.71%，預(yù)測菌株HNGD-TM15對AFB1降解率最高可達99.96%，為驗證模型預(yù)測的準確性，在采用上述最佳培養(yǎng)基配方，3次平行實驗得到的實際AFB1降解率分別為99.95%、99.99%、99.89%，平均降解率為99.94%，說明該模型能夠較好地預(yù)測實際情況。

3 結(jié)論

HNGD-TM15降解AFB1發(fā)酵工藝優(yōu)化參數(shù)：碳源為 0.7%，氮源為（牛肉膏+蛋白胨）0.3%，發(fā)酵液起始pH為3.0，發(fā)酵溫度為34 ℃，接種量為0.006%的菌懸液，裝液量為100 mL/250 mL，發(fā)酵時間為72 h。優(yōu)化后AFB1降解率從接種量為 5%的 98.30%提高到接種量為 0.006%的99.94%，優(yōu)化效果明顯。

圖5 各因素交互作用對AFB1降解率的影響的響應(yīng)面圖

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網(wǎng)（http://lyspkj.ijournal.cn/ch/index.axpx）、中國知網(wǎng)、萬方、維普、超星等數(shù)據(jù)庫下載獲取。