miR-93表達(dá)與內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)治療老年早期胃癌預(yù)后的關(guān)系及其靶向抑癌基因的生物信息學(xué)分析*

楊潔，彭志紅，吳宏博

[陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院（重慶西南醫(yī)院）消化內(nèi)科，重慶400038]

胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，隨著胃鏡檢查的普及，早期胃癌的檢出率有所提高，在胃癌局限于黏膜或黏膜下層的早期階段進(jìn)行治療，能夠明顯改善預(yù)后，5年生存率可超過90.0%。內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)（endoscopic submucosal dissection，ESD）是近年發(fā)展起來的治療手段，可以一次性大塊、完整的切除直徑2 cm 以上的黏膜病變，用于早期胃癌的治療能取得組織學(xué)治愈性切除，遠(yuǎn)期療效理想[1]。也有研究[2]報(bào)道，ESD 治療早期胃癌后仍有3.2%的患者存在術(shù)后復(fù)發(fā)的可能；國內(nèi)劉黎等[3]的臨床研究顯示，胃癌浸潤深度是早期胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此，對可能復(fù)發(fā)的高危人群進(jìn)行早期預(yù)警，并給予相應(yīng)的輔助治療或靶向治療，對改善預(yù)后、降低復(fù)發(fā)率具有積極價(jià)值。

微小RNA（micro RNAs，miRs）是在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)的非編碼小分子RNA，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，與多種惡性腫瘤的發(fā)生有著密切關(guān)系。相關(guān)臨床研究[4]證實(shí)，miR-21、miR-25、miR-93 和miR-106b 在胃癌組織中表達(dá)增多，其中miR-93 是具有促癌作用的miR；有細(xì)胞研究[5-6]證實(shí)，miR-93 能夠靶向胃癌細(xì)胞中的抑癌基因PTEN和TIMP2，并發(fā)揮促癌作用，與其在早期胃癌中高表達(dá)的趨勢相吻合。但早期胃癌中高表達(dá)的miR-93 是否對術(shù)后復(fù)發(fā)具有預(yù)測價(jià)值仍未明確。本研究選取接受ESD 的老年早期胃癌患者作為研究對象，分析miR-93 表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，并利用生物信息學(xué)初步探究miR-93 的靶向抑癌基因。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年1月－2017年12月本院確診為早期胃癌的老年患者268例。其中，男139例，女129例，年齡61～70 歲，平均（62.82±12.95）歲。另取同期在本院接受胃鏡下胃黏膜活檢、經(jīng)病理證實(shí)為正常胃黏膜、且一般資料匹配的受試者95例作為對照組。其中，男55例，女40例，年齡60～67歲，平均（63.34±12.19）歲。早期胃癌患者和正常胃黏膜受試者一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：①接受ESD治療；②術(shù)后病理學(xué)檢查診斷為胃癌；③TNM 分期為T1-2N0期；④年齡≥60 歲；臨床病理資料完整；⑤隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前接受過放化療；②術(shù)后接受放化療；③既往有其他惡性腫瘤病史；④隨訪過程中發(fā)生失訪。

1.2 試劑及儀器

miRNA 提取分離試劑盒、miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、miRNA 熒光定量檢測試盒購自天根生化科技（北京）有限公司，RIPA 裂解液購自上海碧云天公司，兔單克隆PTEN 和TIMP2 一抗購自Abcam 公司。熒光定量PCR 儀為Bio-Rad 公司，凝膠成像儀為上海勤翔科學(xué)儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 熒光定量PCR 檢測miR-93 的表達(dá)取早期胃癌組織和正常胃黏膜組織，使用miRNA 提取分離試劑盒提取組織樣本中的miRNA。使用miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒配置反轉(zhuǎn)錄體系，將miR 反轉(zhuǎn)錄為cDNA；miRNA 熒光定量檢測試劑盒配置熒光定量PCR 體系：cDNA 2 μL、混合液10.0 μL、10 μmol/L 上游引物0.6 μL、10 μmol/L 通用下游引物0.6 μL、去離子水6.8 μL，在PCR 儀上按照95℃預(yù)變性，3 min 后按95℃5 s、60℃15 s 的程序反應(yīng)40 個(gè)循環(huán)，根據(jù)循環(huán)曲線計(jì)算miR-93 的表達(dá)量。

1.3.2 Western blot 檢測PTEN 和TIMP2的表達(dá)取早期胃癌組織和正常胃黏膜組織，加入RIPA 裂解液后充分研磨、提取蛋白，測定蛋白含量后，取30 μg 蛋白樣本進(jìn)行Western blot 檢測，將蛋白樣本加入SDS-PAGE，電泳后電轉(zhuǎn)移至NC 膜，5%脫脂牛奶在室溫下封閉NC 膜1 h，1∶1 000 稀釋的PTEN 和TIMP2 單克隆抗體4℃孵育NC 膜過夜；第2天以1∶1 000 稀釋的HRP 二抗孵育NC 膜1 h，最后在凝膠成像儀中顯影得到蛋白條帶，根據(jù)條帶的灰度值計(jì)算PTEN 和TIMP2 的表達(dá)量。

1.4 術(shù)后隨訪

所有早期胃癌患者在術(shù)后3 個(gè)月內(nèi)每個(gè)月復(fù)查1 次，術(shù)后3～12 個(gè)月則每3 個(gè)月復(fù)查1 次，1年后每6 個(gè)月復(fù)查1 次，復(fù)查項(xiàng)目包括血常規(guī)、生化和胃鏡等。隨訪截止日期2019年10月31日，記錄患者的復(fù)發(fā)情況。

1.5 生物信息學(xué)分析

在Targetscan 網(wǎng)站上進(jìn)行miR-93 靶向PTEN、TIMP2 的生物信息學(xué)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件錄入數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；兩計(jì)量資料間的相關(guān)性分析采用Pearson 檢驗(yàn)；復(fù)發(fā)影響因素采用COX 回歸模型分析；復(fù)發(fā)率的比較采用Kaplan-Meier 曲線；miR-93 預(yù)測復(fù)發(fā)的價(jià)值采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic，ROC）分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 早期胃癌組織和正常胃黏膜組織中miR-93、PTEN和TIMP2 表達(dá)量比較

與正常胃黏膜組織比較，早期胃癌組織中miR-93 的表達(dá)量明顯增加，PTEN 和TIMP2 的表達(dá)量明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1 和表1。經(jīng)Pearson 檢驗(yàn)，早期胃癌組織中miR-93 的表達(dá)量與PTEN 和TIMP2 的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.412 和-0.384（P＜0.05）。

圖1 早期胃癌組織和正常胃黏膜組織中PTEN和TIMP2的蛋白條帶Fig.1 Protein bands of PTEN and TIMP2 in early gastric cancer and normal gastric mucosa tissue

表1 早期胃癌組織和正常胃黏膜組織中miR-93、PTEN和TIMP2表達(dá)量比較（±s）Table 1 Comparison of expression of miR-93,PTEN and TIMP2 in early gastric cancer and normal gastric mucosa tissue（±s）

表1 早期胃癌組織和正常胃黏膜組織中miR-93、PTEN和TIMP2表達(dá)量比較（±s）Table 1 Comparison of expression of miR-93,PTEN and TIMP2 in early gastric cancer and normal gastric mucosa tissue（±s）

類別早期胃癌組織（n=268）正常胃黏膜組織（n=95）t值P值miR-93 0.60±0.24 0.41±0.09 7.53 0.000 PTEN 0.52±0.11 0.93±0.18 26.04 0.000 TIMP2 0.45±0.10 1.32±0.32 39.48 0.000

2.2 不同臨床病理特征早期胃癌組織中miR-93、PTEN和TIMP2 表達(dá)量比較

不同性別、年齡患者的早期胃癌組織中miR-93、PTEN 和TIMP2 表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；T2期、低分化和未分化、黏膜下早期胃癌組織中miR-93 的表達(dá)量高于T1期、中分化和高分化、黏膜內(nèi)早期胃癌組織，PTEN 和TIMP2 的表達(dá)量明顯低于T1期、中分化和高分化、黏膜內(nèi)早期胃癌組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 不同臨床病理特征早期胃癌組織中miR-93、PTEN和TIMP2表達(dá)量比較（±s）Table 2 Comparison of expression of miR-93,PTEN and TIMP2 in early gastric cancer tissue with different clinicopathological features（±s）

表2 不同臨床病理特征早期胃癌組織中miR-93、PTEN和TIMP2表達(dá)量比較（±s）Table 2 Comparison of expression of miR-93,PTEN and TIMP2 in early gastric cancer tissue with different clinicopathological features（±s）

類別性別男（n=139）女（n=129）t值P值年齡≤65歲（n=101）＞65歲（n=167）t值P值T分期T1期（n=98）T2期（n=170）t值P值分化程度中分化和高分化（n=102）低分化和未分化（n=166）t值P值浸潤深度黏膜內(nèi)（n=182）黏膜下（n=86）t值P值miR-93 0.57±0.22 0.63±0.28 1.96 0.051 0.58±0.21 0.61±0.30 0.88 0.378 0.46±0.17 0.68±0.29 6.86 0.000 0.44±0.19 0.70±0.28 8.28 0.000 0.54±0.16 0.71±0.30 6.05 0.000 PTEN 0.51±0.09 0.53±0.12 1.40 0.162 0.50±0.08 0.52±0.13 1.39 0.164 0.64±0.13 0.45±0.06 16.30 0.000 0.61±0.12 0.46±0.08 12.27 0.000 0.57±0.14 0.42±0.07 9.39 0.000 TIMP2 0.46±0.08 0.44±0.13 1.53 0.128 0.46±0.09 0.44±0.12 1.45 0.149 0.66±0.13 0.33±0.08 26.73 0.000 0.60±0.12 0.36±0.07 20.67 0.000 0.54±0.11 0.26±0.08 21.11 0.000

2.3 復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)患者早期胃癌組織中miR-93、PTEN和TIMP2 表達(dá)量比較

與未復(fù)發(fā)患者比較，復(fù)發(fā)患者早期胃癌組織中miR-93 的表達(dá)量明顯增加，PTEN 和TIMP2 表達(dá)量明顯減少，兩者比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

2.4 早期胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)影響因素COX 回歸分析

以是否復(fù)發(fā)為應(yīng)變量，性別、年齡、T 分期、分化程度、浸潤深度、miR-93、PTEN 和TIMP2 為自變量，進(jìn)行COX 回歸分析，結(jié)果顯示：黏膜下浸潤、miR-93 表達(dá)增多、PTEN 及TIMP2 表達(dá)減少是早期胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。見表4。

2.5 miR-93 預(yù)測早期胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的Kaplan-Meier 曲線及ROC 曲線分析

根據(jù)早期胃癌組織中miR-93 表達(dá)量的中位數(shù)分為miR-93低表達(dá)和高表達(dá)，繪制未復(fù)發(fā)的Kaplan-Meier曲線，與miR-93 低表達(dá)患者比較，miR-93 高表達(dá)患者的未復(fù)發(fā)率較低（P＜0.05）；繪制miR-93 表達(dá)量預(yù)測早期胃癌患者復(fù)發(fā)的ROC 曲線，曲線下面積為0.7015（95%CI：0.583～0.820），根據(jù)約登指數(shù)最大值確定最佳截點(diǎn)為0.72，靈敏度和特異度分別為66.02%和66.67%。見圖2 和3。

2.6 miR-93靶向PTEN和TIMP2的生物信息學(xué)分析

miR-93 靶 向PTEN 基 因 為mRNA 3’UTR 序 列的第272-278 堿基，靶向TIMP2 基因?yàn)閙RNA 3’UTR 序列的第1 961-1 967 堿基。見圖4。

表3 復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)患者早期胃癌組織中miR-93、PTEN和TIMP2表達(dá)量比較（±s）Table 3 Comparison of expression of miR-93,PTEN and TIMP2 in early gastric cancer tissues of patients with and without recurrence（±s）

表3 復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)患者早期胃癌組織中miR-93、PTEN和TIMP2表達(dá)量比較（±s）Table 3 Comparison of expression of miR-93,PTEN and TIMP2 in early gastric cancer tissues of patients with and without recurrence（±s）

類別未復(fù)發(fā)（n=256）復(fù)發(fā)（n=12）t值P值miR-93 0.59±0.24 0.76±0.19 2.99 0.003 PTEN 0.73±0.18 0.51±0.07 9.59 0.000 TIMP2 0.88±0.17 0.43±0.06 22.35 0.000

表4 早期胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)影響因素COX回歸分析Table 4 Cox regression analysis of influencing factors of postoperative recurrence in patients with early gastric cancer

圖2 早期胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的Kaplan-Meier曲線Fig.2 Kaplan-Meier curve of postoperative recurrence in patients with early gastric cancer

圖3 miR-93預(yù)測早期胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的ROC曲線Fig.3 ROC curve of miR-93 in predicting postoperative recurrence of patients with early gastric cancer

圖4 miR-93靶向PTEN和TIMP2的生物信息學(xué)分析Fig.4 Bioinformatics analysis of miR-93 targeting PTEN and TIMP2

3 討論

ESD 在早期胃癌的治療中表現(xiàn)出積極價(jià)值，具有創(chuàng)傷小、組織學(xué)切除徹底等優(yōu)勢，但仍有部分患者發(fā)生術(shù)后復(fù)發(fā)，造成預(yù)后不良。因此，篩選可能發(fā)生術(shù)后復(fù)發(fā)的高危早期胃癌患者，并盡早在術(shù)后進(jìn)行輔助治療和靶向治療，具有積極的臨床意義。miR-93 是一種具有促癌作用的miRNA，在包括胃癌在內(nèi)的多種消化道惡性腫瘤中均呈高表達(dá)趨勢[7-10]，也有研究[11]表明，早期胃癌血清中miR-93的表達(dá)增多。本研究對入組的早期胃癌患者進(jìn)行了miR-93 表達(dá)量的分析，發(fā)現(xiàn)早期胃癌組織中miR-93 的表達(dá)量明顯高于正常胃黏膜組織，與既往研究結(jié)果[9，11]一致，驗(yàn)證了miR-93 高表達(dá)與早期胃癌發(fā)生的關(guān)系。

miR-93 的促癌作用包括促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，胃癌細(xì)胞中的PTEN 和TIMP2 已經(jīng)被證實(shí)受到miR-93 調(diào)控[5-6]。PTEN 和TIMP2 均是重要的抑癌基因，前者通過抑制PI3K/AKT 通路來抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12-13]，后者通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性來抑制細(xì)胞遷移、侵襲[14]。當(dāng)miR-93表達(dá)增多時(shí)，能夠抑制PTEN 及TIMP2 的表達(dá)，并使細(xì)胞凋亡受阻，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、遷移及侵襲增強(qiáng)。在早期胃癌的病理進(jìn)程中，癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲與腫瘤病灶的生長、分化、浸潤均密切相關(guān)。本研究分析不同病理特征的早期胃癌組織中miR-93 表達(dá)的差異，發(fā)現(xiàn)T2期、低分化和未分化、黏膜下早期胃癌組織中miR-93 的表達(dá)量明顯升高，受miR-93 調(diào)控的PTEN 和TIMP2 表達(dá)量減少，且miR-93 與PTEN、TIMP2 呈負(fù)相關(guān)，說明miR-93高表達(dá)不僅參與了早期胃癌的發(fā)生，還加速了早期胃癌病灶生長、分化程度降低、黏膜下浸潤等病理特征的惡化。進(jìn)一步在Targetscan 網(wǎng)站進(jìn)行生物信息學(xué)分析可知，PTEN 及TIMP2 基因mRNA 的3’UTR 上含有miR-93 的結(jié)合位點(diǎn)，符合miR-93 靶向抑制PTEN 及TIMP2 表達(dá)的生物學(xué)效應(yīng)。因此，靶向抑癌基因PTEN、TIMP2 并介導(dǎo)促進(jìn)增殖、侵襲等生物學(xué)效應(yīng)，可能是miR-93 高表達(dá)參與早期胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。

已有研究[15-16]報(bào)道，腫瘤病理特征是早期胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的影響因素；劉黎等[3]臨床研究顯示，胃癌浸潤深度及原癌基因β-catenin、抑癌基因E-cadherin 表達(dá)異常是早期胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究對早期胃癌患者ESD 后復(fù)發(fā)情況進(jìn)行隨訪及分析，復(fù)發(fā)的早期胃癌患者中miR-93 表達(dá)增加，而抑癌基因PTEN、TIMP2 表達(dá)減少，提示：miR-93 及受其調(diào)控的PTEN、TIMP2 表達(dá)異常，可能與早期胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)。進(jìn)一步通過COX 回歸模型驗(yàn)證，黏膜下浸潤、miR-93 表達(dá)增多、PTEN 及TIMP2 表達(dá)減少均是早期胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素；黏膜下浸潤作為危險(xiǎn)因素、與劉黎等[3]報(bào)道一致；miR-93 高表達(dá)、PTEN 及TIMP2 表達(dá)減少作為危險(xiǎn)因素，與相應(yīng)的生物學(xué)功能吻合。

miR-93 的促癌作用被廣泛證實(shí)，可能在癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為中處于上游調(diào)控地位，通過調(diào)控下游包括PTEN、TIMP2 在內(nèi)的多種靶基因來增強(qiáng)癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。因此，miR-93 表達(dá)的改變，可以通過復(fù)雜的下游機(jī)制來造成早期胃癌的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)也影響遠(yuǎn)期預(yù)后，造成局部復(fù)發(fā)。在COX回歸模型驗(yàn)證了miR-93 表達(dá)增加與早期胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系后，本研究還通過Kaplan-Meier 曲線及ROC 曲線分析了miR-93 預(yù)測復(fù)發(fā)的價(jià)值，結(jié)果顯示，miR-93 高表達(dá)的早期胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率更高，且miR-93 的表達(dá)對早期胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)具有預(yù)測價(jià)值。因此，miR-93 的表達(dá)可能成為預(yù)測早期胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)、篩查早期胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)高危人群的標(biāo)志物，也可能成為治療早期胃癌、預(yù)防復(fù)發(fā)的治療靶點(diǎn)。

綜上所述，早期胃癌中miR-93 表達(dá)增多與病理特征惡化、抑癌基因PTEN 及TIMP2 表達(dá)減少以及ESD 術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)；miR-93 高表達(dá)是早期胃癌患者ESD 術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，對術(shù)后復(fù)發(fā)具有預(yù)測價(jià)值，靶向抑癌基因PTEN 和TIMP2 是其可能的生物學(xué)作用。本研究的不足之處是隨訪時(shí)間較短，今后將進(jìn)一步延長隨訪時(shí)間，并深入挖掘miR-93在早期胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及可能機(jī)制。