巨細(xì)胞病毒肝損害患兒外周血IL-17、IL-35與Th17/Treg的表達(dá)及臨床意義

楊澤民，張陣，王文輝，冷建剛，劉虎，桑旭

巨細(xì)胞病毒感染是常見病毒感染性疾病之一，其病原體是人巨細(xì)胞病毒(HCMV)，嬰兒的免疫系統(tǒng)相對低下，屬易感人群。HCMV可造成全身各個系統(tǒng)的損害，肝臟是嬰兒期最易受到損害的器官之一。HCMV導(dǎo)致的肝功能損害主要的臨床表現(xiàn)有肝功能異常、肝脾腫大和黃疸，主要是由免疫、遺傳、環(huán)境等許多方面因素造成的[1]。目前，HCMV發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，一方面與病毒直接感染導(dǎo)致的，另一方面可能與機(jī)體免疫應(yīng)答相關(guān)。HCMV感染一般為慢性感染，期間存在著免疫功能紊亂，是多種細(xì)胞因子和相關(guān)免疫細(xì)胞共同作用的免疫應(yīng)答過程，其中CD4+T細(xì)胞尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)[2]，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+regulatoryT cells,Treg)與IL-17A的CD4+T 細(xì)胞(helper T cells 17,Th17)，不同于傳統(tǒng)的Th1/Th2細(xì)胞應(yīng)答模式，IL-35在抑制Treg細(xì)胞免疫中發(fā)揮著重要作用。關(guān)于巨細(xì)胞病毒感染合并肝功能損害后IL-17、IL-35及Th17/Treg 比例變化在國內(nèi)外研究甚少。本資料通過檢測HCMV感染肝損害組、HCMV感染無肝損害組和健康組嬰兒的外周血中Th17、Treg細(xì)胞比例和IL-17、IL-35含量，探討其在HCMV合并肝功能損害中的表達(dá)及意義，為臨床診斷和治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月—2019年12月在我院兒科確診為巨細(xì)胞病毒感染的嬰兒為研究對象，根據(jù)肝損害與否，將HCMV感染的嬰兒分為肝損害組20例和無肝損害組18例。肝損害診斷依據(jù)為：2015年中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會藥物性肝病學(xué)組制定的《藥物性肝損傷診治指南》[3]。另隨機(jī)抽取同一時間段20例兒科保健門診體檢正常嬰兒且明確排除了HCMV感染為健康組。入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡均小于1歲；診斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)2012年中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會感染學(xué)組制定的制定的《巨細(xì)胞病毒感染診斷方案》[1]，通過PCR-DNA方法檢測患兒尿液，HCMV-DNA拷貝數(shù)高于正常；排除標(biāo)準(zhǔn)：排除肝炎病毒、相關(guān)呼吸道病毒、EB病毒等其他病毒感染造成的肝臟損害，排除藥物性肝炎、遺傳代謝性疾病、先天性畸形等。均詳細(xì)告知家長本次研究的內(nèi)容，取得家長同意后，簽訂知情同意書。3組受試嬰兒一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組受試嬰兒一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 主要實驗器材和試劑 APC-CD25抗體、CD4-BB515抗體、IL-17A-PE抗體、PE-Foxp3抗體、白細(xì)胞激活劑組合、Transcrip-tion Factor Buffer Set、人IL-17、IL-35 ELISA試劑盒均來自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司；COBAS-C-701全自動生化分析儀購自德國羅氏公司；BD FACSCantoTMⅡ流式細(xì)胞儀從美國BD公司購買。

1.2.2 測定外周血中IL-17、IL-35濃度 抽取嬰兒2 mL外周血置于EDTA抗凝管中，以3 000 r/min的速度離心10 min,使用EP管將血清標(biāo)本分裝。IL-17、IL-35含量檢測嚴(yán)格按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 尿HCMV-DNA定量、谷丙轉(zhuǎn)氨酶測定 所有患兒均于入院后次日清晨、空腹?fàn)顟B(tài)下，抽取血清，采用全自動生化儀測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)；并充分清洗外陰后留取新鮮尿液5 mL置于無菌清潔的試管中，運用FQ-PCR方法檢測尿HCMV-DNA定量。

1.2.4 檢測Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞比例 用同等容積的PBS液稀釋剩余血標(biāo)本后，以1 500 r/min的速度離心20 min淋巴細(xì)胞分離液，舍棄上層清液，將2 μl白細(xì)胞激動劑與外周血單核細(xì)胞(PBMC)加至24孔板中，待均勻分布，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h后離心，標(biāo)記管內(nèi)剩余沉渣，并向內(nèi)加入50 μl的PBS液，吹打混勻，分別用2 μl CD4-BB515抗體、APC-CD25標(biāo)記為Treg管及對照管，震蕩搖勻以后，在避光狀態(tài)下室溫孵育30 min加入1 mL PBS液，離心后對照管中加入200 μl甲醛于Th 17對照管內(nèi)重懸，將標(biāo)本保存在4 ℃冰箱中；把1 mL細(xì)胞固定液加入Th17管中重懸，室溫避光孵育1 h，注意使用Wash破膜劑固定，以1 500 r/min的速度離心5 min棄上清液，用緩沖液洗滌細(xì)胞；IL-17 A抗體及2 μl PE-Foxp3抗體用2 μl P標(biāo)記后加入相關(guān)試管中，對照管加入相應(yīng)的對照抗體染色，再次室溫避光孵育1 h；洗滌后離心,使用流式細(xì)胞儀測定Treg細(xì)胞/Th17細(xì)胞數(shù)值。

2 結(jié)果

2.1 3組受試嬰兒尿HCMV-DNA定量及谷丙轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)比較 肝損害組與無肝損害組尿HCMV-DNA定量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，肝損害組與健康組比較，肝損害組高于健康組(P<0.05)；肝損害組ALT指標(biāo)明顯高于無肝損害組和健康組(P均<0.05)，無肝損害組和健康組ALT比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組受試嬰兒尿HCMV-DNA定量和ALT分析

2.2 3組受試嬰兒相關(guān)細(xì)胞因子濃度及外周血Th17細(xì)胞比例、Treg細(xì)胞比例比較 肝損害組IL-17含量、Th17所占比例、及Th17/Treg高于無肝損害組、健康組，而無肝損害組亦明顯高于健康組(P<0.05)。肝損害組IL-35含量、Treg所占比例低于無肝損害組和健康組(P均<0.05)，而無肝損害組IL-35值、Treg亦明顯低于健康組(P<0.05)。見表3。

表3 3組受試嬰兒IL-17、IL-35濃度及Th17、Treg細(xì)胞比例比較

2.3 相關(guān)性分析 IL-17含量與血清Th17所占比例呈正相關(guān)(r=0.83，P<0.05)；IL-35含量與血清Treg所占比例呈正相關(guān)(r=0.62，P<0.05)。

3 討論

巨細(xì)胞病毒感染是常見的病毒感染性疾病，在發(fā)展中國家發(fā)病率尤為顯著；中國作為巨細(xì)胞病毒感染高發(fā)地區(qū)，相關(guān)文獻(xiàn)顯示孕產(chǎn)婦檢測到的抗體的陽性率可達(dá)95%以上[4-5]。孕婦感染后，巨細(xì)胞病毒可造成宮內(nèi)感染，導(dǎo)致死胎、宮內(nèi)生長發(fā)育遲緩等，而且可使新生兒出現(xiàn)肝膽系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等多器官、多系統(tǒng)的損傷[6]，嚴(yán)重?fù)p害孕產(chǎn)婦、胎兒及新生兒的身心健康。嬰兒的巨細(xì)胞病毒感染的發(fā)生率2%左右[7-8]，且缺乏特異性的臨床表現(xiàn)，故增加了早期診斷的難度。

在全身各個器官中，肝臟是最易受到HCMV感染靶器官之一。文獻(xiàn)顯示，在嬰兒肝炎綜合征(IHS)中，HCMV檢測陽性率可高達(dá)60%，可作為主要的病原體。HCMV多定植在肝膽管上皮及內(nèi)皮細(xì)胞中，經(jīng)白細(xì)胞黏附、吞噬及抗原提呈等一系列復(fù)雜的過程后，期間有多種細(xì)胞因子、免疫介質(zhì)共同作用，最終發(fā)生免疫炎癥反應(yīng)，損害肝臟[9-10]。唾液、血液、尿液等許多途徑均可排出巨細(xì)胞病毒，目前檢驗科多采用血液或尿液標(biāo)本進(jìn)行檢測。ELISA試劑盒與PCR相互配合，可提高早期診斷的準(zhǔn)確率[11-14]。

Th17細(xì)胞是由胸腺合成的輔助細(xì)胞，可以激活T細(xì)胞，分泌IL-17、IL-22和IL-23等抗炎細(xì)胞因子，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)及免疫反應(yīng)，達(dá)到抵御病原微生物感染的目的[15-16]。IL-17結(jié)合相應(yīng)的信號I型跨膜蛋白質(zhì)受體(IL-17R)后，可誘導(dǎo)MAP激酶發(fā)生磷酸化，聚集大量的炎癥介質(zhì)，使T細(xì)胞活性增加[17]。HCMV感染后，相應(yīng)的細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞因子，活化、聚集白細(xì)胞，并激活Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-17，對炎癥刺激引起的肝臟反應(yīng)，有較高的參與度[18]。因此，國外學(xué)者提出當(dāng)發(fā)生急性肝損害時，可選取IL-17作為標(biāo)志物[19]。在本資料中，HCMV感染導(dǎo)致的肝臟損害的患兒，檢測其外周血中IL-17含量明顯高于無肝損害組和健康組，與國內(nèi)外研究結(jié)果一致，所以本次實驗推測IL-17可以成為HCMV引起肝臟損傷的一項參考指標(biāo)。

Treg細(xì)胞是人體重要細(xì)胞亞群，具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的作用，機(jī)體在遭受到病原體感染后，細(xì)胞因子(如TCF-β、IL-10等)的濃度增加，使NK細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等的增殖分化受到抑制。Treg細(xì)胞可以分泌與傳統(tǒng)抗炎因子作用機(jī)制不同的新型因子，尤以IL-35為代表，其在心腦血管系統(tǒng)疾病、MDS、腫瘤等疾病中起到了重要免疫調(diào)控作用。IL-35既可以促進(jìn)Treg細(xì)胞增殖分化，亦能夠?qū)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞則有著強(qiáng)抑制炎癥反應(yīng)作用，達(dá)到調(diào)控免疫應(yīng)答的目的。在巨細(xì)胞病毒感染的動物模型中發(fā)現(xiàn)，IL-35在急性感染早期可抑制炎癥反應(yīng)，并在持續(xù)損傷的過程中，起到了維持細(xì)胞穩(wěn)定，保護(hù)重要器官功能的作用[20]。在本資料中發(fā)現(xiàn)，IL-35含量和Treg細(xì)胞比例在巨細(xì)胞病毒感染引起肝臟損害后顯著降低，與動物模型中的結(jié)果類似，所以，嬰兒感染HCMV后，IL-35和Treg可能具有保護(hù)機(jī)體細(xì)胞和器官的作用。本資料顯示，與健康組比較，肝損害組的Treg細(xì)胞比例顯著降低，使Th17/Treg之間的比例失去平衡，導(dǎo)致IL-17含量迅速增加，加重炎癥反應(yīng)程度，并誘發(fā)免疫應(yīng)答反應(yīng)，損傷機(jī)體免疫系統(tǒng)功能。Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞關(guān)系密切，首先，二者均來自于CD4+T細(xì)胞，在IL-6濃度較高時，Treg細(xì)胞可轉(zhuǎn)化形成Th17細(xì)胞；此外，Treg細(xì)胞可結(jié)合ROR-γt，可影響IL-17RNA轉(zhuǎn)錄效率，使Th17細(xì)胞功能降低[21]。Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞具有保護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境及調(diào)節(jié)免疫功能等重要作用，在慢性病毒感染的患者中，Treg細(xì)胞含量增加，而在肝臟出現(xiàn)了明顯的炎癥時，Th17細(xì)胞表達(dá)增加，研究顯示，重度肝臟損害時，Th17細(xì)胞濃度及IL-17含量明顯升高，而在此時，Treg細(xì)胞的分化能力也顯著加強(qiáng)，抑制免疫應(yīng)答，降低肝臟損害程度[22]。而IL-35能夠降低Th17細(xì)胞的功能，減少分泌IL-17，達(dá)到保護(hù)機(jī)體，避免嚴(yán)重免疫損傷的作用[23]。

綜上所述，有很多細(xì)胞和炎癥介質(zhì)參與到HCMV導(dǎo)致肝功能損害的過程中。例如Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞及IL-17、IL-35等，它們之間的動態(tài)平衡在保持機(jī)體免內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和免疫調(diào)節(jié)的過程中發(fā)揮了重要的作用。相信隨著研究的進(jìn)一步深入，這些細(xì)胞、細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)將廣泛應(yīng)用于臨床。