仔豬腹瀉病原菌多重PCR檢測(cè)方法的建立

申 湖 黃 利

（大方縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州大方 551600）

1 材料

1.1 菌株

大腸桿菌、沙門氏菌、志賀桿菌三種細(xì)菌均由貴州省動(dòng)物疫病研究室提供。

1.2 試劑

普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、鮮血營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、膽硫乳培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

2 方法

2.1 試劑配制

2.1.1 固體培養(yǎng)基

稱取胰蛋白胨10g；酵母提取物5g；NaCl 10g；瓊脂粉15g依次放入錐形瓶中加入蒸餾水至1000ml，加熱溶液至溶液沸騰。將錐形瓶包裝好后放入高壓滅菌鍋中進(jìn)行121℃高壓滅菌30min，滅菌后將溶液傾倒無(wú)菌平板即可，制作好的平板置于4℃冰箱保存待用。

2.1.2 液體培養(yǎng)基

稱取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，依次放入錐形瓶中加入蒸餾水至1000 ml，用電熱爐加熱至沸騰待容易呈清亮透明時(shí)即可，最后將錐形瓶包裝好后放入121℃高壓滅菌30min。

2.1.3 瓊脂糖凝膠

稱取1.5g瓊脂糖于100ml錐形瓶中，向瓶?jī)?nèi)加入TBE至100ml，在電熱爐上將其加熱煮沸待溶液清亮透明時(shí)即可。待溶液冷卻至50～60℃時(shí)加入7μl核酸染料混勻，將配制好的電泳凝膠溶液傾倒膠槽中，待其徹底冷卻方可使用。

2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

針對(duì)大腸埃希菌23S rRNA基因、沙門氏菌invA基因和志賀桿菌的ipaH基因，用 Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)上下游引物，引物由英俊公司合成。

2.3 細(xì)菌DNA提取

將實(shí)驗(yàn)室保存的已分離鑒定的大腸桿菌、沙門氏菌、志賀桿菌用接種環(huán)接種到新的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用于DNA提取。

（1）從保存的離心管中取新的離心管并標(biāo)上大腸桿菌、沙門氏菌、志賀桿菌字樣然 后從純化培養(yǎng)過(guò)的大腸桿菌、沙門氏菌、志賀桿菌試管中分別取2ml菌液加入到標(biāo)記的離心管內(nèi)，10000.rpm離心1min然后用移液槍吸掉或直接倒掉上清液，得到菌體沉淀。

（2）用移液槍分別向所獲得的菌體沉淀離心管中加入200μl緩沖液GA，利用振蕩儀充分震蕩混勻至菌體沉淀徹底懸浮。

（3）向離心管中分別加入20 μlproteinaseK溶液然后上下顛倒使溶液充分混勻。

（4）往離心管中加入220 μl緩沖液GB振蕩15s，70℃放置10 min這時(shí)溶液應(yīng)變清亮，簡(jiǎn)短離心以去除離心管管蓋內(nèi)壁的水珠。

（5）向離心管內(nèi)各加入無(wú)水乙醇220 μl，利用微量震蕩器充分振蕩溶液使其混勻，此可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，為了去除管蓋內(nèi)壁的水珠可以用微量離心機(jī)離心。

（6）將上一步所獲得的絮狀沉淀及其溶液轉(zhuǎn)移到三個(gè)吸附柱CB1、CB2、CB3中，并將吸附柱放入到收集管內(nèi)，12000 rpm離心30s，傾倒掉廢液并把吸附柱放回到收集管內(nèi)

（7）向三支吸附柱中分別加入500 μl緩沖液GD，12000 rpm離心30s然后倒掉廢液并把吸附柱重新放回收集管內(nèi)

（8）往三支吸附柱中分別加入600 μl漂洗液PWC，12000 rpm離心30s，傾倒掉上層廢液并把吸附柱放回收集管內(nèi)

（9）繼續(xù)步驟8

（10）將三支吸附柱放回收集管內(nèi)，12000 rpm空柱離心2 min并傾倒掉廢液，將三支吸附柱室溫靜置5 min。

（11）把三支吸附柱分別放入三支新的收集管中，向吸附柱中間部位懸空滴加50～200μl的洗脫緩沖液TE，室溫靜置5 min，然后12000 rpm離心2 min并將所得溶液收集到離心管內(nèi)。

表2 引物序列表

2.4 多重PCR檢測(cè)方法的建立

2.4.1 單重PCR檢測(cè)

分別以大腸埃希菌、志賀桿菌和沙門氏菌菌株DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，總體積25μlPCR反應(yīng)體系，結(jié)束后用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳。反應(yīng)條件和體系見(jiàn)表3

表3 單重PCR反應(yīng)體系

表4 單重PCR反應(yīng)條件

2.4.2 多重PCR擴(kuò)增

按照實(shí)驗(yàn)步驟2.4的方法提取大腸桿菌、沙門氏菌和志賀桿菌的DNA模版，將提取的三種細(xì)菌的DNA模版按大腸桿菌DNA：沙門氏菌DNA：志賀桿菌DNA=1：1：1等量混勻并以混勻的三種菌的DNA 作為模版進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增反應(yīng)體系見(jiàn)表5，反應(yīng)條件見(jiàn)表6。

表5 單重PCR反應(yīng)體系

表6 單重PCR反應(yīng)條件

2.4.3 多重PCR反應(yīng)引物濃度的優(yōu)化（表7）

2.4.4 多重PCR反應(yīng)退火溫度的優(yōu)化

應(yīng)用上一步的最佳引物濃度和各退火溫度組合對(duì)多重PCR退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化退火溫度從51～60℃共10個(gè)梯度。從中優(yōu)化出多重PCR反應(yīng)體系的最佳退火溫度。PCR擴(kuò)增后經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳。

2.4.5 多重PCR反應(yīng)敏感性實(shí)驗(yàn)

利用步驟2.3提取的DNA模版經(jīng)核酸蛋白測(cè)定儀對(duì)3種細(xì)菌基因組DNA樣本進(jìn)行濃度測(cè)定，并分別進(jìn)行10倍梯度稀釋，取各稀釋度樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。檢驗(yàn)多重PCR最佳靈敏度。

表7 引物濃度梯度表

2.4.6 多重PCR反應(yīng)特異性實(shí)驗(yàn)

以大腸桿菌、沙門氏菌、志賀桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、巴氏桿菌等細(xì)菌混合DNA為模板，同時(shí)加入3對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增；同時(shí)加入3對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳觀察

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 單重PCR反應(yīng)體系的建立

對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、志賀桿菌三種細(xì)菌單一模版進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增。

圖1 單重PCR反應(yīng)的建立

由圖1可以看出大腸桿菌、沙門氏菌、志賀桿菌三種菌PCR擴(kuò)增分別在652bp、184bp、393bp時(shí)得到清晰明亮的條帶，說(shuō)明，本次試驗(yàn)所研究設(shè)計(jì)的3對(duì)引物特異性較好，表明研究設(shè)計(jì)的三對(duì)引物能夠應(yīng)用到之后的多重PCR檢測(cè)方法的建立。

3.2 多重PCR退火溫度優(yōu)化

選擇51～60℃進(jìn)行溫度梯度PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖2

如圖2所示，多重PCR均能得到清晰明亮目的條帶，其中第5泳道的條帶最明亮，因此選擇55℃作為本研究試驗(yàn)的最佳退火溫度。

3.3 多重PCR引物濃度優(yōu)化

選擇引物添加量分別為0.25μl、0.5μl、0.75μl、1μl、1.25μl、1.5μl、1.75μl、2μl、2.25μl、2.5μl，按所加引物濃度梯度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 多重PCR反應(yīng)退火溫度的優(yōu)化

圖3 多重PCR反應(yīng)引物濃度的優(yōu)化

如圖3所示均得到目的條帶但4泳道的條帶最清晰因此選擇引物添加量為1 μl即引物濃度為0.4 μmol/L作為最佳引物濃度

3.4 多重PCR敏感性試驗(yàn)

將初始三種DNA模板濃度分別稀釋，然后跑三重PCR結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 多重PCR反應(yīng)敏感性試驗(yàn)

由圖4可見(jiàn)，設(shè)計(jì)模版稀釋梯度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9。 圖中第 8 泳道的條帶最為暗淡，所以 多重PCR同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌、志賀氏菌和大腸桿菌靈敏度為10-8CFU/ml。

3.5 多重PCR特異性試驗(yàn)

分別對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、志賀桿菌3種細(xì)菌混合模版、單一模版及其他細(xì)菌的單一模版進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖5。

特異性試驗(yàn)所建立多重PCR能夠?qū)?種細(xì)菌混合模版、單一模版擴(kuò)增出清晰明亮的目的條帶，未能擴(kuò)增出其他細(xì)菌的任何目的條帶，表明所建立的方法特異性良好。

4 討論與分析

影響PCR反應(yīng)的因素有很多，引物的特異性、穩(wěn)定性、PCR反應(yīng)引物的濃度、PCR體系的退火溫度、DNA模版的含量和質(zhì)量以及各個(gè)DNA模版之間相互影響等都會(huì)影響到檢測(cè)的效果，因此可以從影響反應(yīng)的因素出發(fā)，通過(guò)選擇適當(dāng)條件因素進(jìn)行PCR反應(yīng)來(lái)建立能夠快速精確地檢測(cè)出致病菌的檢測(cè)方法。

而本次試驗(yàn)針對(duì)志賀桿菌ipaH的基因、大腸埃希菌23S rRNA基因和沙門氏菌invA基因分別設(shè)計(jì)合成了3對(duì)特異性引物。通過(guò)對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、志賀桿菌進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增，在凝膠成像儀上可以看出設(shè)計(jì)的三對(duì)引物擴(kuò)增的條帶都比較清晰明亮，表明研究設(shè)計(jì)的三對(duì)引物具有較好的特異性和穩(wěn)定性。通過(guò)不同的引物濃度梯度對(duì)模版DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增從中優(yōu)化出最佳引物濃度，再用最佳引物濃度應(yīng)用到多重PCR體系，選擇不同的退火溫度梯度對(duì)模版DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而優(yōu)化出最佳退火溫度。通過(guò)對(duì)引物濃度及退火溫度的優(yōu)化極大的減少了PCR擴(kuò)增誤差，增加了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。經(jīng)過(guò)隨機(jī)選取大腸桿菌、沙門氏菌、志賀桿菌等6種細(xì)菌菌株進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明本研究試驗(yàn)設(shè)計(jì)的多重PCR檢測(cè)方法具有良好的特異性和準(zhǔn)確性。整個(gè)檢測(cè)的過(guò)程所需時(shí)間極大縮短、準(zhǔn)確度得到了很大的提高，這能夠?yàn)榧膊〉目刂坪椭委煿?jié)約大量的時(shí)間。

圖5 多重PCR反應(yīng)特異性試驗(yàn)