Cytomics FC500與ImageStreamX Mark Ⅱ檢測大鼠脾臟T、B細(xì)胞亞群TDO2表達(dá)的比較

張冰潔，李絲雨，趙英杰，常 艷，魏 偉

Cytomics FC500型流式細(xì)胞儀作為經(jīng)典的流式細(xì)胞檢測技術(shù)，可以從細(xì)胞分子水平上通過抗原-抗體特異性結(jié)合原理對單個細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行精準(zhǔn)、快速的高通量定量分析[1]。它可以在短時間內(nèi)分析上萬個細(xì)胞，并能同時從一個細(xì)胞中測得多個指標(biāo)，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好的優(yōu)點。但它缺乏細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)等直觀觀察細(xì)胞信號分布的相關(guān)信息，獲得細(xì)胞信息有限[2-3]。ImageStreamXMark Ⅱ成像流式細(xì)胞儀除了具有傳統(tǒng)流式特點，還可以獲得單個細(xì)胞的圖像，可以對細(xì)胞形態(tài)、熒光探針的強度和定位進(jìn)行檢測，包括細(xì)胞間相互作用、吞噬、凋亡、自噬、核易位和形態(tài)變化等[4]。該文為比較2種流式檢測技術(shù)，以色氨酸2,3雙加氧酶(tryptophan 2, 3-dioxygenase, TDO2)在大鼠脾臟T、B細(xì)胞中的表達(dá)水平作為檢測指標(biāo)，從結(jié)果的相關(guān)性和一致性評價2種檢測技術(shù)的差異。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑SPF級健康雄性Wistar大鼠3只，體質(zhì)量(200±20)g，合格證號:[SCXK (京) 2016-0006]，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。FITC-CD3(批號：11-0030-81)、PE-CD4(批號：12-0040-80)、PE-CD8a(批號：25-0084-80)、PE-CD45R(批號：12-0460-82)、Transcription Factor Staining Buffer Set購于美國eBioscience公司；抗TDO2一抗(1 ∶100)(批號：15880-1-AP)、CL594-Conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(1 ∶100)(批號：SA 00013-4)熒光二抗購于美國Proteintech公司；Lysing Buffer(10× concentrate)購于美國BD公司。

1.2 儀器FC 500流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼公司；ImageStreamXMark Ⅱ成像流式細(xì)胞儀購自美國Amnis公司；SIGMA 3-30 K低溫高速離心機購自上海納騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的分離 麻醉后處死大鼠，無菌剝離脾臟，研磨大鼠脾臟制備細(xì)胞懸液，在細(xì)胞懸液中加入5 ml配制好的紅細(xì)胞裂解液祛除紅細(xì)胞，用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至3×106個細(xì)胞/ml。

1.3.22種流式細(xì)胞儀檢測T、B細(xì)胞亞群TDO2表達(dá) 樣本制備：在100 μl細(xì)胞懸液(3×106個細(xì)胞/ml)中，分別按所需表面標(biāo)記加入FITC標(biāo)記的CD3抗體、PE標(biāo)記的CD4抗體、PE標(biāo)記的CD8抗體和PE標(biāo)記的CD45R抗體，同時設(shè)置空白對照管和陰性對照管。4℃避光孵育30 min。使用含2%胎牛血清的PBS洗滌1遍后加入100 μl固定液，混勻4℃避光固定30 min。PBS洗滌后加入100 μl破膜液重懸，室溫破膜10 min。每管加入2 μl血清封閉20 min。加入TDO2一抗，孵育1 h。加入二抗前按照上述步驟加入PBS洗滌離心棄上清液。二抗按照(1 ∶100 )μl配制，直接每管加入100 μl混勻，避光孵育30 min。上機前用PBS洗滌后，再加入PBS重懸后上機檢測。每個檢測指標(biāo)設(shè)3個復(fù)管，重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理相關(guān)性分析采用線性回歸和多配對標(biāo)本的非參數(shù)檢驗(Friedman檢驗)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。一致性評價采用Bland-Altman法，繪制Bland-Altman圖的橫坐標(biāo)(Average)為(FC500+Mark Ⅱ)/ 2，縱坐標(biāo)為(FC500-Mark Ⅱ)/[(FC500+Mark Ⅱ)/2]。

2 結(jié)果

2.1 Cytomics FC500與ImageStreamXMark Ⅱ檢測的相關(guān)性和一致性2種檢測技術(shù)測得大鼠脾臟CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞和CD45R+B細(xì)胞表達(dá)TDO2結(jié)果的判定系數(shù)R2均 >0.8，斜率在0.32～1.047，截距在6.409～33.381之間，P<0.05，相關(guān)性良好。Bland-Altman 分析顯示，2種檢測技術(shù)測得CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞和CD45R+B細(xì)胞表達(dá)TDO2的偏倚值分別為-1.3%、-8.2%、7.4%，一致性界限范圍較窄(見表1、圖 1)。

圖1 FC500和ImageStreamXMark Ⅱ流式細(xì)胞術(shù)檢測脾臟T細(xì)胞亞群、B細(xì)胞偏倚值圖 A:CD3+CD4+T細(xì)胞TDO2偏倚值；B: CD3+CD8+T細(xì)胞TDO2的偏倚值; C: CD45R+B細(xì)胞TDO2的偏倚值

2.2 Cytomics FC500與ImageStreamXMark Ⅱ檢測大鼠脾臟T、B細(xì)胞亞群表達(dá)TDO2的表達(dá)情況

2.2.1CD3+CD4+T細(xì)胞表達(dá)TDO2的情況 如圖2A(FC500)和2B(Mark Ⅱ)結(jié)果顯示，TDO2在CD3+CD4+T細(xì)胞內(nèi)有表達(dá)。

2.2.2CD3+CD8+T細(xì)胞表達(dá)TDO2的情況 如圖3A(FC500)和3B(Mark Ⅱ)結(jié)果顯示，TDO2在CD3+CD8+T細(xì)胞內(nèi)有表達(dá)。

2.2.3CD45R+B細(xì)胞表達(dá)TDO2的情況 如圖4A(FC500)和4B(Mark Ⅱ)結(jié)果顯示，TDO2在CD45R+B細(xì)胞內(nèi)有表達(dá)。

圖4 TDO2在大鼠脾臟B細(xì)胞中的表達(dá)A：Cytomics FC500的檢測結(jié)果；B：ImageStreamXMark Ⅱ的檢測結(jié)果； C： ImageStreamX MarkⅡ得到的細(xì)胞圖片

2.2.4ImageStreamXMark Ⅱ成像流式細(xì)胞儀檢測的熒光圖片 如圖2C、3C、4C，01、09表示明場，02表示CD3-FITC通道，03表示CD4-PE、CD8-PE、CD45R-PE通道，11表示APC-TDO2通道，結(jié)果顯示TDO2主要表達(dá)CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞和CD45R+B細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。

3 討論

色氨酸(tryptophan,Trp)耗竭導(dǎo)致犬尿氨酸(kynurenine,Kyn)及其下游產(chǎn)物增多，抑制T細(xì)胞的增殖甚至凋亡，進(jìn)而參與自身免疫病、癌癥等疾病的發(fā)生發(fā)展過程[5-8]。腫瘤細(xì)胞通過利用TDO2介導(dǎo)T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤生長[9-10]。脾臟是機體成熟淋巴細(xì)胞分布的主要部位，脾臟中T、B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞、體液免疫對維持機體免疫調(diào)節(jié)的穩(wěn)定發(fā)揮著重要作用[11]。本實驗利用2種不同流式細(xì)胞技術(shù)檢測大鼠脾臟輔助性T細(xì)胞(CD3+CD4+)、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD3+CD8+)、B細(xì)胞(CD45R+)中TDO2表達(dá)情況，同時獲取細(xì)胞圖像，為進(jìn)一步研究TDO2參與機體免疫調(diào)控以及更好地選擇實驗方法提供依據(jù)。

本實驗為比較2種流式細(xì)胞術(shù)檢測方法的差異，由同一人在同樣操作下上機檢測，實驗過程中，注意細(xì)胞數(shù)量分配均勻、適合的樣本抗體配比、正確的圈門設(shè)計和適當(dāng)?shù)碾妷貉a償調(diào)節(jié)等操作因素，兩臺儀器測得結(jié)果的差異可以控制在較小范圍內(nèi)。

Cytomics FC500型流式細(xì)胞儀因其具有：① 速度快，平均每管上機時間為1 min；② 操作簡便；③ 適用多種標(biāo)本的檢測等優(yōu)點，應(yīng)用廣泛。然而，這種流式細(xì)胞術(shù)檢測到的結(jié)果無法獲得具體的細(xì)胞圖像，因此局限于不要求細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分析，并且細(xì)胞圈門以及熒光強度的調(diào)節(jié)需要專業(yè)人員調(diào)試后方可使用，其結(jié)果受到人員影響較大。成像流式細(xì)胞分析儀因其操作簡便，獲取信息多，是近年來快速發(fā)展的新型流式細(xì)胞技術(shù)，它將傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)的高通量分析與細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析相結(jié)合，不僅可提供基于普通流式的陽性百分比分析統(tǒng)計數(shù)據(jù)，還可獲得細(xì)胞形態(tài)、表達(dá)部位等多個直觀圖片[12]。雖然上樣速度相對較FC500慢，平均每管耗時3 min，并且選用的洗液為不含鈣、鎂離子的PBS，成本較FC500高，但成像流式細(xì)胞分析儀還具有以下幾個優(yōu)點：① 樣本利用率高，上樣體積在 20～200 μl 左右，適用于珍貴樣本的流式檢測。② 細(xì)胞回收率高，上機過后的細(xì)胞仍可以用于提蛋白或者提RNA，繼而開展其他實驗。③ 可用1.5 ml離心管直接上機，不需耗費專用流式管。④ 應(yīng)用方便，儀器可自動調(diào)節(jié)熒光強度。綜上，ImageStreamXMark Ⅱ成像流式細(xì)胞儀可在同等操作下獲得更多實驗結(jié)果，但實驗儀器的選擇還要根據(jù)具體的實驗條件、實驗?zāi)康?、檢測指標(biāo)等要求，綜合權(quán)衡和選擇。