MALAT1基因rs619586、rs7927113位點(diǎn)多態(tài)性在廣西人群的分布

王 艷，劉純宏，譚 曇，雷 茗，黃艷云，藍(lán) 艷，韋葉生

轉(zhuǎn)移相關(guān)的肺腺癌轉(zhuǎn)錄物1 (metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1) 是位于染色體11q13.1，長(zhǎng)度約為8kb的長(zhǎng)鏈非編碼RNA。該基因在哺乳動(dòng)物的組織和細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，參與基因剪切、轉(zhuǎn)錄前后調(diào)控，與突觸形成、骨骼肌發(fā)生、血管生長(zhǎng)等生理功能相關(guān)[1]。新近研究[2-3]顯示MALAT1在多發(fā)性硬化、肝癌等疾病中存在異常表達(dá)，且其多態(tài)性影響疾病風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)示MALAT1多態(tài)性有望成為相關(guān)疾病的新生物靶標(biāo)。但遺傳變異是地理位置、飲食習(xí)慣、種族民族等多重效應(yīng)的結(jié)合，在推廣應(yīng)用前，需先了解當(dāng)?shù)卣Ｈ巳旱亩鄳B(tài)性特征。目前，廣西正常人群MALAT1基因rs619586和rs7927113遺傳多態(tài)性未見(jiàn)報(bào)道。由此，該實(shí)驗(yàn)通過(guò)SNPscan 技術(shù)檢測(cè)rs619586、rs7927113位點(diǎn)多態(tài)性，并與人類(lèi)單倍體型圖(haplotype map，HapMap ) 計(jì)劃公布的數(shù)據(jù)比較，旨在探究MALAT1多態(tài)性在不同地區(qū)的分布，為MALAT1相關(guān)疾病提供群體遺傳學(xué)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料2018年6～11月，從右江民族醫(yī)學(xué)院體檢中心隨機(jī)納入195例體檢人員，男104例、女91例，年齡20～79(41.79±12.13)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：樣本來(lái)源地為居住地與籍貫均為廣西且無(wú)親緣關(guān)系；各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)合格，排除心、肝、腎、腫瘤以及遺傳免疫等疾病。研究方案已在本院倫理委員會(huì)備案，研究對(duì)象均同意采集血液樣本參與實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要儀器與試劑JYO2S型紫外分析儀(北京君意東方公司)；人類(lèi)基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；S100型Thermal Cycler擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；人86SNP位點(diǎn)SNPscan 檢測(cè)試劑盒(上海天昊生物科技有限公司)；ABI3500型Genetic Analyzer分析儀(美國(guó)ABI公司)。

1.3 方法

1.3.1樣本DNA制備 采集空腹靜脈血3 ml于EDTA-K2紫帽采血管。按照北京天根公司離心柱法說(shuō)明書(shū)規(guī)范提取DNA樣本，并分裝儲(chǔ)存，放置-20 ℃?zhèn)溆?。所提DNA樣本經(jīng)紫外分光光度檢測(cè)并篩選吸光度(optical density, OD)260/280值1. 7～2.0，濃度 20～50 ng/μl 的合格DNA用于基因分型。

1.3.2引物設(shè)計(jì)與合成 通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information，NCBI) 選取包含rs619586、rs7927113位點(diǎn)適宜長(zhǎng)度的DNA片段，選擇DNA序列，輸入 Primer Premier 3.0 在線(xiàn)軟件設(shè)計(jì)引物，由上海天昊公司合成引物序列。目標(biāo)位點(diǎn)rs619586A/G的SNPscan法等位基因鑒別引物長(zhǎng)度28 bp,序列分別為5′-CACTTCTTGTGTTCTCTTGAGGGACTGT-3′，5′- CACTTCTTGTGTTCTCTTGAGGGACTGC-3′，通用引物長(zhǎng)度30 bp,序列為5′- AGGTATAGTTTACCACCTTTTGAAGGAAGA-3′。rs7927113位點(diǎn)等位基因引物鑒別長(zhǎng)度為20 bp，序列分別為5′-TGTGGCCTTGGCACACTCGT-3′，5′-TGTGGCCTTGGCACACTTGC-3′，通用引物長(zhǎng)度24 bp，序列為5′-ATGCTGGTCTAGGATCCTCTACGC-3′。

1.3.3SNPscan分型檢測(cè) 嚴(yán)格按照人86SNP位點(diǎn)SNPscan檢測(cè)定制試劑盒使用說(shuō)明書(shū)操作，目標(biāo)位點(diǎn)基因型由Gene Mapper軟件質(zhì)量控制并讀取。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Hardy-Weinberg分析樣本群體的遺傳代表性(P> 0.05提示群體遺傳平衡)。采用SPSS 20.0軟件的行×列表和四格表資料的χ2檢驗(yàn)對(duì)計(jì)數(shù)資料(基因型和等位基因)統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MALAT1基因rs619586、rs7927113位點(diǎn)多態(tài)性測(cè)序表明，rs619586位點(diǎn)存在A到G少量變異，AA(78.5 %)、AG(21.5 %)2種基因分型，等位基因A、G頻率為89.2 %、10.8%。rs7927113位點(diǎn)存在極少量G到A突變，基因型為GG (97.4 %)、AG (2.6 %)2種，等位基因G、A頻率為98.7 %、1.3 %?；驕y(cè)序圖如圖1、2。

圖1 MALAT1基因rs619586位點(diǎn)測(cè)序圖a：AA基因型；b：AG基因型；灰色柱狀為目標(biāo)峰處

圖2 MALAT1基因rs7927113位點(diǎn)測(cè)序圖a：GG基因型；b：AG基因型；灰色柱狀為目標(biāo)峰處

2.2 廣西人群MALAT1基因rs619586、rs7927113位點(diǎn)多態(tài)性分布樣本人群兩目標(biāo)位點(diǎn)基因型數(shù)據(jù)滿(mǎn)足哈迪-溫伯格平衡法則(hardy-weinberg equilibrium, HWE)，P為0.092、0.856，樣本群體選擇有效。rs619586 A/G和rs7927113 G/A的基因型在男女樣本的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1 廣西人群MALAT1基因rs619586、rs7927113位點(diǎn)基因型分布

2.3 廣西人群MALAT1基因rs619586、rs7927113位點(diǎn)多態(tài)性與其他人群的比較廣西健康人群MALAT1 rs619586位點(diǎn)基因型、等位基因分布頻率同HapMap-JPT、HapMap-CEU、HapMap-YRI的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；rs7927113位點(diǎn)基因型與等位基因分布同HapMap-YRI的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2、3。

表2 廣西人群rs619586、rs7927113位點(diǎn)基因型分布與其他人群的比較

表3 廣西人群rs619586、rs7927113位點(diǎn)等位基因頻率與其他人群的比較

3 討論

MALAT1又被稱(chēng)為復(fù)核集常染色體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 (nuclear-enriched autosomal transcript 2, NEAT2)，由核糖核酸酶P(ribonuclease P，RNaseP)和核糖核酸酶Z(ribonuclease Z，RNaseZ)識(shí)別并切割成2個(gè)RNA：定位于核內(nèi)的RNA和胞質(zhì)的tRNA樣小RNA，成熟的MALAT1轉(zhuǎn)錄本定位在核斑區(qū)，且3′端的三螺旋結(jié)構(gòu)高度穩(wěn)定。最初，MALAT1在肺癌中被鑒定，但新的證據(jù)[4-6]表明MALAT1可通過(guò)海綿miRNAs，調(diào)控mRNA表達(dá)，參與染色質(zhì)修飾、調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路，與多種癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病相關(guān)聯(lián)，意味著MALAT1有望成為重要的潛在治療靶點(diǎn)。

單核苷酸多態(tài)性 (single nucleotide polymorphism，SNPs)包括轉(zhuǎn)換和顛換2種方式，已成為探究疾病進(jìn)展預(yù)后的重要途徑，如在女性和HBV陰性亞組中，MALAT1基因rs591291 TC突變型的肝癌患者預(yù)后更好[3]。此外，藥物代謝相關(guān)酶的SNPs不同，藥物在人群的代謝也存在差異[7]。在遺傳學(xué)中近距離的基因易形成連鎖，標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性(tag single nucleotide polymorphism，Tag SNP)即代表著同一片段內(nèi)所有SNP的類(lèi)型，rs619586 A/G、rs7927113 G/A作為MALAT1基因的Tag SNP，可提高研究效率，對(duì)MALAT1相關(guān)疾病研究有重要意義。

關(guān)于rs7927113位點(diǎn)，目前的研究報(bào)道較少，Peng et al[8]在乳腺癌中探究了該位點(diǎn)，尚未發(fā)現(xiàn)其與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)。而rs619586位點(diǎn)的相關(guān)報(bào)道逐漸增多。例如，rs619586 G等位基因可能通過(guò)結(jié)合miR-214,下調(diào)MALAT1基因表達(dá)、影響其結(jié)構(gòu)以及功能進(jìn)而調(diào)節(jié)乳腺癌、甲狀腺癌風(fēng)險(xiǎn)[8-9]。在rs619586相關(guān)的肝癌研究中，Yuan et al[10]在臺(tái)灣人群(<55歲)中發(fā)現(xiàn)rs619586 A>G突變可降低肝癌風(fēng)險(xiǎn)，Ji et al[11]在廣東人群中證實(shí)rs619586 在任何模型下與肝癌風(fēng)險(xiǎn)均不相關(guān)。此外，有學(xué)者[12-13]報(bào)道rs619586變異不是缺血性腦卒中和冠心病風(fēng)險(xiǎn)的影響因子。而Wang et al[14]針對(duì)云南人群的研究得出rs619586 G等位基因可降低冠心病風(fēng)險(xiǎn)。這些爭(zhēng)議性結(jié)論可能與樣本遺傳背景不同有關(guān)，提示有必要進(jìn)行細(xì)化至地區(qū)的多態(tài)性研究。

本研究顯示，MALAT1基因rs619586、rs7927113位點(diǎn)SNPs在廣西人群性別間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。進(jìn)一步將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與HapMap 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比得出： rs619586位點(diǎn)在中國(guó)(廣西與北京)的A > G突變頻率高于日本、歐洲、非洲地區(qū)，該位點(diǎn)AA、AG基因型以及等位基因A、G頻率與北京人群差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與日本、歐洲以及非洲的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這可能與地域背景相關(guān)，眾所周知，廣西是中國(guó)西南的多民族聚居之地，氣溫高雨量足，飲食結(jié)構(gòu)特殊。同北京漢族人群種族一致，與日本雖同屬亞洲人群，但在飲食結(jié)構(gòu)、氣候海拔以及生活習(xí)性等存在差異。而與歐洲、非洲的族群差異明顯，親緣較遠(yuǎn)，多態(tài)性的分布差異也更為明顯。關(guān)于rs7927113位點(diǎn)，廣西地區(qū)存在極少量G > A突變，野生基因型GG居主導(dǎo)地位。而HapMap-YRI人群的G > A突變普遍，存在GG、AG、AA 3種基因型，與廣西人群多態(tài)性的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。除上述遺傳背景差異外，非洲人群高生育的生殖因素影響突變的累積效應(yīng)，也可能是其原因之一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了MALAT1在不同地區(qū)的突變效應(yīng)不盡相同，這可能是同種疾病在不同區(qū)域間疾病風(fēng)險(xiǎn)不同的原因之一，突出了探索當(dāng)?shù)囟鄳B(tài)性對(duì)精準(zhǔn)醫(yī)療的價(jià)值。

綜上，本次針對(duì)廣西本土健康人群的MALAT1 rs619586 A/G、rs7927113 G/A位點(diǎn)的遺傳學(xué)研究，是探究MALAT1基因SNPs在疾病中發(fā)揮作用的基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)豐富廣西區(qū)域基因數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)當(dāng)?shù)叵嚓P(guān)疾病的防治工作有一定指導(dǎo)意義。當(dāng)然，本研究仍存在局限，如樣本來(lái)源較單一，可能影響抽樣誤差。此外，廣西的各民族間通婚普遍，父母雙方常存在民族不一現(xiàn)象，所以尚未進(jìn)行多態(tài)性與民族類(lèi)別的細(xì)分。將來(lái)應(yīng)進(jìn)行多中心、前瞻性的研究，進(jìn)一步探討民族、飲食結(jié)構(gòu)等環(huán)境人口因素對(duì)多態(tài)性的影響。