IL-19在慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉患者組織中的表達(dá)及其臨床意義

蘇 飛，汪銀鳳，潘春晨

慢性鼻-鼻竇炎(chronic rhinosinusitis，CRS)是一種異質(zhì)性的鼻腔鼻竇慢性炎癥性疾病，主要表現(xiàn)包括鼻塞、膿涕或鼻涕倒流、頭痛、面部脹痛和嗅覺(jué)減退。中國(guó)慢性鼻竇炎診斷和治療指南(2018)[1]根據(jù)是否合并鼻息肉將CRS分為：慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP)和慢性鼻-鼻竇炎不伴息肉(CRSsNP)。CRSwNP主要以Th2炎癥反應(yīng)及嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主，而CRSsNP則以Th1炎癥反應(yīng)及非嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主[2]。有學(xué)者[3]提出了CRSwNP 的內(nèi)分型，其中應(yīng)用最廣泛的是根據(jù)鼻息肉組織中嗜酸性粒細(xì)胞的百分比將CRSwNP分為嗜酸粒細(xì)胞性慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉(eosinophilic CRSwNP，ECRS)和非嗜酸粒細(xì)胞性慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉(non-ECRS)。白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-19的產(chǎn)生依賴(lài)于LPS或粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子作用于激活的單核細(xì)胞[4]，主要作用為誘導(dǎo)Th2細(xì)胞因子表達(dá)，是Th2免疫反應(yīng)中最重要的調(diào)節(jié)因子之一，與哮喘[5]、銀屑病[6]、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[7]及食管癌[8]等都有密切的關(guān)系。研究[5]表明IL-19對(duì)哮喘中的炎癥反應(yīng)具有促進(jìn)作用，哮喘主要的炎性細(xì)胞同樣為嗜酸性粒細(xì)胞。然而，目前有關(guān)IL-19與CRS炎癥反應(yīng)關(guān)系的臨床研究較少。該研究探索了不同類(lèi)型CRSwNP組織中IL-19的表達(dá)水平及其與臨床癥狀的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2019年1月～2019年6月于安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院耳鼻喉科接受鼻內(nèi)鏡手術(shù)的患者共62例，根據(jù)術(shù)中所見(jiàn)及術(shù)后病理，分為：① ECRS組：CRSwNP患者，其息肉組織中嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)大于總炎性細(xì)胞數(shù)的10%[9]，共20例；② non-ECRS組：CRSwNP患者，但其息肉組織中嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)小于總炎性細(xì)胞數(shù)的10%，共22例；③ 對(duì)照組：排除因鼻部炎性疾病接受鼻內(nèi)鏡手術(shù)的患者，主要對(duì)象為單純性鼻中隔偏曲或單純鼻竇囊腫、外傷患者，共20例。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 術(shù)前1月內(nèi)全身或局部使用糖皮質(zhì)激素；② 單純后鼻孔息肉；③ 真菌性鼻-鼻竇炎；④ 囊性纖維化；⑤ 有上呼吸道感染及合并其他全身疾患。慢性鼻-鼻竇炎的診斷均符合中國(guó)慢性鼻竇炎診斷和治療指南(2018)[1]。ECRS組、non-ECRS組均于術(shù)中留取息肉標(biāo)本，對(duì)照組術(shù)中收集正常鉤突黏膜。所有標(biāo)本均分為2份，一部分用甲醛溶液固定后，用石蠟包埋固定切片進(jìn)行蘇木精-伊紅染色和免疫組織化學(xué)染色; 另一部分存儲(chǔ)在-80 ℃用于檢測(cè)IL-19的表達(dá)水平。研究經(jīng)安徽省立醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，每位受試者術(shù)前簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1視覺(jué)模擬量表(visual analog scale，VAS)癥狀評(píng)分 包含了鼻竇炎的5個(gè)主要癥狀：鼻塞、流涕或鼻涕倒流、頭痛或頭昏、面部脹痛以及嗅覺(jué)減退或消失。根據(jù)患者自身癥狀的嚴(yán)重程度在0～10分之間評(píng)分，每個(gè)癥狀0～2分，總分值越高癥狀越重。用以主觀表示疾病的嚴(yán)重程度。

1.2.2鼻內(nèi)鏡Lund—Kennedy主觀評(píng)分 根據(jù)鼻內(nèi)鏡表現(xiàn)，從息肉、水腫、鼻漏、瘢痕、結(jié)痂對(duì)患者進(jìn)行評(píng)分。每個(gè)指標(biāo)0～2分，兩側(cè)分別計(jì)數(shù)，總分20分。用于反映疾病的嚴(yán)重程度。

1.2.3鼻竇CT的Lund—Mackay評(píng)分 術(shù)前行鼻竇軸位+冠狀位高分辨CT平掃，分別對(duì)雙側(cè)額竇、前篩、后篩、上頜竇、蝶竇和竇口鼻道復(fù)合體(ostiomeatal complex，OMC)進(jìn)行評(píng)分：0分，竇腔無(wú)軟組織影；1分，竇腔部分軟組織影；2分，竇腔布滿軟組織影或OMC陰影，總分24分。兩側(cè)評(píng)分之和表示影像學(xué)嚴(yán)重程度。

1.2.4qRT-PCR 組織剪碎、液氮研磨后用TRIzol勻漿和氯仿進(jìn)行RNA提取。用Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus(novoprotein，No.E096-01B)試劑逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用設(shè)計(jì)引物和RevertAidTM first Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific，No. K1622)依據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)定量聚合酶鏈反應(yīng)，以檢測(cè)IL-19 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。本次實(shí)驗(yàn)所使用的分析方法為：Relative Quantification Study，計(jì)算方法為2-△△Ct。β-Actin廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，表達(dá)量非常豐富且在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定。故選擇β-Actin作為本次PCR實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表1。

表1 IL-19 mRNA 擴(kuò)增所需的引物序列

1.2.5免疫組織化學(xué)染色 通過(guò)S-P二步法進(jìn)行染色。術(shù)中組織經(jīng)10%甲醛溶液固定、石蠟包埋固定后連續(xù)4 μm切片。常規(guī)脫蠟復(fù)水，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。PBS沖洗3次，5 min/次；加一抗(兔抗人IL-19抗體1 ∶200)37℃孵育60 min，PBS沖洗3次，5 min/次；加二抗(羊抗兔抗體1 ∶100)37 ℃孵育20 min，PBS沖洗3次，5 min/次； DAB顯色，顯微鏡下觀察染色至適度時(shí)終止。顯微鏡下按切片染色強(qiáng)度評(píng)分。從每個(gè)切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野使用Image J軟件( 美國(guó)馬里蘭州Bethesda公司)計(jì)算染色切片的吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征統(tǒng)計(jì)對(duì)照組、non-ECRS組及ECRS組在性別、年齡特征方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3組實(shí)驗(yàn)對(duì)象的VAS評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.616，P>0.05)；對(duì)照組、non-ECRS組及ECRS組鼻內(nèi)鏡評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.26，P<0.05)；對(duì)照組、non-ECRS組及ECRS組CT評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=19.24，P<0.05)(表2)。

表2 患者臨床特征統(tǒng)計(jì)表

2.2 PCR結(jié)果組間差異統(tǒng)計(jì)PCR結(jié)果顯示，ECRS組IL-19的mRNA水平明顯高于non-ECRS組和對(duì)照組。與對(duì)照組相比，non-ECRS組IL-19的mRNA水平明顯增高(P<0.05)；與non-ECRS組相比，ECRS組的mRNA水平明顯增高(P<0.05)(圖1)。

圖1 3組間IL-19的mRNA水平差異與對(duì)照組比較：*P<0.05；與non-ECRS組比較：#P<0.05

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，IL-19主要表達(dá)在ECRS患者息肉的上皮和黏膜下腺體(圖2)；與對(duì)照組相比，non-ECRS組IL-19表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)；與non-ECRS組相比，ECRS組IL-19表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)(圖3)。

圖2 IL-19在3組的表達(dá) ×400A：對(duì)照組；B：non-ECRS組；C：ECRS組

圖3 3組間IL-19的表達(dá)水平差異與對(duì)照組比較：**P<0.01；與non-ECRS組比較：##P<0.01

2.4 ECRS組IL-19的mRNA水平與組織嗜酸性粒細(xì)胞百分比的相關(guān)性在ECRS組中，IL-19的mRNA水平與患者息肉組織嗜酸性粒細(xì)胞百分比呈正相關(guān)，結(jié)果顯示差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(rs=0.672，P<0.05)(圖4)。

圖4 ECRS組中IL-19的mRNA水平與嗜酸性粒細(xì)胞百分比的相關(guān)性

2.5 ECRS組mRNA水平與臨床癥狀的相關(guān)性在ECRS組中，IL-19的mRNA水平與患者CT評(píng)分呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(rs=0.785，P<0.05)。IL-19的mRNA水平與患者內(nèi)鏡評(píng)分呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(rs=0.613，P<0.05)。IL-19的mRNA水平與患者主觀VAS評(píng)分之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(rs=0.353，P>0.05)(圖5)。

圖5 IL-19的mRNA水平與患者臨床癥狀的相關(guān)性

3 討論

CRS作為全球范圍性的慢性疾病，雖然其很少有致命性的疾病結(jié)局，但是其異質(zhì)性和易復(fù)發(fā)性，給生活帶來(lái)極大影響，給社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)較重負(fù)擔(dān)。而其中異質(zhì)性和易復(fù)發(fā)性特征最明顯的ECRS作為其中的典型代表，主要表現(xiàn)為組織的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，且嗜酸性粒細(xì)胞水平與患者鼻腔組織重塑有明顯的相關(guān)性。CRS的分子靶向治療及詳細(xì)病理機(jī)制是目前的研究熱點(diǎn)。

研究人員[10]通過(guò)檢測(cè)鼻息肉中IL-19及其受體水平，發(fā)現(xiàn)中國(guó)人CRSwNP患者鼻息肉中IL-19及其受體與MMP-9呈正相關(guān)，推測(cè)IL-19及其受體可能參與了CRS組織重塑的發(fā)生發(fā)展，但并未就IL-19及其受體的臨床意義進(jìn)行探索。國(guó)外學(xué)者[11]證實(shí)了在體外條件下，IL-19通過(guò)下調(diào)IL-4水平在鼻成纖維細(xì)胞中發(fā)揮抗感染作用，但由于鼻竇炎的異質(zhì)性，體外條件并不能完全模擬IL-19在人體發(fā)揮作用時(shí)的免疫環(huán)境，目前多數(shù)研究仍然認(rèn)為IL-19在CRS中主要起到促進(jìn)Th2反應(yīng)的作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組、non-ECRS組及ECRS組的CT評(píng)分、鼻內(nèi)鏡評(píng)分具有差異，而主觀量表VAS評(píng)分無(wú)差異，猜測(cè)導(dǎo)致這個(gè)結(jié)果的原因可能是主觀量表評(píng)分受被試者的文化教育水平、患病病程和疾病耐受程度的影響，而CT評(píng)分及鼻內(nèi)鏡評(píng)分由醫(yī)師進(jìn)行評(píng)測(cè)，具有一定的客觀性。PCR及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果都表明，IL-19在ECRS組中的表達(dá)水平高于non-ECRS組和對(duì)照組，且主要表達(dá)部位在ECRS患者的息肉上皮層及黏膜下層的腺體中，證明了IL-19在CRS發(fā)病過(guò)程中對(duì)鼻腔黏膜的組織重塑及黏液分泌具有促進(jìn)作用。另外，IL-19的水平與組織中的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)水平以及CT評(píng)分、鼻內(nèi)鏡評(píng)分都有一定的相關(guān)性，說(shuō)明IL-19可能通過(guò)促進(jìn)組織嗜酸性粒細(xì)胞的聚集而加重臨床癥狀。

CRS的一個(gè)主要病理過(guò)程就是鼻黏膜的過(guò)度分泌及組織重塑。膿涕中的黏液主要由杯狀細(xì)胞分泌，而黏蛋白MUC5AC作為杯狀細(xì)胞增生和化生的標(biāo)志物，主要表達(dá)在黏膜上皮和黏膜下的腺體中，這與此次的免疫組化結(jié)果—IL-19主要表達(dá)在息肉的黏膜上皮和黏膜下腺體是一致的。研究[12]通過(guò)siRNA核轉(zhuǎn)染法敲除IL-19受體，發(fā)現(xiàn)IL-19對(duì)MUC5AC的促進(jìn)作用被阻斷，同時(shí)，通過(guò)對(duì)原發(fā)人鼻上皮細(xì)胞用隱丹參酮(STAT3抑制劑)進(jìn)行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)IL-19對(duì)MUC5AC的促進(jìn)作用同樣可以被終止。而IL-19受體和STAT3信號(hào)通路都是IL-19對(duì)MUC5AC促進(jìn)作用的必要組成過(guò)程。證明CRS中IL-19可能通過(guò)STAT3通路促進(jìn)MUC5AC的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)黏液的分泌。另外，有研究[13]證明STAT3以及STAT3的磷酸化形式主要表達(dá)于CRSwNP患者的上皮層，且STAT3的表達(dá)與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子以及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度密切相關(guān)。在CRSwNP中，IL-19可以通過(guò)STAT3信號(hào)促進(jìn)ECRS中MUC5AC的表達(dá)和組織中EOS的浸潤(rùn)，誘導(dǎo)CRSwNP向ECRS的轉(zhuǎn)化。而IL-4通過(guò)STAT6信號(hào)通路進(jìn)一步上調(diào)了IL-19的表達(dá)水平，IL-19和IL-4間通過(guò)STAT3/STAT6信號(hào)通路介導(dǎo)的正反饋調(diào)節(jié)[14]，激活并增強(qiáng)Th2反應(yīng)，促進(jìn)MUC5AC的表達(dá)和EOS的浸潤(rùn)，并且推動(dòng)疾病的進(jìn)展，最終加重了ECRS病情。

簡(jiǎn)言之，本研究證明了IL-19在ECRS中顯著高表達(dá)，且與組織中嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度及臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度相關(guān)。然而，需進(jìn)一步的研究來(lái)探索CRSwNP中IL-19的具體作用機(jī)制，有助于進(jìn)一步闡明CRS的發(fā)病機(jī)理，從而幫助認(rèn)識(shí)IL-19在CRS中的作用。