PD-L1表達在低分化胃腺癌分型中的臨床病理意義

李 明，張國強，李傳應(yīng)，陳晶晶，尹 玉

胃癌(gastric cancer, GC)是腫瘤相關(guān)死亡的主要原因。目前晚期GC的治療選擇有限，因此長期預(yù)后不佳。靶向治療已成為GC的新治療方式，但目前僅抗人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2 , HER2)抗體顯示出較好療效，HER2因此成為GC靶向治療的重要靶點。低分化胃腺癌(poorly differentiated gastric adenocarcinoma, PDGA)為GC獨特亞群，預(yù)后差且對化療反應(yīng)不佳，其HER2表達率也較低[1]，因此抗HER2治療應(yīng)用受限。近期研究[2]顯示免疫檢查點抑制劑在GC中顯示出一定療效，抗PD-1/PD-L1有望成為PDGA新的治療方法；而程序性死亡蛋白配體1(programmed death-ligand 1, PD-L1)可作為抗PD-1/PD-L1治療的療效預(yù)測標志物[2-3]。PD-L1為PD-1的一種配體，PD-L1與PD-1相互作用可抑制細胞毒性T細胞活化，從而協(xié)助腫瘤細胞(tumor cell， TC)實現(xiàn)免疫逃逸[4]。PD-L1在多種類型腫瘤中均可表達，但目前PDGA中PD-L1的表達及意義尚不明確。該研究首次在PDGA中分析了SP142檢測抗體定義的PD-L1表達，并探討了PD-L1表達在PDGA分型中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2016年～2018年在中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)及安徽省太和縣中醫(yī)院接受手術(shù)切除治療的GC病例共計163例，石蠟包埋組織標本可獲取，經(jīng)病理學(xué)評估證實為PDGA(腫瘤組織中低分化腺癌成分>90%)，所有病例均無腫瘤家族史且術(shù)前均未行放化療及靶向治療。入組病例年齡24～87(62.49±11.32)歲；男性119例，女性44例。TNM分期依據(jù)第7版AJCC GC分期標準。依據(jù)第3版日本GC分類標準(英文版)將PDGA分為2種組織學(xué)亞型，即實性型67例及非實性型96例。依據(jù)既往研究[5]定義腫瘤出芽，有腫瘤出芽者78例，無腫瘤出芽者85例。

1.2 免疫組織化學(xué)染色及熒光原位雜交選取代表性腫瘤組織蠟塊分別進行PD-L1、CD3、HER2及Ki-67免疫組織化學(xué)染色。蠟塊4 μm切片、脫蠟及水化后置于pH 8.0 EDTA抗原修復(fù)液(用于PD-L1染色，美國Santa Cruz公司)或pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液(用于CD3、HER2及Ki-67染色，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)中高溫高壓3 min；3% H2O2作用10 min。一抗分別為兔抗人PD-L1單克隆抗體(克隆號SP142，1 ∶100稀釋，美國Roche公司)，兔抗人HER2單克隆抗體(克隆號4B5，1 ∶100稀釋，美國Roche公司)，兔抗人CD3多克隆抗體(1 ∶100稀釋, Dako公司)及鼠抗人Ki-67單克隆抗體(克隆號MIB-1，1 ∶300稀釋，Dako公司)。一抗37 ℃孵育1 h及PV-6000二抗室溫孵育1 h后顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)顯色。設(shè)置陽性、陰性對照及空白對照。HER2免疫組化染色結(jié)果評判為2+的病例進一步行熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)檢測；采用Path-Vysion HER-2 DNA 探針(美國Abbott公司)，按照試劑盒說明操作以評估HER2基因狀態(tài)。

1.3 免疫組化染色結(jié)果評價由2位?？撇±磲t(yī)師分別觀察評價TC及腫瘤間質(zhì)免疫細胞(immune cell, IC)SP142-PD-L1染色情況，其中IC定義為分布于腫瘤內(nèi)及腫瘤-間質(zhì)交界區(qū)的免疫細胞。SP142-PD-L1陽性細胞定義為細胞膜和(或)細胞質(zhì)出現(xiàn)明確的黃色至棕褐色顆粒。結(jié)果評價標準如下：① TC PD-L1染色：每張切片計數(shù)至少100個可評價的TC，計算陽性細胞百分比；同時評價染色強度，無著色為0，淡黃色為1+，棕黃色為2+，棕褐色為3+。染色強度為2+或3+且陽性細胞百分比 > 10%定義為陽性病例；染色強度3+且陽性細胞比例> 50%定義為PD-L1高表達(PD-L1 TCHigh)[6]。② IC PD-L1染色：按照上述IC定義計數(shù)至少100個細胞并計算陽性細胞百分比，評分如下，<1%為0，≥1%且<5%為1+，≥5%且<10%為2+， ≥10%為3+；1+定義為PD-L1低表達(PD-L1 ICLow)，2+或3+定義為PD-L1高表達(PD-L1 ICHigh)[7]。TC Ki-67染色結(jié)果評價：計數(shù)至少100個活的TC，計算Ki-67陽性細胞百分比，定義為Ki-67指數(shù)。將Ki-67指數(shù)分為4個亞組，分別為<25%，≥25%且<50%，≥50%且<75%及≥75%。

1.4 腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes，TIL)評價以腫瘤內(nèi)及緊鄰腫瘤旁間質(zhì)內(nèi)浸潤的CD3+ T細胞代表TIL[8]。TIL浸潤程度按如下標準評分：0(無CD3+ T細胞浸潤或僅有少量細胞局灶散在浸潤)，1(少量CD3+ T細胞局灶聚集性浸潤)，2(比評分1顯著的中等數(shù)量CD3+ T細胞浸潤)，3(不可計數(shù)的大量CD3+ T細胞呈彌漫性或巢團狀顯著浸潤)[9]。評分2或3定義為TIL活躍，評分0或1定義為TIL不活躍。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。所有計數(shù)資料均以絕對數(shù)及百分比表示，相關(guān)性分析采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。所有檢驗均為雙側(cè)檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDGA中PD-L1表達及其定義的PDGA亞型PDGA中TC及IC均可表達PD-L1，而非腫瘤性胃黏膜中PD-L1不表達。本研究中TC的PD-L1表達率為36.81%(60/163)，其中高表達者(TCHigh)為17.79%(29/163)，低表達者(TCLow)為19.02%(31/163)。IC的PD-L1表達率為99.39%(162/163)，其中高表達者(ICHigh)為39.27%(64/163)，低表達者(ICLow)為60.12%(98/163)。本研究在TC PD-L1陽性表達亞組中：① 按照TC及IC PD-L1表達水平高低定義了4種PDGA亞型，分別為TCHighICHigh型(33.33%，20/60)，TCHighICLow型(15.00%，9/60)，TCLowICHigh型(26.67%，16/60)及TCLowICLow型(25.00%，15/60)；② 依據(jù)既往研究[8,10]，按照TC PD-L1表達水平及TIL浸潤程度定義了4種PDGA亞型(圖1)，分別為Ⅰ型(40.00%，24/60)，表現(xiàn)為TC PD-L1高表達且TIL活躍；Ⅱ型(13.33%，8/60)，表現(xiàn)為TC PD-L1低表達且TIL不活躍；Ⅲ型(8.33%，5/60)，表現(xiàn)為TC PD-L1高表達且TIL不活躍；Ⅳ型(38.34%，23/60)，表現(xiàn)為TC PD-L1低表達且TIL活躍。

2.2 PDGA中PD-L1高/低表達與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性TC PD-L1陽性表達亞組分析顯示，PD-L1 TCHigh與PDGA組織學(xué)亞型(P<0.01)、脈管及神經(jīng)受累情況(P<0.05)之間具有相關(guān)性。PD-L1 TCHigh常見于形態(tài)學(xué)為實性型、存在脈管及神經(jīng)侵犯的PDGA。IC PD-L1陽性表達亞組分析顯示，PD-L1 ICHigh與腫瘤大小(P<0.05)、 組織學(xué)亞型(P<0.05)、pTNM分期(P<0.01)、脈管受累情況(P<0.01)、神經(jīng)受累情況(P<0.05)、腫瘤出芽(P<0.01)及TIL浸潤程度(P<0.01)之間均存在相關(guān)性。PD-L1 ICHigh常見于腫瘤較大(直徑≥5 cm)、高pTNM分期、形態(tài)學(xué)為實性型、存在脈管侵犯、神經(jīng)侵犯、可見腫瘤出芽及顯著TIL的PDGA(表1、圖1)。

圖1 PDGA中SP142-PD-L1表達及CD3+ TIL特征A：實性型PDGA中PD-L1 TCHigh×200；B：PD-L1 ICHigh及TCHigh(箭頭所示)×200；C：CD3+ TIL活躍(評分3)×100；D：CD3+ TIL不活躍(評分1)×100；E：Ⅰ型PDGA ×100；F：Ⅳ型PDGA×100

表1 SP142-PD-L1+ PDGA中PD-L1高/低表達與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性[n(%)]

2.3 TC及IC PD-L1表達定義的PDGA亞型與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性在TC PD-L1陽性表達亞組中，依據(jù)TC及IC PD-L1表達水平將PDGA分為4種亞型，分析顯示不同亞型與不同的臨床病理學(xué)特征之間存在相關(guān)性(表2)。具體如下：① TCHighICHigh型多見于組織形態(tài)學(xué)為實性型、存在脈管侵犯及腫瘤出芽的PDGA；② TCLowICHigh型多見于組織形態(tài)學(xué)為非實性型的PDGA；③ TCLowICLow型多見于不伴有遠處轉(zhuǎn)移、無脈管侵犯及腫瘤出芽的PDGA；④ TCHighICLow型與本研究涉及的臨床病理學(xué)特征均無相關(guān)性。

表2 TC及IC PD-L1表達定義的PDGA亞型與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性[n(%)]

2.4 TC PD-L1及TIL定義的PDGA亞型與臨床

病理學(xué)特征的相關(guān)性在TC PD-L1陽性表達亞組中，本研究依據(jù)TC PD-L1表達水平及TIL浸潤程度定義了4種PDGA亞型，分析顯示不同亞型與不同的臨床病理學(xué)特征之間存在相關(guān)性(表3、圖1)。具體如下：① Ⅰ型多見于組織形態(tài)學(xué)為實性型及存在脈管侵犯的PDGA；② Ⅳ型多見于位于賁門或胃竇、組織形態(tài)學(xué)為非實性型及無脈管侵犯的PDGA；③ Ⅱ型及Ⅲ型與本研究涉及的臨床病理學(xué)特征均無相關(guān)性。

表3 TC PD-L1表達及TIL定義的PDGA亞型與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性[n(%)]

3 討論

本研究結(jié)果顯示PDGA中TC PD-L1表達率低于既往在未經(jīng)選擇的GC中報道的表達率[11]，同時顯示IC PD-L1表達率明顯高于TC。本研究顯示PDGA中PD-L1表達具有如下特征：① 腫瘤間質(zhì)IC PD-L1表達較多見；② PDGA中TC及IC PD-L1均高表達較常見，提示PDGA患者可能從抗PD-1/PD-L1治療中獲益。本研究為在PDGA中進行抗PD-1/ PD-L1治療探索提供了依據(jù)。

PD-L1表達亞組中的分析結(jié)果顯示PDGA中PD-L1 TCHigh同時ICHigh者多見于組織學(xué)形態(tài)為實性型的腫瘤，這與少數(shù)已有的研究結(jié)果一致[12]。分析同時顯示TC及IC PD-L1高表達分別與不同的臨床病理特征相關(guān)，并且多為高危型特征，提示PD-L1高表達可能預(yù)示PDGA預(yù)后不良，同時提示TC及IC PD-L1表達的生物學(xué)意義可能也存在差異。目前GC中PD-L1表達的預(yù)后價值尚存在爭議，推測不同GC亞群中PD-L1表達的預(yù)后意義可能不同[13]。僅單獨分析TC或IC PD-L1表達也是導(dǎo)致研究結(jié)果不一致的原因之一，本研究認為在PDGA中同時評價TC及IC PD-L1表達可能更具臨床意義。

有研究[14]認為PDGA是一組異質(zhì)性腫瘤，并依據(jù)組織學(xué)特征進行了分型，本研究則初步探討了PD-L1在PDGA分型中的意義。在TC PD-L1表達亞組中，按照TC及IC PD-L1表達水平定義了4種亞型。結(jié)果顯示TCHighICHigh亞型最常見，并且該亞型多見于實性型、存在脈管侵犯及腫瘤出芽的PDGA。腫瘤出芽是胃腺癌預(yù)后不良因素[15]，因此提示TCHighICHigh型PDGA預(yù)后不良，同時也提示具有實性型組織學(xué)特征的PDGA中更易出現(xiàn)PD-L1高表達，因此在高效篩選可接受免疫治療的PDGA患者時具有應(yīng)用意義。本研究顯示TCLowICLow型多見于無腫瘤出芽等特征的PDGA，提示該型可能預(yù)后較好。以上結(jié)果顯示聯(lián)合評價TC及IC PD-L1表達時提示PD-L1表達與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)特征之間存在相關(guān)性，因此推測聯(lián)合評價及分型可預(yù)示PDGA是否易于轉(zhuǎn)移，因此在預(yù)后評估中更具應(yīng)用價值。

有研究顯示GC中PD-L1表達與CD3+ TIL活躍相關(guān)[12]，本研究結(jié)果與之基本一致，提示腫瘤微環(huán)境特征可能會影響PDGA中PD-L1表達。有研究[10]依據(jù)PD-L1及TIL進行腫瘤分型，另有研究[8]在GC中根據(jù)SP142-PD-L1及CD8+ T細胞進行腫瘤分型，結(jié)果均顯示腫瘤預(yù)后與亞型相關(guān)。本研究中定義了4種PDGA亞型，結(jié)果顯示Ⅰ型及Ⅳ型常見。Ⅰ型表現(xiàn)為TC PD-L1高表達且TIL活躍，研究顯示具有此特征的黑色素瘤可從抗PD-1/ PD-L1治療中獲益，并認為此亞型中TME可能是誘導(dǎo)TC PD-L1表達的主要因素[10]。既往研究[8]將PD-L1高表達及CD8+ TIL活躍的GC定義為I型，并發(fā)現(xiàn)該型GC預(yù)后最好。而本研究中定義的Ⅰ型腫瘤多見于存在脈管侵犯的PDGA，提示可能預(yù)后不佳。本研究入組均為PDGA且以CD3+ TIL作為分型標志物可能是導(dǎo)致結(jié)果不一致的原因之一。本研究中Ⅳ型腫瘤多見于無脈管侵犯的PDGA，提示此型PDGA可能預(yù)后較好。PD-L1及CD3+ TIL是臨床實踐中易于評估的標志物，本研究提示綜合評價兩者可將具有不同預(yù)后特征的PDGA加以區(qū)分。

PDGA是GC的獨特亞群，本研究顯示PDGA中TC及IC PD-L1表達各具臨床意義；依據(jù)TC及IC PD-L1表達以及同時分析PD-L1表達和CD3+ TIL均可區(qū)分出具有不同生物學(xué)特點及預(yù)后特征的PDGA亞型。本研究進一步證實PDGA為一組異質(zhì)性腫瘤，基于PD-L1表達的腫瘤分型具有潛在臨床意義。