雌激素對(duì)雌鼠抑郁樣行為和海馬BDNF表達(dá)的影響

劉 晶，吳 敏，孟凡濤，代娟娟，劉翠蘭，胡鳳愛，李 晨

抑郁癥是一種嚴(yán)重的精神疾病。女性較男性而言抑郁癥患病率升高[1]。研究[2]報(bào)道女性一生都會(huì)經(jīng)歷雌激素水平的劇烈波動(dòng)，而這些變化都與抑郁相關(guān)，這表明卵巢激素可能在女性的壓力敏感性中發(fā)揮關(guān)鍵作用。卵巢激素可以在無壓力的情況下對(duì)應(yīng)激提供保護(hù)作用[3]，而在應(yīng)激壓力下，卵巢激素則能增加壓力敏感性[4]。多項(xiàng)報(bào)道[5-6]表明，雌激素替代療法在臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中均可產(chǎn)生抗抑郁作用。研究[7-9]報(bào)道前額葉皮層和海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)在抑郁癥發(fā)病和抗抑郁藥物治療中起著重要作用。研究[10-11]報(bào)道海馬腦區(qū)BDNF的表達(dá)量隨著性周期的變化而變化，但是其作用結(jié)果還存在差異。該研究利用雌激素補(bǔ)加的方法驗(yàn)證雌激素對(duì)BDNF mRNA的調(diào)節(jié)作用。該實(shí)驗(yàn)為研究抑郁癥發(fā)病和治療的性別差異機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只，SPF級(jí)C57BL/6雌鼠(體質(zhì)量20～25 g，10周齡)購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(魯)20140007]，自由飲水和飲食，環(huán)境溫度19～22 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物的處置均符合濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑 RNA提取試劑盒購于廣州Omega公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于大連Takara公司；RIPA裂解液購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒購于南京諾唯贊生物科技有限公司；雌激素(17β-Estradiol)和溶劑Sesame oil購于上海sigma公司；兔抗BDNF抗體購于英國abcam公司；鼠抗β-actin單克隆抗體(1 mg/ml)購于美國cell signaling technology公司；羊抗鼠二抗IR Dye800CW(1 mg/ml)和羊抗鼠二抗IR Dye680 LT(1 mg/ml)均購于美國Li-COR公司。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)步驟及分組 實(shí)驗(yàn)①：20只C57BL/6雌鼠隨機(jī)均分為2組，分別用瑞氏染色法連續(xù)測(cè)定小鼠性周期8 d(2個(gè)完整性周期)，第9天測(cè)定具體性周期后，測(cè)雌鼠強(qiáng)迫游泳抑郁樣行為，小鼠斷頭后取組織。實(shí)驗(yàn)②：16只C57BL/6雌鼠隨機(jī)均分為2組，1組為假手術(shù)組，1組為卵巢摘除組。手術(shù)2周后，先測(cè)定基礎(chǔ)條件下糖水偏好抑郁樣行為，給予小鼠3-day慢性不可預(yù)知應(yīng)激(3 day chronic unpredictable stress, 3 d CUS)，再測(cè)定糖水偏好抑郁樣行為。實(shí)驗(yàn)③：21只C57BL/6雌鼠隨機(jī)均分為3組，一組為假手術(shù)組，第二組為卵巢摘除組，第三組也為卵巢摘除組；手術(shù)2周后第一組背部皮下注射溶劑對(duì)照Sesame oil，第二組背部皮下注射溶劑對(duì)照Sesame oil，第三組背部皮下注射17β-Estradiol(10 mg/kg)，連續(xù)3 d，同時(shí)給予3組小鼠3 d CUS，最后一次注射完成后測(cè)定小鼠糖水偏好和強(qiáng)迫游泳行為，然后小鼠斷頭取組織。

1.2.2動(dòng)物模型制備 采用400 mg/kg水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，小鼠采用仰臥位，手術(shù)部位采用碘伏消毒，在臍與恥骨前緣中點(diǎn)處沿腹底壁正中線切開皮層1～2 cm，沿皺襞切開腹白線及腹膜進(jìn)入腹腔，在切口下方找到子宮體及一側(cè)子宮角，沿子宮角向前導(dǎo)出卵巢后摘除卵巢，同法摘除另側(cè)卵巢；將子宮復(fù)位后關(guān)腹，縫合完畢后皮下注射青霉素，預(yù)防感染。在術(shù)中及術(shù)后注意小鼠保溫。其中為摘除卵巢的手術(shù)小鼠作為假手術(shù)對(duì)照。

1.2.3瑞氏染色法測(cè)定小鼠性周期 小鼠陰道涂片自然干燥后滴加瑞氏染劑數(shù)滴， 放置濕盒中靜置1 min；加相當(dāng)于染液1.5倍的磷酸鹽緩沖液與染液混勻，保持約10 min；流水沖洗， 干燥，封片，鏡檢。

1.2.43 d CUS 慢性應(yīng)激步驟參考已發(fā)表文章[12]的方法，每天上下午給予以下刺激中的任何一種，持續(xù)3 d：束縛2、24 h光照、電擊10 min(0.3 mA電擊2 s，間歇16 s，共10 min)、夾尾15 min、高臺(tái)30 min、24 h濕盒。

1.2.5糖水偏好試驗(yàn) 測(cè)定前剝奪飲水4 h，2個(gè)相同的水瓶分別放置鼠籠的兩側(cè)，水瓶內(nèi)分別裝有1%蔗糖水與飲用水，測(cè)定12 h內(nèi)小鼠糖水和水的消耗量，糖水偏好用糖水溶液消耗量所占總液體消耗量的百分比來表示。

1.2.6強(qiáng)迫游泳試驗(yàn) 小鼠置于透明樹脂水桶中(高度30 cm，直徑10 cm)，往圓筒中注入深度為15 cm，溫度為24 ℃的自來水，強(qiáng)迫游泳6 min，記錄小鼠后4 min內(nèi)靜止不動(dòng)的時(shí)間。小鼠在水面漂浮，僅有為保持呼吸和保持頭部在水面上的輕微運(yùn)動(dòng)狀態(tài)定義為靜止不動(dòng)。

1.2.7RNA提取和Real-time PCR 利用RNA提取試劑盒提取海馬總RNA，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，20 μl反應(yīng)體系，具體反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，并建立溶解曲線。引物序列如下：總BDNF mRNA：上游引物：5′-GCGCCCATGAAAGAAGTAAA-3′，下游引物：5′-TCGTCAGACCTCTCGAACCT-3′；Actin：上游引物：5′-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3′，下游引物：5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3′。

1.2.8Western blot 小鼠經(jīng)斷頭并在冰上迅速分離海馬，置液氮中速凍，- 80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ〕龊ｑR并經(jīng)RIPA裂解液裂解，經(jīng)BCA法測(cè)定蛋白濃度，樣品經(jīng)SDS-PAGE膠分離，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5 %脫脂奶粉封閉，加入兔抗BDNF(1 ∶1 000)和鼠抗β-actin一抗(1 ∶1 000)過夜孵育，加入羊抗鼠二抗IR Dye800CW或羊抗鼠二抗IR Dye680 LT熒光二抗(1 ∶5 000)孵育1 h，經(jīng)雙紅外激光成像系統(tǒng)成像并識(shí)別灰度進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 雌鼠不同性周期抑郁樣行為雌性小鼠進(jìn)行陰道涂片檢查，鏡檢結(jié)果顯示：小鼠處于發(fā)情前期時(shí)，陰道分泌物中有大的、圓的、有核上皮細(xì)胞。小鼠處于發(fā)情間期時(shí)，陰道分泌物有大量小的白細(xì)胞，少量有核上皮細(xì)胞和角質(zhì)化上皮細(xì)胞(圖1A)。2 h后進(jìn)行強(qiáng)迫游泳行為測(cè)定，結(jié)果顯示發(fā)情間期時(shí)小鼠的不動(dòng)時(shí)間多于發(fā)情前期 (t=2.43,P<0.05)(圖1B)。

圖1 雌鼠發(fā)情前期和間期陰道涂片瑞氏染色圖和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ×200A：陰道涂片瑞氏染色圖(空心三角形：有核上皮細(xì)胞；實(shí)心三角形：白細(xì)胞；黑色：無核鱗狀上皮細(xì)胞)；B：強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)；與發(fā)情前期比較：*P<0.05

2.2 雌鼠發(fā)情前期和間期海馬BDNF mRNA和蛋白表達(dá)量BDNF mRNA檢測(cè)結(jié)果顯示，與發(fā)情前期組相比，發(fā)情間期組雌鼠BDNF mRNA表達(dá)量降低(t=3.96，P<0.05)(圖2A)。BDNF蛋白Western blot和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示(圖2B)，發(fā)情間期組BDNF蛋白表達(dá)量低于發(fā)情前期(P<0.05，t=3.04)。Shapiro-Wilk檢驗(yàn)各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布(P<0.05)。

圖2 雌鼠發(fā)情前期和間期海馬BDNF mRNA和蛋白表達(dá)水平A: BDNF mRNA水平；B: BDNF蛋白水平Western blot檢測(cè)；與發(fā)情前期比較：*P<0.05

2.3 雌激素剝奪后對(duì)雌鼠抑郁樣行為和應(yīng)激易感性的影響糖水偏好行為結(jié)果顯示：在基礎(chǔ)條件下，與假手術(shù)組相比，雌激素剝奪后(卵巢摘除)糖水偏好值沒有變化(t=0.75，P> 0.05)(圖3A)。然后，給予小鼠3 d CUS，與假手術(shù)組相比，雌激素剝奪后糖水偏好值下降(t=3.60,P<0.05)(圖3B)。

圖3 雌激素剝奪后基礎(chǔ)和應(yīng)激條件下糖水偏好結(jié)果A: 無應(yīng)激條件下糖水偏好值；B: 應(yīng)激條件下糖水偏好值；與假手術(shù)組比較：*P<0.05

2.4 雌激素對(duì)應(yīng)激狀態(tài)下雌激素剝奪誘導(dǎo)的抑郁樣行為的翻轉(zhuǎn)作用應(yīng)激狀態(tài)下雌激素剝奪和雌激素補(bǔ)加對(duì)糖水偏好值有影響(F=5.57，P<0.05)(圖4A)，進(jìn)一步比較分析結(jié)果顯示與假手術(shù)組相比，應(yīng)激狀態(tài)下雌激素剝奪能降低糖水偏好值(P<0.05)，而雌激素外源性補(bǔ)加能恢復(fù)糖水偏好值的降低(P<0.05)(圖4A)。應(yīng)激狀態(tài)下雌激素剝奪和雌激素補(bǔ)加對(duì)糖水偏好值有影響，(F=6.38，P<0.01)(圖4B)，進(jìn)一步比較分析結(jié)果顯示與假手術(shù)組相比，應(yīng)激狀態(tài)下雌激素剝奪能增加不動(dòng)時(shí)間(P<0.05)，而雌激素外源性補(bǔ)加能恢復(fù)不動(dòng)時(shí)間的增加(P<0.05)(圖4B)。Shapiro-Wilk檢驗(yàn)各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布(P> 0.05)。

圖4 應(yīng)激狀態(tài)下雌激素剝奪和補(bǔ)加對(duì)抑郁性行為的影響A：糖水偏好；B：強(qiáng)迫游泳; a：假手術(shù)+溶劑對(duì)照組；b：卵巢摘除+溶劑對(duì)照組；c：卵巢摘除+雌激素注射組；與假手術(shù)+溶劑對(duì)照組比較：*P<0.05；與卵巢摘除+溶劑對(duì)照組比較：#P<0.05

2.5 應(yīng)激狀態(tài)下雌激素剝奪和補(bǔ)加對(duì)海馬BDNF mRNA表達(dá)的影響OVX 14 d后和雌激素補(bǔ)加對(duì)海馬BDNF mRNA的表達(dá)有影響(F=5.12，P<0.05)(圖5)，進(jìn)一步比較分析結(jié)果顯示與假手術(shù)組相比，OVX能降低海馬BDNF mRNA的表達(dá)(P<0.05)，而雌激素外源性補(bǔ)加能恢復(fù)海馬BDNF mRNA表達(dá)的降低(P<0.05)(圖5)。Shapiro-Wilk檢驗(yàn)各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布(P> 0.05)。

圖5 應(yīng)激狀態(tài)下雌激素剝奪和補(bǔ)加對(duì)海馬BDNF mRNA表達(dá)的影響a：假手術(shù)+溶劑對(duì)照組；b：卵巢摘除+溶劑對(duì)照組；c：卵巢摘除+雌激素注射組；與假手術(shù)+溶劑對(duì)照組比較：*P<0.05；與卵巢摘除+溶劑對(duì)照組比較：#P<0.05

3 討論

大量臨床和臨床前研究表明絕經(jīng)期女性或雌性罹患抑郁癥的概率明顯增加，人們普遍認(rèn)為在很大程度上是由于性腺激素的變化所造成[13]。在雌雄性腺所分泌的激素中，雌激素是其中較為重要的一種。雌激素水平的劇烈變化，如發(fā)生在手術(shù)和(或)自然絕經(jīng)期，與焦慮和抑郁的發(fā)生率和癥狀學(xué)的變化有關(guān)[13]。文獻(xiàn)[14]報(bào)道處于發(fā)情周期中雌激素水平較低的發(fā)情間期的大鼠在強(qiáng)迫游泳行為中表現(xiàn)出抑郁樣行為，但是其具體機(jī)制尚不清楚，本研究表明小鼠發(fā)情周期中雌激素水平較低的發(fā)情間期海馬BDNF的表達(dá)量明顯低于雌激素水平較高的發(fā)情前期，而BDNF作為一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制和抗抑郁治療中起重要作用，因此BDNF隨著發(fā)情周期的變化而發(fā)生的變化可能是不同發(fā)情周期抑郁樣行為的原因。與男性相比，大多數(shù)類型的抑郁癥和焦慮癥在女性中發(fā)病率更高，這種對(duì)壓力產(chǎn)生的心理和生理后果的敏感性在青春期開始時(shí)增強(qiáng)，并一直持續(xù)到更年期，這表明卵巢激素可能在女性的這種增強(qiáng)的壓力敏感性中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[1]。有研究[15]表明雌激素的缺乏能降低大鼠在對(duì)應(yīng)激條件下中央杏仁核的敏感的細(xì)胞因子和腎上腺素反應(yīng)。本研究表明OVX小鼠在基礎(chǔ)條件下糖水偏好實(shí)驗(yàn)未表現(xiàn)出抑郁樣表型，說明雌激素在無壓力的情況對(duì)抑郁行為沒有影響，但是如果給予OVX小鼠CUS刺激，OVX小鼠的則表現(xiàn)出抑郁樣表型，說明雌激素的缺乏介導(dǎo)了對(duì)應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁行為的易感性。大量研究[16]報(bào)道雌激素能調(diào)控海馬腦區(qū)BDNF的表達(dá)，但是都存在BDNF檢測(cè)方法特異性和準(zhǔn)確性不完善的缺陷，以及雌激素給藥方式復(fù)雜和耗時(shí)的缺點(diǎn)，本文利用OVX和雌激素皮下注射方式結(jié)合行為學(xué)和Real-time PCR方法進(jìn)一步確認(rèn)雌激素缺乏在應(yīng)激條件下能導(dǎo)致抑郁樣行為和海馬BDNF mRNA表達(dá)的降低，而雌激素外源性補(bǔ)加則能翻轉(zhuǎn)抑郁樣行為和拯救BDNF mRNA表達(dá)的降低。目前雌激素調(diào)控BDNF mRNA表達(dá)的機(jī)制尚不清楚，其中雌激素受體β作為一種核受體可能通過修飾BDNF啟動(dòng)子調(diào)控BDNF mRNA的轉(zhuǎn)錄[17]。