GANT61通過(guò)減緩滑膜細(xì)胞增殖抑制Balb/c小鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)展

李向陽(yáng)，秦蘇萍，程萬(wàn)鵬，華 慧，于 倩，顏 超，鄭葵陽(yáng)，湯仁仙

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatioid arthritis,RA)是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為滑膜炎癥，滑膜細(xì)胞大量增殖，甚至出現(xiàn)“類(lèi)腫瘤樣增長(zhǎng)”，關(guān)節(jié)腫脹，畸形，功能受損甚至喪失[1]。據(jù)報(bào)道[2]，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎全世界發(fā)病率為0.5%～2%，尤其以女性居多。GANT61(Gli-ANTagonist 61)是一類(lèi)人工合成的小分子化合物，它可以通過(guò)影響膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因(glioma-associated oncogene,Gli)與DNA結(jié)合來(lái)選擇性地阻斷Gli介導(dǎo)的下游基因活化，是一種高度特異性的Hh-Gli信號(hào)通路下游阻斷劑。已有研究[3-4]證實(shí)GANT61在胰腺癌、前列腺癌等多種腫瘤及相應(yīng)細(xì)胞系的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中都具有較高的抑制細(xì)胞增殖與遷移的效應(yīng)。在小鼠關(guān)節(jié)炎模型中GANT61的作用尚未見(jiàn)報(bào)道，該實(shí)驗(yàn)探討了GANT61是否能夠通過(guò)抑制滑膜細(xì)胞增殖，減輕滑膜炎癥，從而改善關(guān)節(jié)功能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物18只7～8周齡雌性Balb/c小鼠，由徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑及儀器弗氏完全佐劑、GANT61均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；牛Ⅱ型膠原購(gòu)自美國(guó)Chondrex公司；CCK-8試劑盒、HE染色試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司；CFSE試劑、凋亡試劑盒均購(gòu)自美國(guó)ebioscience公司；anti-mouse CD45 APC-cy7、anti-mouse CD11b percpcy5.5、anti-mouse Ly6G APC、CBA試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱150i購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；正置顯微鏡BX51購(gòu)自日本奧林巴斯公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)分組及步驟 小鼠隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組(6只)，CIA組(6只)，GANT61組(6只)。將弗氏完全佐劑與牛Ⅱ型膠原等體積混勻后充分乳化，于CIA組及GANT61組小鼠尾根部皮內(nèi)多點(diǎn)注射，15 d后相同劑量加強(qiáng)免疫一次，隨后小鼠逐漸出現(xiàn)足爪紅腫，關(guān)節(jié)畸形，活動(dòng)受限等癥狀，具體方法參照本實(shí)驗(yàn)室研究方法及相關(guān)文獻(xiàn)[5]。GANT61組于第二次免疫后第0、3、6、9、12、15、18、21天尾靜脈注射GANT61，劑量為1 μmol/100 g鼠重。CIA組注射等劑量生理鹽水，正常對(duì)照組注射等劑量生理鹽水。

1.3.2關(guān)節(jié)評(píng)分 小鼠于第二次免疫后第7天開(kāi)始，每3 d檢測(cè)四肢關(guān)節(jié)及腳掌，對(duì)每一患病肢體進(jìn)行評(píng)分。0分(正常)；1分(輕微關(guān)節(jié)紅腫)；2分(中等程度的踝關(guān)節(jié)或腕關(guān)節(jié)紅腫)；3分(嚴(yán)重的腳掌及指關(guān)節(jié)紅腫)；4分(累積多關(guān)節(jié)的炎癥肢體)

1.3.3病理學(xué)檢查 于初免后第39天處死小鼠，包括正常對(duì)照組(正常小鼠，注射生理鹽水)、CIA組(牛Ⅱ型膠原免疫小鼠，誘發(fā)關(guān)節(jié)炎)、GANT61組(牛Ⅱ型膠原免疫小鼠誘發(fā)關(guān)節(jié)炎后，注射藥物GANT61)。將小鼠一側(cè)患肢(后肢)浸泡于4%多聚甲醛固定5 d，剝除皮膚，12.5% EDTA脫鈣液連續(xù)脫鈣4周，隔天換液1次。石蠟包埋，病理切片，HE染色。另一側(cè)患肢(后肢)，用于分離滑膜細(xì)胞。

1.3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中性粒細(xì)胞變化 取各組小鼠外周血100 μl，經(jīng)anti-mouse CD45 APC-cy7、anti-mouse CD11b percpcy5.5、anti-mouse Ly6G APC染色后，裂紅，洗滌，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.3.5流式CBA法檢測(cè)細(xì)胞因子 取各組小鼠血清50 μl，運(yùn)用流式CBA法檢測(cè)炎癥因子白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、γ干擾素(interferon-gamma，IFN-γ)、腫瘤壞死因子 (tumor necrosis factor, TNF)-α變化，運(yùn)用FACP軟件分析相應(yīng)炎癥因子含量。

1.3.6滑膜細(xì)胞分離 參照本實(shí)驗(yàn)室方法[5]，剪開(kāi)皮膚肌肉層暴露膝關(guān)節(jié)并取出滑膜組織，無(wú)菌DMEM培養(yǎng)基清洗2次，剪成2～3 mm3的組織塊，放于培養(yǎng)板中培養(yǎng)。中間換液1次，7 d后去除組織塊，可得到原代滑膜成纖維細(xì)胞。取第3代細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞。其中GANT61組培養(yǎng)基中加入GANT61濃度為10 μmol/L。

1.3.7CFSE檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 各組取第3代細(xì)胞經(jīng)消化后，PBS重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為(4～5)×106個(gè)/ml；加入終濃度為1 μmol/L的CFSE，混勻，37 ℃染色10 min后，洗滌2次，DMEM培養(yǎng)基重懸，將細(xì)胞懸液加入24孔板中，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3 d后取細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖。

1.3.8CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 各組取第3代細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，將細(xì)胞懸液加入48孔板中，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，同時(shí)加入CCK-8試劑10 μl，培養(yǎng)3 h后酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm吸光值。

1.3.9流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取各組3代細(xì)胞經(jīng)消化后，PBS重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×105個(gè)/ml，經(jīng)Annexin-V/7AAD染色后檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1 關(guān)節(jié)腫脹程度及病理觀(guān)察正常小鼠關(guān)節(jié)無(wú)腫脹，活動(dòng)良好(圖1A)，關(guān)節(jié)無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)血管翳形成，關(guān)節(jié)腔正常(圖1D)。CIA小鼠關(guān)節(jié)腫脹，活動(dòng)受限(圖1B)，關(guān)節(jié)周?chē)罅垦装Y細(xì)胞浸潤(rùn)，血管翳形成(圖1E)。GANT61組小鼠關(guān)節(jié)腫脹程度減輕(圖1C)，炎癥細(xì)胞減少，未見(jiàn)血管翳形成(圖1F)。

圖1 小鼠關(guān)節(jié)狀態(tài)及病理學(xué)觀(guān)察 HE染色×100A：正常對(duì)照組小鼠；B：CIA組小鼠；C：GANT61組小鼠；D：正常對(duì)照組小鼠踝關(guān)節(jié)病理圖；E：CIA組小鼠踝關(guān)節(jié)病理圖；F：GANT61組小鼠踝關(guān)節(jié)病理圖

2.2 小鼠關(guān)節(jié)評(píng)分從初免后第21天，CIA小鼠關(guān)節(jié)評(píng)分逐漸增加，GANT61組關(guān)節(jié)評(píng)分低于CIA組；同時(shí)GANT61組從第24天開(kāi)始關(guān)節(jié)評(píng)分呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。見(jiàn)圖2。

圖2 小鼠關(guān)節(jié)臨床評(píng)分與CIA組比較：##P<0.01；與正常對(duì)照組比較：**P<0.01

2.3 中性粒細(xì)胞CIA組小鼠中性粒細(xì)胞數(shù)量高于正常對(duì)照組；與CIA組相比，GANT61組中性粒細(xì)胞數(shù)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中性粒細(xì)胞變化A：中性粒細(xì)胞散點(diǎn)圖；B：中性粒細(xì)胞統(tǒng)計(jì)圖；與CIA組比較：#P<0.05

2.4 細(xì)胞因子CIA組細(xì)胞因子包括IFN-γ、IL-6、TNF-α濃度升高。GANT61組細(xì)胞因子IFN-γ、IL-6、TNF-α低于CIA組，并且以IL-6及TNF-α變化最大。見(jiàn)圖4。

圖4 CBA法檢測(cè)細(xì)胞因子與CIA組比較：#P<0.05；##P<0.01

2.5 CFSE檢測(cè)細(xì)胞增殖情況CIA組滑膜成纖維細(xì)胞大量增殖，其熒光強(qiáng)度小于GANT61組及正常對(duì)照組。GANT61組熒光強(qiáng)度雖然低于正常對(duì)照組，但是高于CIA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖5。

圖5 CFSE法檢測(cè)細(xì)胞增殖A：細(xì)胞熒光強(qiáng)度流式圖；B：各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)圖；與CIA組比較：##P<0.01

2.6 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況CIA組滑膜成纖維細(xì)胞大量增殖，其OD450高于GANT61組及正常對(duì)照組。GANT61組熒光強(qiáng)度雖然高于正常對(duì)照組，但是低于CIA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

圖6 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖與CIA組比較：#P<0.05；與正常對(duì)照組比較：*P<0.05

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡CIA組及正常對(duì)照組細(xì)胞凋亡率較低，但是GANT61組細(xì)胞凋亡率升高，高于CIA組及正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖7。

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡A：正常對(duì)照組；B：CIA組；C：GANT61組；D：細(xì)胞凋亡統(tǒng)計(jì)圖；與CIA組比較：##P<0.01；與正常對(duì)照組比較：**P<0.01

3 討論

RA以關(guān)節(jié)組織慢性炎癥為特征，主要影響對(duì)稱(chēng)性手足小關(guān)節(jié)，受累關(guān)節(jié)疼痛，腫脹，功能受限；持續(xù)的關(guān)節(jié)滑膜炎癥，過(guò)度增殖的滑膜細(xì)胞與小血管形成血管翳，同時(shí)大量的膠原酶及蛋白酶破壞軟骨及骨組織，關(guān)節(jié)遭受破壞，功能受損，最終可造成關(guān)節(jié)畸形。

Hedgehog-Gli(Hh-Gli)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化過(guò)程中起著重要的作用，其信號(hào)傳導(dǎo)途徑為Hh-Ptch-Smo-Gli，其異常激活與腫瘤細(xì)胞的增殖分化、細(xì)胞凋亡、血管新生、侵襲轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[6]；此外Hedgehog信號(hào)通路在調(diào)節(jié)骨骼的發(fā)育以及修復(fù)過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。Hedgehog信號(hào)通路的紊亂不但常常引起骨骼系統(tǒng)的疾病，同時(shí)在非骨骼系統(tǒng)也會(huì)有所表現(xiàn)[7]。GANT61是Hedgehog信號(hào)通路的抑制劑，它可以抑制Hh-Gli信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄因子Gli與DNA結(jié)合進(jìn)而阻斷下游基因的活化，是一種高度特異性的Hh-Gli信號(hào)通路阻斷劑。前期研究[8-9]結(jié)果亦提示Hh-Gli通路參與了大鼠RA-SF的活化及增殖，GANT61可通過(guò)促進(jìn)RA-SF細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制其增殖。

本文以CIA小鼠模型為研究對(duì)象，通過(guò)尾靜脈連續(xù)多次給予GANT61，觀(guān)察其對(duì)小鼠RA的影響。從初次免疫后15 d開(kāi)始，每3 d給藥1次，觀(guān)察測(cè)量關(guān)節(jié)變化并進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果表明，GANT61可以減輕關(guān)節(jié)腫脹程度，降低關(guān)節(jié)臨床評(píng)分。病理結(jié)果顯示，GANT61可以減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，抑制血管翳的形成，改善關(guān)節(jié)功能。

中性粒細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，在血液中含量最為豐富，在機(jī)體感染、炎癥狀態(tài)時(shí)，可以被快速募集到炎癥區(qū)域，發(fā)揮重要作用。在關(guān)節(jié)炎病人中，滑膜液中中性粒細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到90%。此外在關(guān)節(jié)囊及血管翳中也有大量的中性粒細(xì)胞，對(duì)關(guān)節(jié)炎的發(fā)展有著重要的作用[10-11]。本實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用GANT61后可以降低中性粒細(xì)胞的數(shù)量，減輕滑膜炎癥狀態(tài)。

細(xì)胞因子在關(guān)節(jié)炎的發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，重要的細(xì)胞因子有TNF-α、IL-6、IFN-γ等[12]，這些細(xì)胞因子與免疫細(xì)胞T細(xì)胞、B細(xì)胞相互作用，加速了滑膜炎癥及軟骨和骨質(zhì)的破壞。在Hedgehog-Gli信號(hào)傳導(dǎo)途徑中，給予外源性的Hh分子可以促進(jìn)CD4+T細(xì)胞分泌IL-2，IFN-γ和IL-10[13]；Gli1的部分缺失可以下調(diào)IL-6、IL-8以及MCP-1的表達(dá)[14]。本實(shí)驗(yàn)在運(yùn)用GANT61后，炎癥因子IFN-γ、TNF-α、IL-6含量有所下降，雖然仍高于正常對(duì)照組，但是已經(jīng)低于CIA模型組，小鼠炎癥狀態(tài)有所減輕。

進(jìn)一步分析GANT61對(duì)小鼠滑膜細(xì)胞增殖和凋亡的影響；流式細(xì)胞術(shù)及CCK-8結(jié)果均表明GANT61可以抑制滑膜細(xì)胞的增殖。Hh-Gli信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖，當(dāng)SHH被活化以后，會(huì)加速G1-S期的進(jìn)程，細(xì)胞增殖程度升高。當(dāng)SHH被抑制以后，細(xì)胞增殖程度降低[15]。運(yùn)用凋亡檢測(cè)試劑盒，經(jīng)流式檢測(cè)，結(jié)果表明GANT61可以促進(jìn)滑膜細(xì)胞的凋亡。