HtrA對乳牙高致齲性變異鏈球菌生物膜形成的影響

徐仕珍，楊維虹,毛 玲,劉興容

齲病的發(fā)生發(fā)展就是從獲得性膜的形成、細菌黏附、牙菌斑生物膜形成到引起牙齒的顏色、形態(tài)和質(zhì)地發(fā)生損害性改變，其中牙菌斑生物膜的形成與齲病發(fā)生密切相關(guān)[1]。變異鏈球菌(Streptococcusmutans,S.mutans)是造成齲病的最主要的細菌[2]，其致齲性毒力作用基礎(chǔ)包括產(chǎn)酸和耐酸、定植牙面形成生物膜及合成胞內(nèi)外多糖能力[3]。高溫需要蛋白A (high temperature requirement A，HtrA)是細菌體內(nèi)的一種熱休克蛋白質(zhì)分子，能夠幫助細菌逃避高溫、高滲和高氧濃度等環(huán)境的變化[4-5]。Gasc et al[6-8]首次在肺炎鏈球菌中發(fā)現(xiàn)了HtrA,并發(fā)現(xiàn)其參與控制多種細菌毒力因子的表達。課題組前期實驗[9]發(fā)現(xiàn)HtrA對變異鏈球菌的耐酸和黏附有重要調(diào)控作用。該實驗旨在利用乳牙高致齲性的HtrA基因缺陷株，探討HtrA的缺失對S.mutans生物膜的影響，為齲病的防治提供新的著手點。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株乳牙S.mutansHtrA高毒力株與缺陷株由課題組前期獲得；S.mutans國際標準株UA159自四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院國家重點實驗室獲得。

1.2 主要實驗試劑MS固體培養(yǎng)基(美國BD公司)；BHI培養(yǎng)基(青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司)；甘露糖、蜜二糖、棉子糖、山梨醇、精氨酸雙水解酶肉湯細菌微量生化鑒定管、七葉苷培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1S.mutans的復(fù)蘇與培養(yǎng) UA159標準株、HtrA高毒力株與基因缺陷株復(fù)蘇經(jīng)生化鑒定后接種于MS固體培養(yǎng)基，37 ℃厭氧(80% N2、10% H2、10% CO2)培養(yǎng)48 h。

1.3.2S.mutans體外非應(yīng)激環(huán)境下[37 ℃、厭氧(80% N2、10% H2、10% CO2)]的生長曲線測定 挑選3個菌株的單菌落至BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h；離心，棄上清液，無菌生理鹽水漂洗，重復(fù)3次；加入BHI溶液稀釋菌液，調(diào)節(jié)3組菌懸液使酶標儀測量吸光度(optical density, OD)600=0.05；37 ℃厭氧培養(yǎng)，在2、4、6、8、10、12、14、16 h時每組每管分別吸取100 μl細菌懸液加入96孔板，測定OD600值。

1.3.3S.mutans生物膜結(jié)晶紫染色定性分析

1.3.3.1S.mutans菌液濃度的調(diào)節(jié) HtrA高毒力株與基因缺陷株菌液各2支，重復(fù)步驟1.3.2項使兩菌液OD600=1.0，稀釋10倍備用。

1.3.3.2S.mutans生物膜體外構(gòu)建 取5塊一次性無菌6孔板，每孔放入預(yù)處理的22 mm×22 mm無菌蓋玻片一張，每兩孔分別加入HtrA高毒力株菌液、HtrA基因缺陷株菌液，BHI液體培養(yǎng)基，每孔5 ml；37 ℃厭氧培養(yǎng)；培養(yǎng)的1、4、8、12、24 h隨機取出一塊6孔板，做后續(xù)染色處理。

1.3.3.3結(jié)晶紫染色定性分析 隨機取出一塊6孔板，吸干菌液，每孔加入PBS 5 ml，漂洗，吸出，重復(fù)3次，吸干；甲醇固定15 min，PBS洗凈，1%結(jié)晶紫染色5 min，取出蓋玻片，PBS沖掉多余染液后放于無菌載玻片上，顯微鏡油鏡下觀察。

1.3.4S.mutans生物膜掃描電鏡觀察

1.3.4.1S.mutans菌液濃度的調(diào)節(jié) UA159標準株、HtrA高毒力株與HtrA基因缺陷株菌液各1支，重復(fù)1.3.2項使3組菌液OD600=1.0為止，稀釋10倍備用。

1.3.4.2氧化鋯片表面細菌生物膜的培養(yǎng) 一次性無菌24孔板1個，11枚拋光處理過的無菌氧化鋯片間隔放入孔內(nèi)，每孔加入0.5 ml無菌唾液淹沒氧化鋯片，37 ℃孵育4 h；取出24孔板，去除唾液，于有氧化鋯片的孔中每孔加入0.8 ml含10 g/L蔗糖的BHI液體培養(yǎng)基、0.8 ml無菌唾液、200 μl調(diào)好濃度的細菌懸液(UA159標準株、HtrA高毒力株與HtrA基因缺陷株各加3個孔，余下2孔加200 μl無菌生理鹽水作為空白對照組)，37 ℃厭氧培養(yǎng)12 h。

1.3.4.3掃描電鏡標本的制作與觀察 取出24孔板，無菌生理鹽水漂洗，每孔中加入2 ml 2.5%戊二醛溶液，4 ℃固定4 h；吸干，將氧化鋯片轉(zhuǎn)入一塊新的24孔板內(nèi)，PBS漂洗2次，15 min/次，乙醇梯度脫水，樣本干燥噴金，掃描電鏡鏡檢。

1.3.5S.mutans細菌生物膜結(jié)晶紫半定量分析

1.3.5.1S.mutans菌液濃度的調(diào)節(jié) 與1.3.4.1同。

1.3.5.2S.mutans細菌微孔生物膜的培養(yǎng) 取4塊無菌96孔板，加入調(diào)配好濃度的菌液200 μl/孔，第一排為HtrA高毒力株，第二排為UA159標準株，第三排為HtrA基因缺陷株，每種菌液設(shè)置10個復(fù)孔；37 ℃厭氧培養(yǎng)，分別于4、8、12、24 h隨機取出一塊96孔板，做后續(xù)處理。

1.3.5.3結(jié)晶紫染色半定量分析 隨機取出一塊96孔板，PBS洗板3次，吸干，室溫干燥30 min；加入1%結(jié)晶紫染色液200 μl/孔，靜置20 min吸出；PBS漂洗3次，吸干后干燥30 min；加入95%乙醇，200 μl/孔，振蕩30 min，測定OD600值。

2 結(jié)果

2.1S.mutans菌株生化鑒定結(jié)果HtrA高毒力株、HtrA基因缺陷株和UA159標準株均可分解甘露糖、山梨醇、密二糖、棉子糖，水解七葉苷，但不水解精氨酸。

2.2S.mutans菌株體外非應(yīng)激環(huán)境下的生長曲線測定3組S.mutans菌株在體外非應(yīng)激環(huán)境下的生長曲線趨勢基本一致，但在細菌增殖的各個階段，HtrA高毒力株與UA159標準株相對于HtrA基因缺陷株具有更高的細菌濃度(以O(shè)D600值計算)。HtrA高毒力株與HtrA基因缺陷株比較，2 h后差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 3組菌株生長曲線測定結(jié)果與HtrA基因缺陷株比較：*P<0.05，**P<0.01

2.3S.mutans生物膜結(jié)晶紫染色定性分析結(jié)晶紫染色后油鏡下觀察24 h，隨著時間推移，各菌株密集度逐漸加大。但不同時間段兩者細菌密集度不同，HtrA高毒力株密度明顯高于HtrA基因缺陷株。見圖2。

圖2 HtrA高毒力株和HtrA基因缺陷株結(jié)晶紫染色油鏡觀察 ×1 000A：HtrA高毒力株；B：HtrA基因缺陷株；1：1 h；2：4 h；3：8 h；4：12 h；5：24 h

2.4S.mutans生物膜掃描電鏡觀察掃描電鏡下觀察3個菌株的密度HtrA高毒力株密度最大，UA159標準株稍次之，HtrA基因缺陷株密度最低。見圖3。

圖3 HtrA高毒力株、UA159標準株和HtrA基因缺陷株掃描電鏡下觀察A：HtrA高毒力株;B:UA159標準株;C:HtrA基因缺陷株;1:×1 000;2:×10 000

2.5S.mutans細菌生物膜結(jié)晶紫半定量分析4、8、12、24 h HtrA高毒力株與HtrA基因缺陷株比較，OD600值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見表1。

表1 3個菌株不同時間點結(jié)晶紫染色OD600值

3 討論

生物膜是微生物黏附于牙面形成的復(fù)合體，是S.mutans賴以生存的微生態(tài)環(huán)境，它的形成包括兩個過程，即早期細菌黏附牙面和后期細菌相互作用、集聚。絲氨酸蛋白酶的HtrA家族分布廣泛，在多種細菌、植物及人體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)其同系物，這種蛋白酶具有管家蛋白的作用，能降解錯誤折疊的蛋白質(zhì)，維持細菌的生理穩(wěn)態(tài)和適應(yīng)外界應(yīng)激環(huán)境起重要作用[10]。Ahn et al[11]在S.mutans中僅發(fā)現(xiàn)一個HtrA基因的存在，并且證明了它不僅是調(diào)控S.mutans的生長和耐熱性的關(guān)鍵因子，還是調(diào)控S.mutans某些基因轉(zhuǎn)錄和生物膜形成的關(guān)鍵因子。

Ahn et al[11]證實，HtrA在S.mutans的遺傳轉(zhuǎn)化中起著控制生長和反應(yīng)能力的重要作用。敲除HtrA基因的S.mutans對承受低溫和高溫，低pH值以及氧化劑和DNA破壞劑的能力降低[5]。HtrA基因的缺失導(dǎo)致S.mutans在37 ℃時緩慢生長，在42 ℃耐熱性降低[11]。有研究[12]表明HtrA基因的缺失可以限制細菌的存活能力，在酸性環(huán)境下，HtrA突變體的生長速度比野生株大大降低。本實驗顯示兩實驗組S.mutans生化鑒定結(jié)果與標準株S.mutans相符,說明了HtrA基因并不會對的S.mutans生物學(xué)特性和遺傳特性造成嚴重影響。而在體外非應(yīng)激條件下，兩實驗組S.mutans菌株的生長曲線趨勢與UA159標準株雖然基本一致，但在4 h以后，HtrA高毒力株組與UA159標準株組的菌液濃度均高于HtrA基因缺陷株組，這說明HtrA基因可能并不影響乳牙S.mutans生長的基本趨勢，但HtrA基因的缺失會使S.mutans的生長增殖速度降低。實驗中掃描電鏡下觀察到各菌株的生物膜：HtrA高毒力株密度最大，HtrA基因缺陷株密度最低，HtrA缺陷株的生物膜較HtrA高毒力株的生物膜顯得粗糙、稀薄，這與結(jié)晶紫染色光鏡下結(jié)果一致，兩者相互印證HtrA基因的缺失可降低S.mutans的黏附，使其形成的生物膜松散、稀薄。細菌生物膜結(jié)晶紫半定量分析發(fā)現(xiàn)HtrA高毒力株生物膜的形成比HtrA基因缺陷株生物膜的形成快且多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P≤0.001)，說明HtrA基因的缺失會減緩S.mutans生物膜的形成速度。綜上，HtrA基因與細菌生長、應(yīng)激耐受力、反應(yīng)能力和生物膜的形成有關(guān)。Biswas et al[5]認為HtrA可能影響S.mutans糖酵解有關(guān)的細胞外酶從而進一步影響S.mutans生物膜的形成能力，本課題組早期研究[13]表明毒力因子GTFs蛋白和基因在乳牙S.mutansHtrA基因缺陷株中的表達高于HtrA高毒力株，但其生物學(xué)活性低于HtrA高毒力株。證實了HtrA基因在乳牙S.mutansGTFs的分泌過程中可有重要的調(diào)控作用，GTFs生物學(xué)活性的降低直接導(dǎo)致了細胞外葡聚糖的減少，進而減緩了S.mutans在牙面的黏附與生物膜的形成。

總之，HtrA是S.mutans生長、生物膜形成和能力發(fā)展的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的組成部分，這將為臨床上防齲治療提供新的方向。