下調(diào)PBLD的表達(dá)對(duì)胃癌增殖、侵襲的影響

張 偉，劉新權(quán)，朱君玲，肖永彪，張 軍，張 蕾，李冬妹

胃癌是發(fā)病率和死亡率較高的腫瘤，其死亡率位居世界第二[1]。2006年報(bào)道的我國(guó)胃癌的發(fā)病率為35.02/100 000人[2]，死亡率為26.08/100 000人。2015年腫瘤統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示我國(guó)新增胃癌病例679 100 例，死亡498 000例[3]。

胃癌的發(fā)病與飲食、生活環(huán)境和遺傳等因素有關(guān)，還包括一些癌基因的過(guò)量表達(dá)和抑癌基因的表達(dá)缺失[4]。為探討胃癌相關(guān)的異?；虮磉_(dá)，在雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)對(duì)胃癌差異表達(dá)蛋白的研究[5]中，發(fā)現(xiàn)吩嗪生物合成類(lèi)結(jié)構(gòu)域蛋白(phenazine biosynthesis-like domain-containing protein，PBLD)在胃癌中表達(dá)下調(diào)。PBLD是利用酵母雙雜交技術(shù)從人的肝臟中分離獲得的，是較新的蛋白質(zhì)，在人體的多種組織中廣泛表達(dá)[6]。PBLD在胃癌中的作用目前還不清楚[7]。該研究探討了PBLD在胃癌中的表達(dá)水平及作用。

1 材料與方法

1.1 樣本采集采集石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院以及喀什第一人民醫(yī)院 2009～2018年間手術(shù)切除的胃癌石蠟樣本220例，取距離患者癌灶邊緣3～5 cm的癌旁組織79例為對(duì)照?；颊咝g(shù)前均未接受過(guò)放化療，標(biāo)本經(jīng)2位病理專(zhuān)家診斷。平均患病年齡為61.8歲，中老年人為主。本研究獲得石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或家屬簽署了知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑PBLD抗體、pSilencer3.0-PBLD干擾質(zhì)粒為北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院饋贈(zèng)；抗人β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司；免疫組化試劑盒購(gòu)自丹麥DAKO公司；TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；PCR 2×Goldstar Best MasterMix購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)BD公司；LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司；細(xì)胞培養(yǎng)基、血清等購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.3 組織芯片制作鏡下觀察蠟塊HE切片，尋找最具有代表性的部位，標(biāo)記對(duì)應(yīng)HE切片的相應(yīng)區(qū)域；并在相應(yīng)的蠟塊上標(biāo)出HE切片上所選擇的標(biāo)記位置，以此作為芯片的取材部位。設(shè)計(jì)組織芯片圖，將所有選取的胃癌組織蠟芯按照設(shè)計(jì)好的組織芯片模板插入空白蠟塊中，用組織芯片制作儀(MINICORE)完成制作，每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔。

1.4 免疫組化將組織芯片切片后于80 ℃烤片2 h，隨后于二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)高壓修復(fù)抗原，待自然冷卻后，放入3% H2O2溶液中阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，用5%牛奶室溫封閉60 min，滴加一抗PBLD(1 ∶100)，4 ℃孵育過(guò)夜。二抗室溫孵育30 min，滴加二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色，終止反應(yīng)，自來(lái)水沖洗；蘇木精復(fù)染，脫水、封固，鏡下觀察結(jié)果。結(jié)果根據(jù)著色強(qiáng)度和著色面積判讀。根據(jù)強(qiáng)度計(jì)分：未染色為0；染色較弱為1+；染色適中為2+；染色強(qiáng)為3+。根據(jù)著色陽(yáng)性占的比例計(jì)分：未著色為0；<20%為1+；20%～50%為2+；>50%為3+。最后將強(qiáng)度積分乘以面積比例，<1為陰性，2～4為1+，5～7為2+，8～9為3+。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)培養(yǎng)胃癌細(xì)胞AGS，購(gòu)于中科院細(xì)胞庫(kù)。培養(yǎng)基為含10% FBS的DMEM，加入青霉素和鏈霉素(各100 μg/ml)。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)。

1.6 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)良好的細(xì)胞達(dá)50%～70%密度，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，用200 μl DMEM溶解2 μg pSilencer3.0-PBLD和2 μg空質(zhì)粒，室溫5 min，將LipofectamineTM2000溶于DMEM，將混合物加入質(zhì)粒中，每管總體積為400 μl，室溫20 min，將混合物滴入細(xì)胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h，替換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。

1.7 RT-PCR鑒定干擾效果采用TRIzol提取細(xì)胞RNA，取2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系：10×Buffer 2.5 μl，dNTP(2.5 mmol/L) 0.5 μl， PBLD F(5 μmol/L) 0.3 μl，PBLD R(5 μmol/L) 0.3 μl，β-actin F(5 μmol/L) 0.4 μl， β-actin R(5 μmol/L) 0.4 μl，Taq E(5 U/μl) 0.8 μl，模板1 μl，ddH2O 25 μl。引物序列見(jiàn)表1。擴(kuò)增過(guò)程：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，56 ℃、45 s，72 ℃、1 min，32個(gè)循環(huán)后72 ℃、10 min，反應(yīng)產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 PBLD 與β-actin引物列表

1.8 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力將細(xì)胞按3 000個(gè)/孔接種于96孔板中，每組4個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48、72、96、120 h后加入CCK-8溶液，10 μl/孔，培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度(optical density，OD)值。以時(shí)間為橫軸，平均OD450值為縱軸，記錄結(jié)果。

1.9 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力將細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓12 h。將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，37℃孵育20 min，上下室各加500 μl DMEM，水化2 h；取1.5×105細(xì)胞/0.5 ml接種于上層小室中，下層孔板中為750 μl 10% FBS的DMEM，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。用棉簽擦盡上層小室的膠和細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，5%甲苯胺藍(lán)染色，鏡下觀察計(jì)數(shù)。

1.10 Annexin V-PI染色結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)凋亡水平消化細(xì)胞后，1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，用200 μl的1×Binding Buffer重懸，細(xì)胞數(shù)約為1×106/ml。加入10 μl Annexin V/管，避光冰浴30 min，再補(bǔ)充加入300 μl 1×Binding Buffer，用200目篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞，懸浮細(xì)胞加入5 μl PI，避光冰浴5～10 min，流式檢測(cè)分析。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，本研究中免疫組化結(jié)果為計(jì)數(shù)資料，采用χ2檢驗(yàn)；CCK-8實(shí)驗(yàn)、Transwell和凋亡檢測(cè)為計(jì)量資料，采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PBLD在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)采用免疫組化技術(shù)對(duì)組織芯片切片的220例胃癌及79例癌旁正常組織進(jìn)行PBLD的檢測(cè)(圖1)，PBLD主要定位于胞質(zhì)，從正常組織到腸上皮化生再到胃癌組織的惡性病變中，PBLD表達(dá)逐漸下調(diào)。PBLD在胃癌組織中的陽(yáng)性率為27.7%，而在正常組織中的陽(yáng)性率為63.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)表2。

圖1 免疫組化檢測(cè)PBLD在胃癌及癌旁對(duì)照組織中的表達(dá) ×200A：低分化胃癌組織中PBLD的表達(dá)；B：腸上皮化生胃癌組織中PBLD的表達(dá)；C：正常胃組織中PBLD的表達(dá)

表2 PBLD在胃癌與癌旁正常組織中的表達(dá)水平[n/N(%)]

2.2 胃癌中PBLD的低表達(dá)與患者的TNM分期及預(yù)后相關(guān)進(jìn)一步分析PBLD與臨床特點(diǎn)的關(guān)系，個(gè)別患者臨床信息不全或缺失，采用已有信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示PBLD與TNM分期(P=0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)和分化程度(P=0.001)密切相關(guān)，見(jiàn)表3。PBLD表達(dá)下調(diào)的患者平均生存時(shí)間為(54.6±4.3)個(gè)月，表達(dá)較高的患者平均生存時(shí)間為(66.9±4.3)個(gè)月。

表3 胃癌中PBLD表達(dá)水平與臨床特點(diǎn)的分析[n/N(%)]

2.3 胃癌細(xì)胞中干擾PBLD表達(dá)細(xì)胞增殖加快利用PBLD干擾載體在胃癌細(xì)胞AGS中干擾其表達(dá)，采用RT-PCR檢測(cè)干擾效果，結(jié)果顯示干擾后PBLD表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖2。采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾PBLD組與轉(zhuǎn)染空載體組的細(xì)胞增殖情況，結(jié)果表明干擾PBLD，細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖2 RT-PCR檢測(cè)PBLD干擾效果與空載體組比較：*P<0.05

圖3 干擾PBLD表達(dá)胃癌細(xì)胞增殖能力檢測(cè)

2.4 胃癌細(xì)胞中干擾PBLD表達(dá)細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)將干擾PBLD表達(dá)與轉(zhuǎn)染空載體的胃癌細(xì)胞AGS進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)侵襲能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示干擾PBLD的表達(dá)增強(qiáng)了AGS細(xì)胞的侵襲能力，48 h干擾組穿過(guò)基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)多于未干擾組(圖4)，說(shuō)明干擾PBLD的表達(dá)，細(xì)胞侵襲能力增加(P<0.05)。

圖4 干擾PBLD表達(dá)胃癌細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) ×100A:Transwell穿膜細(xì)胞圖；B：Transwell 結(jié)果統(tǒng)計(jì)；1：干擾PBLD組；2：空載體組；與空載體組比較：*P<0.05

2.5 胃癌細(xì)胞中干擾PBLD表達(dá)細(xì)胞凋亡率下降干擾PBLD的胃癌細(xì)胞AGS的凋亡水平檢測(cè)顯示，干擾PBLD組總凋亡率為(7.36±0.78)%，較空載體組總凋亡率(11.76±0.64)%降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007)，干擾PBLD組晚期凋亡率(Q2)為(5.56±1.7)%，較空載體組晚期凋亡率(10.75±1.02)%降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.015)，干擾PBLD組早期凋亡率(Q4)與空載體組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖5。

圖5 干擾PBLD表達(dá)胃癌凋亡檢測(cè)與空載體組比較：*P<0.05

3 討論

PBLD蛋白是Iriyama et al[6]于人肝臟cDNA文庫(kù)中篩選得到的與STRAP相互結(jié)合的蛋白質(zhì)，其基因定位于10q21.1，PBLD的基因序列相對(duì)保守，PBLD可表達(dá)于人類(lèi)多種組織和細(xì)胞中，其中尤以肝臟中的水平最高。

PBLD的功能目前尚不完全清楚。針對(duì)其功能，有研究[8]報(bào)道提示其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在肝癌的研究中，PBLD被發(fā)現(xiàn)在肝癌的發(fā)生發(fā)展中表現(xiàn)出了下調(diào)的趨勢(shì)[9]。Xu et al[10]研究提示PBLD可能與肝癌的侵襲有關(guān)。在消化道腫瘤中，Zhao et al[11]通過(guò)分析潰瘍性結(jié)腸炎和正常組織的差異蛋白表達(dá)譜，表明PBLD在潰瘍性結(jié)腸炎組織中表達(dá)下調(diào)。Zhang et al[5]通過(guò)蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中的表達(dá)水平低于癌旁組織。在乳腺癌的研究中，Liang et al[8]發(fā)現(xiàn)circKDM4C可通過(guò)circKDM4C/miR-548p/PBLD軸靶向治療乳腺癌患者。

本研究進(jìn)一步闡明了PBLD在胃癌中的表達(dá)和作用，采集新疆地區(qū)的胃癌和癌旁對(duì)照樣本，采用免疫組化在組織水平上檢測(cè)了PBLD的表達(dá)，結(jié)果表明PBLD在胃癌組織中的表達(dá)低于癌旁正常組織。胃癌的預(yù)后與分化程度密切相關(guān)，在本研究的結(jié)果中，分化較好的胃癌組織中PBLD的表達(dá)水平相對(duì)較高，低分化的胃癌組織中，PBLD的表達(dá)水平較低，說(shuō)明PBLD與胃癌組織的分化程度相關(guān)。在與臨床特點(diǎn)的分析中也看到，PBLD與患者的分期、轉(zhuǎn)移和分化密切相關(guān)。進(jìn)一步的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PBLD表達(dá)下調(diào)后，胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力都增強(qiáng)了，而凋亡的水平下降，尤其是晚期凋亡的水平下調(diào)。細(xì)胞增殖和凋亡是多細(xì)胞生物在個(gè)體發(fā)育過(guò)程中的基本生命活動(dòng)，二者在細(xì)胞中維持其穩(wěn)定的因素，如果被破壞了，就會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞的生命活動(dòng)的異常。本研究顯示干擾PBLD后發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)減少，這可能是其表現(xiàn)出增殖能力增強(qiáng)的原因之一，增殖旺盛的腫瘤細(xì)胞為獲取更多的生存空間，會(huì)表現(xiàn)出易于遷移和侵襲的傾向，而遷移和侵襲又是和患者的腫瘤預(yù)后密切相關(guān)的，來(lái)自胃癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明PBLD的功能與胃癌細(xì)胞的上述生物特點(diǎn)息息相關(guān)。這些結(jié)果和前人在腫瘤中研究發(fā)現(xiàn)的PBLD的功能類(lèi)似，說(shuō)明PBLD在胃癌中主要發(fā)揮了抑制腫瘤進(jìn)展的作用。

關(guān)于PBLD發(fā)揮作用的分子機(jī)制，與PBLD蛋白相互結(jié)合的絲蘇氨酸激酶受體激活蛋白(serine-threonine kinase receptor-associated protein, STRAP)蛋白可以與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)信號(hào)通路的相關(guān)蛋白發(fā)生結(jié)合，其可與Smad7和TGF-β受體Ⅰ(TGF-β receptor Ⅰ,TβRI) 形成復(fù)合體，STRAP的結(jié)合使得Smad7和活化的TβRI的結(jié)合更加緊密，從而抑制了TβRI和Smad2/3的結(jié)合，也抑制了隨之而來(lái)的后者的活化，最終的結(jié)果是Smad2/3復(fù)合體不能入核，造成TGF-β通路的信號(hào)中斷[12]。PBLD很有可能在這個(gè)過(guò)程中加強(qiáng)了STRAP對(duì)TGF-β的阻斷作用。另外，Zhao et al[11]推測(cè)PBLD可能通過(guò)絲裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinaae, MAPK)通路對(duì)癌前病變和潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)揮一定的調(diào)控作用。過(guò)量表達(dá)PBLD后MAPK信號(hào)通路ERK、p38及JNK的表達(dá)變化不大，但這些蛋白的磷酸化形式pERK、p-p38和pJNK的水平均被抑制。由此推斷，PBLD可能抑制MAPK信號(hào)通路而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲、遷移。結(jié)合前人的文獻(xiàn)報(bào)道，PBLD的主要作用機(jī)制可能來(lái)自于阻礙TGF-β信號(hào)通路，而TGF-β作為一種轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子[13]，其本身又與細(xì)胞的增殖、EMT和凋亡密切相關(guān)[14]。PBLD可能通過(guò)TGF-β信號(hào)通路而影響胃癌細(xì)胞的生命活動(dòng)。

綜上，通過(guò)本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究表明PBLD在胃癌中發(fā)揮抑癌基因的作用，可能作為胃癌患者的診療和預(yù)后判斷的標(biāo)志，在進(jìn)一步的研究中，應(yīng)重點(diǎn)分析PBLD在胃癌細(xì)胞中發(fā)揮作用的機(jī)制。