丙泊酚抑制ERK12和NF-κB p65的活化緩解腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能損傷及氧化應(yīng)激

吳 仲,李 曦,韓 徐,丁 玲, 祝勁松, 王凌浩

腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion, CI/R)是一個復(fù)雜的快速級聯(lián)反應(yīng)過程，發(fā)病后再次灌注，不僅損傷無法恢復(fù)，其損傷會繼續(xù)加重，嚴重威脅人類的健康[1-2]。腦組織中一旦發(fā)生缺血后會發(fā)生炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡、凋亡基因激活和一系列信號通路發(fā)生改變，導(dǎo)致不可逆的損傷[3-6]。丙泊酚是一種常見的靜脈麻醉藥，多用于腫瘤切除的麻醉[7]。丙泊酚可以通過調(diào)節(jié)核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)通路和炎癥反應(yīng)因子活性，對心腦血管起到保護作用[8]。目前有關(guān)丙泊酚能否通過降低CI/R后氧化應(yīng)激來保護CI/R研究較少。該文旨在研究丙泊酚抑制細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extraeellular—signalregulatedki-nase,ERK1/2)和核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB) 的活化緩解CI/R大鼠神經(jīng)功能損傷及氧化應(yīng)激的影響，以期了解丙泊酚抑制ERK1/2和NF-κB p65的活化緩解CI/R大鼠神經(jīng)功能損傷及氧化應(yīng)激作用機理，從而為CI/R的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級2.5～3.5周齡SD大鼠75只，體質(zhì)量(60±6) g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2017-0022，普通級，所有大鼠均飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物學(xué)部屏障環(huán)境獨立通氣籠，溫度20～25 ℃，相對濕度40%～60%，實驗經(jīng)動物倫理委員會批準同意。

1.2 藥物與試劑中性福爾馬林、酒精、二甲苯購自天津科密歐有限公司；蘇木精、伊紅購自武漢博士得生物有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase, SOD)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)檢測試劑盒均購自上海恒遠生物科技有限公司；LipofecamineTM2000購自美國ThermoFisher公司；TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR PCR Master Mix試劑盒購自日本Toyobo公司。

1.3 儀器TDL-5 型臺式離心機購自上海安亭科學(xué)儀器廠；3～5 w低溫離心機購自湖南恒諾離心機有限公司；SG-51正置型金相顯微鏡購自上海光學(xué)儀器廠；BS-124s型電子天平購自北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)購自以色列DNR公司；LD-66實驗室切片機購自長沙益廣制藥機械公司。

1.4 方法

1.4.1分組及建立模型 將75只大鼠隨機均分為5組，分別為假手術(shù)組、模型組、低劑量丙泊酚組、高劑量丙泊酚組和陽性對照組。將模型組、低劑量丙泊酚組、高劑量丙泊酚組和陽性對照組大鼠麻醉并仰臥固定，分離雙側(cè)頸總動脈，使用微動脈夾夾閉10 min，松開10 min，再夾閉10 min，再次松開，共2個周期，復(fù)制大鼠反復(fù)腦缺血再灌注模型；具體制作方法和判讀造模是否成功參考Watanabe et al[9]研究。

1.4.2藥物干預(yù) 低劑量丙泊酚組于制作模型前腹腔注射丙泊酚，注射總劑量為36 mg/kg；高劑量丙泊酚組于制作模型前腹腔注射丙泊酚，注射劑量為72 mg/kg；陽性對照組于制作模型前腹腔注射尼莫地平，注射劑量為16 mg/kg；假手術(shù)組和模型組于制作模型前腹腔注射等量生理鹽水，丙泊酚注射劑量參考薛青 等[10]研究。

1.4.3檢測項目

1.4.31大鼠的神經(jīng)功能檢測 造模完成后24 h進行神經(jīng)功能缺損評分。本實驗使用國際上公認的大鼠腦神經(jīng)功能缺損評價標(biāo)準。見表1。

表1 神經(jīng)功能及姿勢反射評分評分標(biāo)準

1.4.3.2大鼠腦梗死率、腦含水率及腦指數(shù)檢測 神經(jīng)評分后將大鼠處死，立即取腦，切成2 mm的切片，沖洗后避光溫孵、染色并拍照，用 Image-ProPlus 軟件分析計算腦梗死率。腦梗死率(%)=(梗死區(qū)總面面積/全腦總面積)×100%。取左右腦半球，快速稱質(zhì)量，計為濕質(zhì)量。放入恒溫干燥箱干燥24 h，取出后稱質(zhì)量，計為干質(zhì)量。腦含水率(%)=[(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量]×100%。取腦組織用沖洗后除去積血，吸去表面水分稱重，以臟器濕重(mg/g)表示腦指數(shù)。

1.4.3.3Western blot 檢測蛋白表達水平 用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳提取總蛋白，半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，置于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入1 ∶500稀釋的[腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor, NGF)、ERK1/2、p-ERK1/2、p65、p-p65]抗體，Actin(1 ∶5 000)，孵育2 h]，以Actin為內(nèi)參蛋白，采用顯色液顯色后行吸光度分析，計算各蛋白相對表達量。

1.4.3.4RT-PCR檢測相關(guān)基因表達水平 取大鼠大鼠腦前額組織，切碎后用TRIzol試劑提取總RNA，測定RNA濃度和純度后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，用PCR儀進行擴增，用SYBR PCR Master Mix試劑盒對BDNF、NGF表達水平進行檢測，以Actin為內(nèi)參。實驗所用到的引物均采用Primer 3網(wǎng)站設(shè)計，由大連Takara公司合成。

1.4.3.5HE染色觀察 使用常規(guī)HE染色，中性樹膠封片后在光學(xué)顯微鏡下使用10×40的倍鏡觀察大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元病理學(xué)變化情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行分析，采用GraphPad Prism5作圖，本實驗結(jié)果數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，方差分析使用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)功能檢測結(jié)果圖1顯示，相比假手術(shù)組，模型組大鼠神經(jīng)功能評分、姿勢反射評分、腦梗死率、腦含水率及腦指數(shù)升高(P<0.05)；相比模型組，低劑量丙泊酚組、高劑量丙泊酚組和陽性對照組大鼠神經(jīng)功能評分、姿勢反射評分，腦梗死率、腦含水率及腦指數(shù)降低(P<0.05)。

圖1 神經(jīng)功能評分、姿勢反射評分、腦梗死率、腦含水率及腦指數(shù)檢測結(jié)果A：大鼠神經(jīng)功能評分結(jié)果；B：大鼠姿勢反射評分結(jié)果；C：大鼠腦梗死率檢測結(jié)果；D：大鼠腦含水率檢測結(jié)果；E：大鼠腦指數(shù)檢測結(jié)果；1: 假手術(shù)組；2：模型組；3:低劑量丙泊酚組；4: 高劑量丙泊酚組；5：陽性對照組；與假手術(shù)組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.2 大鼠腦BDNF及NGF表達情況圖2顯示，相比假手術(shù)組，模型組大鼠BDNF、NGF表達升高(P<0.05)；相比模型組，低劑量丙泊酚組、高劑量丙泊酚組和陽性對照組大鼠BDNF、NGF表達降低(P<0.05)。

圖2 Western blot以及RT-PCR法檢測大鼠腦前額葉BDNF及NGF表達情況A：Western blot法；B：RT-PCR法；1：假手術(shù)組；2：模型組；3：低劑量丙泊酚組；4：高劑量丙泊酚組；5：陽性對照組；與假手術(shù)組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.3 HE染色觀察結(jié)果圖3顯示，假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)細胞分布均勻，且基本無壞死細胞；模型組大鼠缺氧模型組細胞分布散亂，且數(shù)量缺失明顯增多，壞死細胞較多；低劑量丙泊酚組有較多的壞死細胞且細胞分布較為散亂；高劑量丙泊酚組和陽性對照組大鼠海馬區(qū)細胞分布較為均勻，且壞死細胞均較少。

圖3 HE染色觀察各組大鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元病理學(xué)變化結(jié)果 HE×400A：假手術(shù)組；B：模型組；C：低劑量丙泊酚組；D：高劑量丙泊酚組；E：陽性對照組

2.4 大鼠血清MDA、SOD、LDH的含量水平檢測結(jié)果圖4顯示，相比假手術(shù)組，模型組大鼠血清MDA、LDH含量水平升高，SOD含量水平降低(P<0.05)；相比模型組，低劑量丙泊酚組、高劑量丙泊酚組和陽性對照組大鼠MDA、LDH含量水平降低，SOD含量水平升高(P<0.05)。

圖4 大鼠血清MDA、SOD、LDH的含量水平檢測結(jié)果A：MDA；B：SOD；C：LDH；1: 假手術(shù)組；2：模型組；3:低劑量丙泊酚組；4: 高劑量丙泊酚組；5：陽性對照組；與假手術(shù)組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.5 ERK1/2和NF-κB p65的磷酸化情況結(jié)果圖5顯示，相比假手術(shù)組，模型組大鼠總ERK1/2、p65蛋白表達無差異(P>0.05)；相比假手術(shù)組，模型組大鼠p- ERK1/2、p- p65蛋白表達升高(P<0.05)；相比模型組，低劑量丙泊酚組、高劑量丙泊酚組和陽性對照組大鼠總ERK1/2、p65蛋白表達無差異(P>0.05)；相比模型組，低劑量丙泊酚組、高劑量丙泊酚組和陽性對照組大鼠p- ERK1/2、p- p65蛋白表達降低(P<0.05)。

圖5 ERK1/2和NF-κB p65的磷酸化情況結(jié)果A：Western blot法檢測ERK1/2蛋白表達及其磷酸化結(jié)果；B:Western blot法檢測NF-κB p65的磷酸化結(jié)果；1: 假手術(shù)組；2：模型組；3:低劑量丙泊酚組；4: 高劑量丙泊酚組；5：陽性對照組；與假手術(shù)組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

3 討論

神經(jīng)功能評分是CI/R損傷的重要指標(biāo)之一。神經(jīng)功能評分較高說明大鼠受到缺血再灌注損傷較為嚴重。腦部缺血再灌注后由于腦組織代謝產(chǎn)物的積聚使得毛細血管通透性增加，并破壞血腦屏障，導(dǎo)致血漿蛋白和水分外溢，增加腦細胞外液引起水腫引起腦含水量增加。本研究顯示：相比模型組，低劑量丙泊酚組、高劑量丙泊酚組和陽性對照組大鼠神經(jīng)功能評分、姿勢反射評分，腦梗死率、腦含水率及腦指數(shù)降低。說明使用丙泊酚處理后大鼠腦組織得到了有效的保護。這可能是因為丙泊酚可以有效降低大鼠腦組織缺血再灌注后的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激。薛青 等[10]研究表明：丙泊酚可以有效保護大鼠腦組織缺血再灌注后的損傷，本研究得出的結(jié)論與之一致。

BDNF是神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的特異蛋白分子，可以通過調(diào)節(jié)細胞代謝實現(xiàn)調(diào)節(jié)細胞生長。本研究表明，相比模型組，低劑量丙泊酚組、高劑量丙泊酚組和陽性對照組大鼠BDNF、NGF表達降低。說明大鼠腦組織受損程度得到了的改善。缺血再灌注損傷是由多種機制交互式作用、相互影響導(dǎo)致的。近年來蘇振宇 等[11]研究表明：缺血再灌注損傷與SOD、MDA及LDH密切相關(guān)。MDA會引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生一系列降解產(chǎn)物會引起細胞代謝及功能障礙，可反映細胞氧化損傷的程度，細胞內(nèi)氧化程度越高，MDA含量水平越高。SOD具有抗氧化性，是經(jīng)典的抗氧化酶之一，可以有效清除活性氧。機體內(nèi)SOD水平越高說明機體清除活性氧的能力越強，當(dāng)腦組織損傷時其含量會降低。LDH是細胞損傷的重要標(biāo)志，只有當(dāng)細胞損傷才會由胞內(nèi)釋放到胞外。本研究顯示，相比模型組，低劑量丙泊酚組、高劑量丙泊酚組和陽性對照組大鼠MDA、LDH含量水平降低，SOD含量水平升高。說明大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激受到了的抑制，降低了大鼠腦細胞的損傷，阻止了LDH等進入大鼠血液。李昊 等[12]研究表明：丙泊酚可以有效保護大鼠腦組織缺血后的損傷，本研究得出的結(jié)論與之一致。

ERK1/2是MAPK家族重要成員之一，ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在受到外界刺激激活后會促進細胞增殖、分化以及抑制凋亡并降低組織的炎癥反應(yīng)發(fā)生。NF-κB是Rel蛋白家族重要成員之一，其中p65為最常見的異源二聚體，在缺血性腦損傷中具有重要作用[13]。P65磷酸化后會進參與細胞程序化死亡并進一步參與體內(nèi)的炎癥和免疫反應(yīng)。本研究表明：相比模型組，低劑量丙泊酚組、高劑量丙泊酚組和陽性對照組大鼠p-ERK1/2、p-p65蛋白表達降低。說明使用丙泊酚處理后，ERK1/2信號通路及p65的磷酸化受到了的抑制，這可能與丙泊酚具有保護線粒體和清除自由基的特性并制中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性氨基酸的釋放相關(guān)。雷亞娟 等[14]研究表明：丙泊酚可以通過下調(diào)大鼠NF- κB信號通路表達實現(xiàn)保護缺血再灌注損傷，本研究得出的結(jié)論與之一致。