偶聯(lián)奧曲肽的腫瘤靶向的聚合物磁共振造影劑

曹葆強(qiáng)，孫天賜，閆 旭，何 濤，陸 楊

順磁性化合物可以縮短病灶區(qū)域的弛豫時(shí)間，通過增強(qiáng)與周圍組織的對(duì)比度提高磁共振診斷的靈敏度和準(zhǔn)確度[1-3]。目前臨床常用磁共振成像造影劑是靜脈注射的小分子釓配位化合物[4]，但是存在成像性能低，體內(nèi)代謝快，缺乏對(duì)于腫瘤的特異性靶向功能等局限[2，5-7]。將含釓的小分子磁共振造影劑偶聯(lián)到高分子聚合物可以顯著提高其弛豫率，并延長造影劑的體內(nèi)停留時(shí)間，同時(shí)更容易進(jìn)行靶向分子的修飾[8-9]。奧曲肽(octreotide，Oct)是一種人工合成的天然生長抑素類似物，它對(duì)肝癌等腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的生長抑素受體具有較高的親和力，因此可用作靶向分子[10]?；谡n題組的前期研究進(jìn)展，現(xiàn)合成了奧曲肽偶聯(lián)的支化聚合物納米材料，制備了一種新型的靶向生長抑素受體過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的含釓MR聚合物納米造影劑。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器4-氰基-4-(苯基碳硫硫基硫代)戊酸N-琥珀酰亞胺酯(CTA-NHS)購自美國Aldrich；寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯(OEGMA，Mw=300)、甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)、溴乙酸(BA)、甲基丙烯酸正丁酯(n-BMA)、1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7-三乙酸叔丁醇乙酯(TBTT)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)均購自上海阿拉??；三氟乙酸(TFA)、氯化釓(Ⅲ)六水合物(GdCl3·6H2O)、二氯甲烷(DCM)、乙腈、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)均購自上海國藥集團(tuán)；Oct購自瑞士諾華制藥公司。核磁測試(1H NMR)使用VNMR S600型核磁共振儀(Agilent Technologies，美國)；動(dòng)態(tài)光散射(DLS)測試使用激光粒度分析儀(Malvern Panalytica，英國)，采用HT7700型透射電子顯微鏡(Hitachi，日本)分析樣品的形貌。

1.2 奧曲肽靶向的納米支化聚合物的合成參考本課題組前期研究進(jìn)展[11-12]，利用可逆加成鏈轉(zhuǎn)移(reversible addition-fragmentation chain transfer，RAFT)活性自由基聚合方法，由OEGMA單體和HEMA-TBTT出發(fā)，合成線性共聚物P1(POEGMA-HEMA-TBTT)，再經(jīng)第二步聚合合成得到支化共聚物P2。P2上的特丁基經(jīng)三氟醋酸(TFA)切斷產(chǎn)生相應(yīng)的羧基，得到P3，可用于釓離子的螯合。將2 g 的P3溶解在30 ml DMF中，再加入Oct(0.43 g，0.38 mmol)，三乙胺(77 mg，0.76 mmol)，室溫下反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后，粗產(chǎn)物在水中透析48 h，干燥之后用THF復(fù)溶，隨后在冰的正己烷中沉降兩次，真空干燥后得到Oct功能化聚合物納米顆粒P4[P(DO3A)-Oct]。

1.3 Oct靶向的支化聚合物納米造影劑的合成取1.2中合成的1 g Oct功能化聚合物納米顆粒(P4)溶解在異丙醇(15 ml)中，與氯化釓的乙酸銨溶液(0.1 mmol Gd/L，50 ml)混合，55℃反應(yīng)1d后透析除雜，獲得Oct功能化納米造影劑P5 [P(DO3A-Gd)-Oct]，通過DLS和TEM表征其粒徑分布。

1.4 體外穩(wěn)定性測試將釓離子濃度為100 μg/ml 的P(DO3A-Gd)-Oct水溶液裝入透析袋內(nèi)并在37 ℃ PBS緩沖液中透析，取第1、3、7天的透析液1 ml分別與1 ml的偶氮胂-Ⅲ (0.05 mmol/L)ml氯乙酸-氫氧化鈉緩沖液(pH=2.8)混合，采用紫外分光光度儀 (UV2600，島津)，通過測定透析液中游離的Gd離子濃度評(píng)估P(DO3A-Gd3+)-Oct的離子泄露。

1.5 溶血性測試取大鼠全血50 μl加入5 ml生理鹽水，再加入50 μl P(DO3A-Gd)-Oct水溶液(100 mg/ml)，混勻后置于37 ℃水浴中3 h后取出，離心5 min (1 000 r/min)，用紫外分光光度計(jì)測定上清液在545 nm處的吸光度(optical density，OD)值，并計(jì)算溶血率。陰性對(duì)照組中取大鼠全血50 μl加入5 ml生理鹽水，陽性對(duì)照組取大鼠全血50 μl加入5 ml蒸餾水。

1.6 生物安全性測試?yán)肕TT法在小鼠乳腺癌細(xì)胞評(píng)估P(DO3A-Gd)-Oct的細(xì)胞毒性。經(jīng)尾靜脈給小鼠注射P(DO3A-Gd)-Oct (5 mg Gd/kg)后評(píng)估體內(nèi)安全性，在15和30d處死后取主要臟器(心、肝、脾、肺和腎)，采用蘇木精-伊紅(HE)染色法對(duì)臟器的石蠟切片進(jìn)行染色分析，同時(shí)取血化驗(yàn)分析主要的血液生化指標(biāo)。

1.7 磁共振性能表征使用GE Discovery MR750W 3.0T磁共振成像系統(tǒng)以反轉(zhuǎn)恢復(fù)序列表征P(DO3A-Gd)-Oct的弛豫率。具體掃描參數(shù)如下：重復(fù)時(shí)間(TR) = 4 000 ms，回波時(shí)間(TE) = 10.8 ms，翻轉(zhuǎn)時(shí)間(TI) = 50、75、100、150、200、250、300、350、400、500、600、800、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、3 500 ms。獲得不同Gd離子濃度(0.025、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mmol/L) 的P(DO3A-Gd)-Oct造影劑水溶液的縱向弛豫時(shí)間(T1)，并由R1(即1/T1)對(duì)Gd離子濃度線性擬合得到其縱向弛豫率(r1)。通過尾靜脈注射相同劑量(5 mg Gd/kg)的P(DO3A-Gd)-Oct和P(DO3A-Gd)水溶液后，皮下荷H22肝癌小鼠的T1加權(quán)成像采用配置有小動(dòng)物成像線圈(Medcoil，蘇州)的Siemens Tim Trio 3.0T超導(dǎo)型磁共振成像系統(tǒng)進(jìn)行測試。

2 結(jié)果

2.1 P(DO3A-Gd)-Oct的合成及表征Oct修飾的支化聚合物納米造影劑P(DO3A-Gd)-Oct的合成示意圖如圖1所示。圖2為未螯合釓離子的聚合物P(DO3A)-Oct (化合物P4)的核磁共振氫譜圖。其中主要的峰的歸屬：峰a來源于聚合物主鏈聯(lián)接的甲基，b來自主鏈的亞甲基；c和d來自聚乙二醇大分子單體中的亞甲基，而e來自其末端的甲基；f～i來自于甲基丙烯酸正丁酯單元的亞甲基及末端甲基。局部放大譜線為Oct分子中代表性的苯環(huán)的質(zhì)子峰放大圖，表明了Oct對(duì)嵌段共聚物的成功修飾。

圖1 Oct修飾的支化聚合物納米造影劑的合成示意圖

圖2 聚合物P(DO3A)-Oct的核磁共振氫譜圖

利用TEM和DLS表征合成出的Oct靶向的納米支化聚合物造影劑P(DO3A-Gd)-Oct的形貌和尺寸。根據(jù)課題組的前期報(bào)道[13-14]，將所得的支化聚合物P(DO3A-Gd)-Oct直接溶于水中，即可得到納米顆粒，整個(gè)過程無需自組裝。P(DO3A-Gd)-Oct的透射電鏡照片中顯示大量形貌不規(guī)整的單分散納米顆粒，其尺寸比較均勻，見圖3A。根據(jù)動(dòng)態(tài)光散射測試結(jié)果可知，P(DO3A-Gd)-Oct納米顆粒的水合粒徑為20 nm左右，見圖3B。

圖3 Oct靶向的納米支化聚合物造影劑P(DO3A-Gd)-Oct的材料學(xué)表征A：TEM照片；B：水溶液中的粒徑分布

2.2 P(DO3A-Gd)-Oct的穩(wěn)定性圖4為Gd離子濃度為2、10 μg/ml氯化釓溶液以及P(DO3A-Gd)-Oct在透析1、3、7 d的透析液與偶氮胂Ⅲ混合后的紫外吸收光譜圖，658 nm處為釓離子與偶氮胂III的絡(luò)合物的特征吸收峰。在1周的透析處理中，P(DO3A-Gd)-Oct水溶液中游離的釓離子濃度一直很低，表明 P(DO3A-Gd)-Oct 對(duì)釓離子有較強(qiáng)的結(jié)合力，該造影劑具有良好的穩(wěn)定性。

圖4 P(DO3A-Gd)-Oct的穩(wěn)定性測定性

2.3 P(DO3A-Gd)-Oct的體外安全性采用標(biāo)準(zhǔn)的MTT法評(píng)估P(DO3A-Gd)-Oct的細(xì)胞毒性，當(dāng)4T1細(xì)胞與濃度為0 ～ 200 μg/ml (DO3A-Gd)-Oct共培養(yǎng)后，細(xì)胞的存活率沒有顯著的差異，見圖5A。圖5B為P(DO3A-Gd)-Oct的溶血性測試結(jié)果。從不同實(shí)驗(yàn)組共培養(yǎng)并離心后的照片可以看出，與完全溶血的陽性對(duì)照組(蒸餾水)相比，P(DO3A-Gd)-Oct組與陰性對(duì)照組(生理鹽水)的上清液都沒有顯著的顏色，即上清液中的游離血紅蛋白濃度低。進(jìn)一步定量檢測不同組上清液在545 nm處的OD值，經(jīng)計(jì)算P(DO3A-Gd)-Oct在100 μg/ml濃度時(shí)引起的溶血率僅為0.34 %。溶血率高于5 %表示材料有溶血作用，因此P(DO3A-Gd)-Oct無明顯的溶血性。

圖5 P(DO3A-Gd)-Oct的體外生物安全性A：細(xì)胞毒性；B：溶血率

2.4 P(DO3A-Gd)-Oct的生物安全性如圖6A所示，P(DO3A-Gd)-Oct經(jīng)尾靜脈15、30 d后的小鼠主要臟器特別是肝臟和腎臟的HE染色切片中無明顯的病理變化，表明P(DO3A-Gd)-Oct對(duì)小鼠沒有明顯的臟器毒副作用。進(jìn)一步分析注射P(DO3A-Gd)-Oct 15和30d后小鼠的主要生化指標(biāo)，包括谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、白蛋白(albumin, ALB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、肌酐(creatinine, CREA)和堿性磷酸酶(alkalinephosphatase, ALP)，如圖6B所示與正常小鼠均無顯著差異。

2.5 P(DO3A-Gd)-Oct體外和體內(nèi)的磁共振成像性能圖7A為一系列濃度梯度的P(DO3A-Gd)-Oct樣品的T1 map的偽彩圖，隨著濃度的上升縱向弛豫時(shí)間T1顯著縮短。圖7B為縱向弛豫時(shí)間T1的倒數(shù)對(duì)造影劑濃度的擬合，得出P(DO3A-Gd)-Oct的縱向弛豫率r1為8.33 mM-1s-1，約為釓噴酸葡胺注射液等臨床常用的釓基磁共振增強(qiáng)造影劑的2倍以上。

圖7 P(DO3A-Gd)-Oct的磁共振成像性能A：一系列濃度梯度樣品的T1 map；B：縱向弛豫率r1

通過尾靜脈將P(DO3A-Gd)-Oct注射到皮下荷有H22肝癌的小鼠體內(nèi)，初步研究了Oct靶向的納米支化聚合物造影劑在體內(nèi)的造影增強(qiáng)效果。圖8A為尾注射P(DO3A-Gd)-Oct前后的小鼠H22皮下瘤區(qū)域的橫斷位T1加權(quán)圖像?？梢钥闯?，與注射前相比，尾靜脈注射60 min后紅色虛線標(biāo)識(shí)出的腫瘤區(qū)域顯著變亮，且120 min后瘤內(nèi)仍然保持顯著的T1造影增強(qiáng)效果。為進(jìn)一步研究P(DO3A-Gd)-Oct的體內(nèi)的腫瘤靶向效果，皮下荷H22肝癌的小鼠在接受相同劑量的P(DO3A-Gd)-Oct和P(DO3A-Gd)尾靜脈注射120 min后，取腫瘤組織消解后利用等離子耦合原子發(fā)射光譜法測腫瘤組織中Gd離子的濃度，結(jié)果如圖8B所示。與P(DO3A-Gd) 相比，腫瘤鼠在注射P(DO3A-Gd)-Oct后120 min時(shí)，腫瘤部位的Gd離子濃度顯著提高。

圖8 荷瘤小鼠尾靜脈注射P(DO3A-Gd)-Oct后的腫瘤靶向效果A：不同時(shí)間點(diǎn)的橫斷位T1 MR成像照片圖片；B：注射120 min后瘤內(nèi)的釓離子濃度比較。

3 討論

隨著磁共振技術(shù)在醫(yī)學(xué)臨床中的廣泛普及，第一代的磁共振成像造影劑在臨床使用已經(jīng)30年。但是近年來，一系列研究報(bào)道[2]顯示早期的線性釓基磁共振成像造影劑(包括釓噴酸葡胺，商品名Magnevist和釓雙胺，商品名Omniscan)存在離子泄露的隱患，并與腎臟成纖維化相關(guān)。另外線性小分子釓造影劑在靜脈注射進(jìn)行診斷后，會(huì)在腦部等部位長期殘留，這對(duì)釓基磁共振造影劑的生理穩(wěn)定性提出了進(jìn)一步的要求。本文所使用的DO3A是一種大環(huán)配體，是臨床使用的新型的非離子型環(huán)狀磁共振造影劑釓特醇(商品名ProHance)和釓布醇(商品名Gadovist)中的配體分子。相對(duì)于二乙三胺五乙酸(DTPA)等線性配體，DO3A與釓離子形成的螯合物的穩(wěn)定常數(shù)更高，在生理?xiàng)l件中多種鋅、鈣和銅等內(nèi)源性離子存在時(shí)能具有更強(qiáng)的體內(nèi)穩(wěn)定性。本文設(shè)計(jì)制備的腫瘤靶向的聚合物納米磁共振造影劑選擇了DO3A作為螯合釓離子的配體，因此具有良好的體內(nèi)安全性。但是，相對(duì)于線性分子造影劑，大環(huán)分子造影劑的T1弛豫率并沒有顯著提高，同時(shí)也沒有提高對(duì)于惡性腫瘤的特異性。目前腫瘤等惡性疾病的早期診斷對(duì)于靈敏度和準(zhǔn)確度提出了更高的要求，因此弛豫率的增強(qiáng)和靶向性的設(shè)計(jì)是磁共振造影劑重要的發(fā)展方向。根據(jù)文獻(xiàn)[4]總結(jié)，目前臨床上常用的釓基造影劑水溶液在3.0 T場強(qiáng)下測得的縱向弛豫率r1都低于4.5 mM-1s-1，具體如下：Magnevist (2.8～3.4 mM-1s-1)，Gadovist (2.9～3.5 mM-1s-1)，ProHance (2.6～3.0 mM-1s-1)，MultiHance (3.7～4.3 mM-1s-1), Dotarem (2.6～3.0 mM-1s-1)，Omniscan (2.9～3.5 mM-1s-1)。相對(duì)于上述小分子造影劑，德國Schering公司開發(fā)的Gadomer是一種由多聚賴氨酸組成的分子量為17 ku樹枝狀大分子含釓造影劑，其r1高達(dá)13.0 mM-1s-1[9]。大分子作為骨架偶聯(lián)小分子釓制劑是開發(fā)高弛豫率的新型造影劑的有效途徑，因此我們所設(shè)計(jì)的P(DO3A-Gd)-Oct的造影性能受益于分枝狀聚合物納米骨架。P(DO3A-Gd)-Oct的r1在3.0T場強(qiáng)下達(dá)到8.33 mM-1s-1，是目前臨床常用的小分子釓基造影劑的2倍以上，因此有望在磁共振診斷時(shí)降低使用劑量，或者提高成像分辨率。

本文中采用了Oct作為靶向分子對(duì)釓基聚合物納米造影劑進(jìn)行靶向功能化設(shè)計(jì)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Oct是一種對(duì)生長抑素受體亞型2(SSTR2)具有高親和性的生長抑素類似物[10]，因此基于Oct設(shè)計(jì)靶向造影劑對(duì)于過表達(dá)SSTR2的腫瘤具有較好的靶向富集，因此圖8 中的荷瘤小鼠在尾靜脈注射P(DO3A-Gd)-Oct后呈現(xiàn)出顯著的瘤內(nèi)T1磁共振信號(hào)增強(qiáng)，以及長達(dá)120 min的成像效果。同時(shí)，Oct是目前一種常用的臨床藥物，對(duì)于肝癌新生血管的生長有抑制作用[15]，因此Oct功能化的磁共振成像造影劑具有良好的臨床轉(zhuǎn)化潛力，并且有望成為一種集腫瘤的診斷和治療能力為一體的新型制劑，這方面研究還有待于進(jìn)一步的深入。