人參皂苷Rb1抑制利多卡因誘導(dǎo)小鼠原代脊髓神經(jīng)干細胞損傷研究

楊常青，韓芳芳，袁 菲，徐松濤，陳旭東

神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)對于受損的腦組織及脊髓修復(fù)非常重要[1]，但是局麻藥可降低神經(jīng)干細胞數(shù)量，從而影響神經(jīng)系統(tǒng)功能[2]。人參皂苷Rb1是人參的主要藥理活性成分，在神經(jīng)纖維形成和神經(jīng)干細胞的增殖過程中起關(guān)鍵作用[3]，可下調(diào)炎癥因子的表達來降低炎癥損傷[4]，也可促進小鼠局灶性腦梗死小鼠的后期運動恢復(fù)[5]。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun-terminal kinases，JNK)屬于絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族，對其通路進行抑制可緩解神經(jīng)干細胞凋亡。人參皂苷 Rb1不僅抑制JNK 信號通路，還可通過此途徑調(diào)控促炎癥因子表達[6-7]，但尚不清楚人參皂苷Rb1可否通過JNK通路影響神經(jīng)干細胞。該文擬研究人參皂苷Rb1對于利多卡因誘導(dǎo)的小鼠原代脊髓神經(jīng)干細胞凋亡的影響，并探討JNK通路在這一過程中與Rb1之間的關(guān)系，以期為降低局麻藥對神經(jīng)組織損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料PE標記抗鼠源Nestin抗體購自美國R&D公司；APC標記抗鼠CD133抗體購自美國Biolegend公司；SOX2和MAP2抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；JNK和P-JNK抗體購自英國Abcam公司；Caspase3(P17)購自武漢博士德生物有限公司；人參皂苷Rb1購自美國MedChemExpress公司；利多卡因購自北京四環(huán)科寶制藥有限公司。

1.2 流式細胞分選將分離的原代神經(jīng)細胞用PBS清洗1遍，流式染色固定液清洗細胞1遍，將帶熒光標記的Nestin抗體溶解在固定液中孵育原代細胞，30 min后流式分選出熒光強陽性的細胞，PBS清洗1遍后接至細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。待細胞貼壁并生長至狀態(tài)良好，消化細胞成單細胞狀態(tài)，PBS清洗1遍，將熒光標記的CD133表面抗體加入細胞，37 ℃孵育30 min后上流式再次分選，將獲得的CD133陽性細胞轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)皿備用。

1.3 免疫染色普通培養(yǎng)基培養(yǎng)神經(jīng)細胞，自由分化1周，棄去培養(yǎng)液后用PBS清洗1遍，然后用4%多聚甲醛固定細胞30 min，分別用0.2% Triton X-100溶液透膜15 min，1% BSA封閉30 min，加入相應(yīng)的一抗(抗SOX2、抗MAP2)孵育過夜，合適的熒光標記二抗37 ℃孵育1 h，Hoechst33342染核5 min，各步之間用PBS清洗3遍，每遍5 min。

1.4 Western blot檢測細胞凋亡將待檢測的神經(jīng)干細胞棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗一遍；將培養(yǎng)皿置于冰上，加入含蛋白酶抑制劑PSMF的RIPA蛋白裂解液，裂解液浸潤細胞即可；在冰上裂解存放15 min，期間晃動培養(yǎng)皿3次，使裂解液充分接觸細胞；加入蛋白上樣緩沖液，用移液器吹打掉細胞并將蛋白溶液轉(zhuǎn)移至EP管中，煮沸5 min備用。利用10% SDS-PAGE膠對提取的蛋白進行分離，并將分離開的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將膜與對應(yīng)的一抗，包括抗JNK(1 ∶1 000)、抗P-JNK(1 ∶1 000)、抗Caspase 3(1 ∶1 000)，抗Cleaved-caspase3(1 ∶1 000)、抗β-acting(1 ∶2 000)進行孵育，孵育條件為4 ℃過夜。待使用1×TBST清洗膜3遍后，加入對應(yīng)的二抗(1 ∶3 000)進行孵育，條件為室溫1 h。再次使用1×TBST清洗膜3次后，使用增強化學發(fā)光法進行蛋白條帶檢測。

1.5 相對定量檢測將細胞培養(yǎng)液棄去，用PBS清洗1遍，加入TRIzol，用異丙醇沉淀法提取RNA，用oligo(dT)作為下游引物反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用相應(yīng)的引物做定量PCR，以β-actin為內(nèi)參。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，序列如下表1所示。

1.6 統(tǒng)計學處理統(tǒng)計性數(shù)據(jù)均來自3次獨立實驗，灰度值用Image J軟件統(tǒng)計，凋亡數(shù)據(jù)統(tǒng)計時采用等比例換算后用Graphpad Prism5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。采用兩獨立樣本t檢驗以及單因素方差分析(One-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠原代脊髓神經(jīng)干細胞分離使用熒光抗體anti-Nestin-PE標記消化分離得到的小鼠第一代神經(jīng)細胞，經(jīng)流式細胞儀第一次分選后得到強熒光的細胞群(Ⅱ)(圖1A)。將這群細胞置于神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)一代，用anti-CD133-APC熒光抗體標記，并進行第二次分選，最終得到CD133陽性的Ⅳ亞群細胞(圖1B)，即為初步分離的原代神經(jīng)干細胞。將分離過程中的第Ⅱ、Ⅳ亞群細胞和原代總細胞進行鑒定。相對定量檢測結(jié)果顯示，神經(jīng)干細胞標記基因Nestin在分選后的細胞中在第一次分選得到的Ⅱ亞群細胞中表達量高于對照組(t=16.56，P<0.001)。在用CD133再次分選后的第Ⅳ亞群細胞的Nestin表達量也高于對照組細胞(t=15.23，P<0.001)，見圖1C。另外一個神經(jīng)干細胞標記基因CD133僅在用CD133進行第二次篩選后的第Ⅳ亞群細胞表達量增高(t=4.497，P<0.05)，見圖1D。圖1E中，神經(jīng)干細胞SOX2基因在用Nestin分選得到的第Ⅱ、Ⅳ亞群細胞中均表現(xiàn)出較高的表達(t=4.105，P<0.05；t=27.86，P<0.001)。如圖1F～H所示，星形膠質(zhì)細胞，少突膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元標記基因GFAP(t=5.609，P<0.01；t=10.62，P<0.001)和NeuN(t=12.05，P<0.001；t=11.19，P<0.001)的表達在兩次分選得到的細胞中均表現(xiàn)出減少的趨勢，CD11c(t=1.927，P>0.05；t=3.011，P<0.05)在第二次分選后表達量降低。以上結(jié)果顯示，這種兩步法分離的原代神經(jīng)干細胞能夠表達神經(jīng)干細胞的一般標記基因，且非干細胞標記基因的表達量較低。

圖1 小鼠原代脊髓神經(jīng)干細胞分離鑒定A：利用Nestin分子標記對神經(jīng)干細胞進行流式分選；B：利用CD133分子標記對神經(jīng)干細胞進行二次流式分選；C～H: 利用qRT-PCR對對照組細胞及分選后的第Ⅱ、Ⅳ亞群細胞中Nestin、 CD133、SOX2、GFAP、CD11c、NeuN分子mRNA水平進行檢測；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.2 神經(jīng)干細胞分化鑒定為了檢驗分離到的神經(jīng)干細胞是否有分化為其它神經(jīng)細胞的能力，將神經(jīng)干細胞放在普通的培養(yǎng)基中培養(yǎng)約7 d，然后進102行免疫熒光染色鑒定。熒光染色結(jié)果顯示，可清晰的檢測到神經(jīng)干細胞的標志蛋白SOX2；標記神經(jīng)元的MAP2蛋白能夠在少部分細胞中檢測到，表明有少部分神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化(圖2A)。此時對這些分化的細胞進行相對定量檢測神經(jīng)干細胞標記基因Nestin、CD133和SOX2的表達量(t=5.674，P<0.01；t=3.537，P<0.05；t=3.644，P<0.05)。定量結(jié)果顯示，在分化后這些基因的表達水平不同程度的降低(圖2B、C、D)。如圖2E～G所示，指示神經(jīng)干細胞分化的基因GFAP、CD11c和NeuN(t=7.033，P<0.01；t=9.479，P<0.001；t=9.110，P<0.001)的mRNA豐度表現(xiàn)出不同水平的提高。以上結(jié)果提示，該神經(jīng)干細胞能夠向相關(guān)神經(jīng)細胞分化。

圖2 小鼠原代神經(jīng)干細胞分化能力檢測 ×400A：免疫熒光檢測MAP2和SOX2的表達；B～G：利用qRT-PCR對神經(jīng)干細胞及分化細胞的細胞內(nèi)源性Nestin、CD133、SOX2、GFAP、CD11c、NeuN 分子mRNA表達量進行檢測；與神經(jīng)干細胞組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.3 利多卡因激活JNK信號通路誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞損傷用含500 μmol/L利多卡因的培養(yǎng)液培養(yǎng)神經(jīng)干細胞24 h后，相對定量檢測神經(jīng)干細胞的凋亡相關(guān)標記基因的變化。結(jié)果顯示JNK信號通路激活的c-Jun(t=13.74，P<0.01)和ATF2表達量相對提高(t=15.26，P<0.01)，促進凋亡的FasL表達量較對照組提高(t=12.87，P<0.01)，而抑制凋亡的Bcl2表達量相對降低(t=24.67，P<0.01)，見圖3A。此外，相對定量檢測發(fā)現(xiàn)干細胞標記基因SOX2表達相對降低(t=7.566，P<0.01)，而神經(jīng)元標記基因NeuN的表達量沒有變化(t=0.062，P>0.05)，見圖3B。Western blot檢測用利多卡因處理24 h后的神經(jīng)干細胞，結(jié)果顯示，磷酸化的JNK蛋白含量相對增加(t=17.57，P<0.01)，提示凋亡的Cleaved-caspase3含量相對增加(t=9.978，P<0.01)，見圖3C。

圖3 利多卡因?qū)ι窠?jīng)干細胞的影響A：神經(jīng)干細胞細胞凋亡相關(guān)基因mRNA水平檢測；B：神經(jīng)干細胞標志物SOX2和NeuN mRNA水平檢測；C：JNK、 P-JNK、Caspase 3、Cleaved-caspase 3 蛋白表達水平檢測；1：對照組；2：利多卡因處理組；與對照組比較：**P<0.01，***P<0.001

2.4 人參皂苷抑制神經(jīng)干細胞JNK信號通路激活配制含100 μmol/L人參皂苷干細胞培養(yǎng)液，用該培養(yǎng)液培養(yǎng)神經(jīng)干細胞48 h，相對定量檢測凋亡相關(guān)基因的變化。圖4A的結(jié)果顯示JNK信號通路激活相關(guān)的基因c-Jun、ATF2以及促進凋亡相關(guān)的FasL的mRNA豐度降低，而抑制凋亡的基因Bcl2表達量提高。(t=3.371，P<0.05；t=14.22，P<0.001)。此外，相對定量結(jié)果顯示人參皂苷能夠提高神經(jīng)干細胞標記基因SOX2的表達，并抑制神經(jīng)元基因NeuN的表達(t=5.183，P<0.01；t=3.267，P<0.05)，見圖4B。圖4C中，Western blot 結(jié)果顯示，人參皂苷加入后能夠減少P-JNK 蛋白含量(t=2.935，P<0.05)，提示凋亡的Cleaved-caspase3表達量也減少(t=3.651，P<0.05)。

圖4 人參皂苷Rb1對神經(jīng)干細胞的影響A：神經(jīng)干細胞細胞凋亡相關(guān)基因mRNA水平檢測；B：神經(jīng)干細胞標志物SOX2和NeuN mRNA水平檢測；C：JNK、P-JNK、Caspase 3、Cleaved-caspase 3蛋白表達水平檢測；1：對照組；2：Rb1處理組；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.5 人參皂苷抑制利多卡因誘導(dǎo)的神經(jīng)干細胞損傷為了驗證人參皂苷能否減輕利多卡因造成的損傷，在培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞中同時添加利多卡因和人參皂苷進行處理。相對定量結(jié)果顯示，在500 μmol/L利多卡因 和50 μmol/L人參皂苷Rb1共處理的細胞中，僅FasL的表達量有所降低，c-Jun、ATF2和Bcl2的mRNA豐度無變化(t=4.977，P<0.01；t=0.1348，P>0.05；t=1.144，P>0.05；t=14.22，P>0.05)，見圖5A。圖5B中，神經(jīng)干細胞標記基因SOX2的表達量變化不大(t=0.467，P>0.05)，而神經(jīng)元標記基因NeuN的表達豐度則在處理后降低(t=6.964，P<0.01)。此外，在驗證人參皂苷能否抵消利多卡因的損傷實驗中，將人參皂苷分成3個濃度梯度(10、50、100 μmol/L)，結(jié)果顯示人參皂苷加入后能夠抑制JNK磷酸化的變化(t=3.820，P<0.05；t=8.542，P<0.05；t=13.25，P<0.01)，也能減少凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase3的表達量(t=2.286，P>0.05；t=4.202，P<0.05；t=17.407，P<0.01)，圖5C為三次結(jié)果的灰度值。

圖5 人參皂苷Rb1對利多卡因誘導(dǎo)的神經(jīng)干細胞損傷修復(fù)作用檢測A：Rb1和利多卡因共處理后神經(jīng)干細胞細胞凋亡相關(guān)基因mRNA水平檢測；B：Rb1和利多卡因共處理后神經(jīng)干細胞標志物SOX2和NeuN mRNA水平檢測；C：Rb1和利多卡因共處理后JNK、P-JNK、Caspase3、Cleaved-caspase3蛋白表達檢測；1：利多卡因單處理組；2：利多卡因+10 μmol/L Rb1處理組；3：利多卡因+50 μmol/L Rb1 處理組；4：利多卡因+100 μmol/L Rb1 處理組；與對照組比較：##P<0.01；與利多卡因單處理組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

局部麻醉藥品對神經(jīng)系統(tǒng)及神經(jīng)干細胞有一定損傷，但是目前仍不清楚其具體的機制。許多中藥也被證明能夠修復(fù)神經(jīng)損傷，例如參附注射液能夠部分保護布比卡因?qū)ι窠?jīng)組織的損傷[8]。白藜蘆醇也能夠修復(fù)局麻藥羅哌卡因的部分神經(jīng)毒性[9]。但是目前臨床上仍然不能完全避免局麻藥對神經(jīng)組織的損傷作用，需要探索新的方案及藥物去減輕局麻藥的相關(guān)副作用。人參是我國的傳統(tǒng)藥用植物，其主要藥理活性成分為人參皂苷。人參皂苷化合物有40種，具有抗氧化、緩解心血管病變、減緩腫瘤發(fā)展、改善腦部缺血、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等功能[10]。原人參二醇代表成分人參皂苷Rb1已被證明在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，例如促進神經(jīng)干細胞增殖[4]。但是，目前尚不清楚人參皂苷Rb1是否可抑制局部麻醉藥物造成的神經(jīng)干細胞損傷。

為了探究這一問題，本研究首先需要分離脊髓神經(jīng)干細胞。本文在分離脊髓源神經(jīng)干細胞的過程中使用了Nestin和CD133流式抗體。Nestin是神經(jīng)干細胞的標記[11]，其抗體特異性識別神經(jīng)組織中的某些細胞[12]。本實驗中分離原代神經(jīng)干細胞時采用Nestin作為分選標記，在第一步分離后所得到的分離細胞在細胞亞群上區(qū)分不明顯，這可能是原代細胞比較雜亂造成的。而在用經(jīng)典的神經(jīng)干細胞標記CD133做第二次分選時，得到了將近7%的陽性細胞，且這些二次分選的細胞高度表達神經(jīng)干細胞標志基因SOX2[13-14]，神經(jīng)細胞分化的相關(guān)標記基因則呈現(xiàn)低表達狀態(tài)，說明細胞保持了很好的干細胞狀態(tài)。文中采用MAP2作為陽性細胞標志進行檢測，并輔助以GFAP、CD11c和NeuN的mRNA表達量作為分化的標志來判斷分選出的脊髓神經(jīng)干細胞的分化能力。通過對比分化前后的標志物表達量趨勢變化以及免疫熒光檢測的結(jié)果來綜合判斷細胞的分化能力。文中的結(jié)果提示用Nestin和CD133兩個標記分兩步分選脊髓來源神經(jīng)干細胞，以及通過上述標志物分子鑒定細胞分化能力是可行的，該方法能夠較為有效地分離到較高純度的脊髓神經(jīng)干細胞，對以后的分離和鑒定手段提供了一定的參考價值。

利多卡因是一種較常用的局麻藥，本實驗中通過利多卡因刺激神經(jīng)干細胞，結(jié)果表明利多卡因能夠激活神經(jīng)干細胞的JNK信號通路。JNK信號參與調(diào)控細胞凋亡，其通路下游被激活的c-Jun等分子可進一步激活凋亡相關(guān)基因。JNK還可以通過經(jīng)典的線粒體凋亡途徑促進Bcl家族成員參與凋亡調(diào)控。文中，利多卡因不僅激活了JNK通路，還促進了神經(jīng)干細胞的凋亡，因此結(jié)合JNK通路的特性，推測利多卡因可通過JNK通路影響神經(jīng)干細胞的生長。而對JNK通路信號進行阻斷或抑制則有可能回復(fù)利多卡因?qū)ι窠?jīng)干細胞的影響。

之前的研究顯示人參皂苷Rb1可降低JNK通路中JNK1和c-Jun的表達，提示人參皂苷Rb1可作為JNK通路潛在的抑制劑[7-8]。本實驗結(jié)果也顯示Rb1處理可降低JNK信號通路激活相關(guān)的基因c-Jun、ATF2的表達量。而mRNA及蛋白水平的凋亡分子檢測表明加入Rb1可抑制所分離的神經(jīng)干細胞的凋亡。該結(jié)果證明人參皂苷Rb1在神經(jīng)干細胞中可以抑制JNK通路的激活，從而抑制神經(jīng)干細胞的凋亡。而SOX2的表達量則說明Rb1并不會影響神經(jīng)干細胞狀態(tài)的維持，表明了Rb1作用的特異性。文中進一步探討人參皂苷Rb1能否通過抑制JNK通路修復(fù)利多卡因?qū)ι窠?jīng)干細胞的損傷作用。本文研究顯示人參皂苷不僅降低了利多卡因誘導(dǎo)的JNK信號通路激活，還抑制了凋亡相關(guān)基因Caspase3的活化，即抑制了神經(jīng)干細胞的凋亡。