長(zhǎng)鏈非編碼RNA FAM83H-AS1對(duì)胃癌細(xì)胞周期、增殖和轉(zhuǎn)移的影響及作用機(jī)制

王 濤，馬牧原，葉曉鋒

胃癌是全球第五大最常見的腫瘤，也是第三大最致命的腫瘤，在中國(guó)，每年報(bào)告超過40萬例新病例，占全球總數(shù)的42%[1]。在過去的幾十年中，盡管胃癌的診斷和治療得到了顯著改善，但患者的5年生存率仍然很低[2]，因此有必要探索胃癌新型治療靶標(biāo)的分子機(jī)制和鑒定。研究[3]報(bào)道表觀遺傳學(xué)在胃癌的進(jìn)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)屬于表觀遺傳學(xué)的一種，在人類惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。lncRNA序列相似性家族83成員H反義RNA 1(lncRNA family with sequence similarity 83 member H antisense RNA 1, lncRNA FAM83H-AS1)是新近發(fā)現(xiàn)的lncRNA之一，在肝細(xì)胞肝癌、結(jié)直腸癌和卵巢癌等惡性腫瘤中高表達(dá)，發(fā)揮促癌基因作用[4-6]。Da et al[7]報(bào)道FAM83H-AS1在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，并與胃癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)。該文探討了FAM83H-AS1在胃癌中發(fā)揮的具體作用。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑與材料人胃癌細(xì)胞系MKN-45、SGC-7901、MGC-803和人永生化正常胃上皮細(xì)胞GES-1(美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù))，DMEM-F12培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清(美國(guó)gibco公司)，PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄、SYBR Premix Ex TaqTMqRT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)，siRNA(廣州銳博生物)，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒和BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物)，MTS試劑(美國(guó)Biovision公司)，Transwell小室(美國(guó)BD公司)；蛋白裂解液(北京索萊寶生物)，cyclinD1、CDK4、E鈣黏蛋白、N鈣黏蛋白和波形蛋白抗體(美國(guó)proteintech公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染MKN-45和SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)基為RPMI1640培養(yǎng)基，MGC-803和GES-1細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM-F12，胎牛血清濃度均為10 %，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。將呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MKN-45細(xì)胞以1.0×105個(gè)/孔鋪至6孔板中，分為對(duì)照組(si-NC)和實(shí)驗(yàn)組(si-FAM83H-AS1)，將NC siRNA和FAM83H-AS1 siRNA與lip2000混勻后加入各組細(xì)胞中，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)FAM83H-AS1的表達(dá)胰酶消化離心收集細(xì)胞，加入TRIzol試劑裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞中總RNA。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA，并以cDNA為模板，按照SYBR Premix Ex TaqTM qRT-PCR試劑盒配制反應(yīng)體系進(jìn)行qRT-PCR，按2步反應(yīng)進(jìn)行，即95 ℃預(yù)變性5 s，以 95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，獲得各樣品的循環(huán)閾值(threshold cvcle，Ct)，以2-ΔΔCt公式計(jì)算FAM83H-AS1相對(duì)表達(dá)量。FAM83H-AS1引物F: 5′-TAGGAAACGAGCGAGCCC-3′, R: 5′- GCTTTGGGTCTCCCCTTCTT-3′。內(nèi)參GAPDH引物F:5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3′,R: 5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。

1.4MTS收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MKN-45細(xì)胞以2 000個(gè)/孔鋪至96孔板中，分為對(duì)照組(si-NC)和實(shí)驗(yàn)組(si-FAM83H-AS1)，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，按上述siRNA轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別在轉(zhuǎn)染0、24、48、72 h時(shí)，每孔加入20 μl MTS試劑在培養(yǎng)箱中孵育2 h，全波長(zhǎng)掃描儀檢測(cè)490 nm的吸光度(optical density,OD)值。

1.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MKN-45細(xì)胞以300個(gè)/孔鋪至6孔板中，分為si-NC和si-FAM83H-AS1，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，按上述siRNA轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞形成肉眼可見的細(xì)胞克隆團(tuán)時(shí)終止培養(yǎng)，PBS洗3次，甲醇固定10 min，結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)克隆團(tuán)個(gè)數(shù)。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)收集6孔板中轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗3次后細(xì)胞計(jì)數(shù)，1×105個(gè)細(xì)胞重懸于100 μl基礎(chǔ)血清培養(yǎng)基中加至Transwell小室膜上，膜下加入含10%胎牛血清的500 μl培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h后終止培養(yǎng)，將未轉(zhuǎn)移的細(xì)胞洗去，甲醇固定10 min，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)收集6孔板中轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，加入蛋白裂解液，超聲裂解10 min，4 ℃高速離心20 min，去除細(xì)胞碎片。檢測(cè)蛋白濃度，加入上樣緩沖液煮沸變性，進(jìn)行電泳分離蛋白(80 V, 2 h)，蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上(350 mA, 2 h)，5% 脫脂牛奶封閉1 h，4 ℃一抗孵育過夜，室溫二抗孵育2 h，ECL超敏化學(xué)發(fā)光曝光，Image J軟件進(jìn)行蛋白灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 FAM83H-AS1在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平采用qRT-PCR檢測(cè)FAM83H-AS1在人胃癌細(xì)胞系MKN-45、SGC-7901、MGC-803和人永生化正常胃上皮細(xì)胞GES-1中的表達(dá)情況，F(xiàn)AM83H-AS1在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)高于在人永生化正常胃上皮細(xì)胞GES-1中的表達(dá)，在MKN-45細(xì)胞中的表達(dá)最高(P<0.05)，見圖1。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)FAM83H-AS1在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況與GES-1比較：*P<0.05

2.2 FAM83H-AS1 siRNA轉(zhuǎn)染效果驗(yàn)證FAM83H-AS1 siRNA干擾MKN-45細(xì)胞中FAM83H-AS1的表達(dá)效果。與si-NC相比，si-FAM83H-AS1組中FAM83H-AS1相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)。FAM83H-AS1 siRNA可以干擾MKN-45細(xì)胞中FAM83H-AS1的表達(dá)，見圖2。

圖2 qRT-PCR 驗(yàn)證FAM83H-AS1干擾慢病毒感染效果與si-NC比較：*P<0.05

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期FAM83H-AS1 siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞MKN-45 48 h后，與si-NC組相比，si-FAM83H-AS1組細(xì)胞阻滯在G0/G1期(P<0.05)，見圖3。

圖3 MTS檢測(cè)干擾FAM83H-AS1的表達(dá)對(duì)MKN-45細(xì)胞周期的影響與si-NC比較：*P<0.05

2.4 MTS檢測(cè)細(xì)胞增殖能力FAM83H-AS1 siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞MKN-45 48 h后，MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示與si-NC組相比，si-FAM83H-AS1組細(xì)胞增殖能力降低(P<0.05)，見圖4。

圖4 MTS檢測(cè)干擾FAM83H-AS1的表達(dá)對(duì)MKN-45細(xì)胞增殖的影響與si-NC比較：*P<0.05

2.5 平板克隆檢測(cè)細(xì)胞克隆形成平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示與si-NC組比較，si-FAM83H-AS1組細(xì)胞克隆形成能力降低(P<0.05)，見圖5。

圖5 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾FAM83H-AS1的表達(dá)對(duì)MKN-45細(xì)胞克隆形成能力的影響與si-NC比較：*P<0.05

2.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力FAM83H-AS1 siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞MKN-45 48 h后Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示與si-NC組相比，si-FAM83H-AS1組轉(zhuǎn)移能力降低(P<0.05)，見圖6。

圖6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾FAM83H-AS1的表達(dá)對(duì)MKN-45細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響 ×200與si-NC比較：*P<0.05

2.7 FAM83H-AS1對(duì)細(xì)胞周期蛋白的影響收集轉(zhuǎn)染48 h的各組蛋白，Western blot實(shí)驗(yàn)顯示與si-NC組相比，si-FAM83H-AS1組細(xì)胞中cyclinD1和細(xì)胞周期蛋白依賴激酶4(cyclin dependent kinase 4, CDK4)蛋白的表達(dá)降低(P<0.05)，見圖7、表1。

表1 各組細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白的相對(duì)表達(dá)量

圖7 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾FAM83H-AS1的表達(dá)對(duì)MKN-45細(xì)胞中周期蛋白的影響

2.8 FAM83H-AS1對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程 (epithelial-mesenchymal transition, EMT)的影響收集轉(zhuǎn)染48 h的各組蛋白，Western blot實(shí)驗(yàn)顯示與si-NC組相比，si-FAM83H-AS1組細(xì)胞中EMT標(biāo)志蛋白E鈣黏蛋白蛋白表達(dá)增加，N鈣黏蛋白和波形蛋白蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，見圖8、表2。

圖8 western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾FAM83H-AS1的表達(dá)對(duì)MKN-45細(xì)胞EMT的影響

表2 各組細(xì)胞中EMT標(biāo)志蛋白的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

個(gè)體化精準(zhǔn)治療-分子靶向治療已經(jīng)應(yīng)用于其它晚期惡性腫瘤治療[8]，但由于胃癌強(qiáng)大的異質(zhì)性，胃癌的分子靶向藥物目前仍處于臨床研究階段[9]，因此在分子水平探索胃癌的進(jìn)展機(jī)制，有助于胃癌治療靶點(diǎn)的研究。

lncRNA的發(fā)現(xiàn)為研究胃癌惡性表型的潛在生物學(xué)機(jī)制提供了見解，lncRNA是長(zhǎng)度>200個(gè)核苷酸的RNA，其可通過與蛋白質(zhì)、RNA和DNA或其他細(xì)胞大分子相互作用介導(dǎo)各種細(xì)胞生物學(xué)過程[3]。胃癌中越來越多表達(dá)失調(diào)的lncRNA逐漸被發(fā)現(xiàn)，其中胃癌組織中FAM83H-AS1表達(dá)增加，并且是胃癌總生存率和無進(jìn)展生存期的危險(xiǎn)因素[7]。而研究[5-6]報(bào)道FAM83H-AS1在肝細(xì)胞肝癌組織、結(jié)直腸癌組織、卵巢癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤患者不良病理參數(shù)和患者預(yù)后不良相關(guān)，并且FAM83H-AS1與這些腫瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。敲低FAM83H-AS1可以顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[4]。siRNA抑制細(xì)胞中FAM83H-AS1的表達(dá)后降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移并增加凋亡[5]。FAM83H-AS1是否與胃癌增殖轉(zhuǎn)移有關(guān)引起了關(guān)注，本文在細(xì)胞水平檢測(cè)了FAM83H-AS1在胃癌中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示FAM83H-AS1在胃癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并選擇其表達(dá)最高的MKN-45胃癌細(xì)胞系抑制FAM83H-AS1的表達(dá)，生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)顯示干擾FAM83H-AS1的表達(dá)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期，并抑制胃癌細(xì)胞的增殖活性和轉(zhuǎn)移能力。與Shan et al[10]報(bào)道的沉默F(xiàn)AM83H-AS1表達(dá)可抑制膀胱癌細(xì)胞增殖和遷移，并誘導(dǎo)G0 / G1期細(xì)胞周期停滯的研究一致。

FAM83H-AS1在胃癌中為促癌因子，其發(fā)揮作用的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。細(xì)胞周期調(diào)控失控導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的惡性增殖是腫瘤的重要特征，在生理狀態(tài)下細(xì)胞具有嚴(yán)密的周期調(diào)控機(jī)制，其中細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶發(fā)揮關(guān)鍵作用。細(xì)胞周期蛋白CyclinD1是原癌基因，由于基因擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)和染色體易位等導(dǎo)致其蛋白過度表達(dá)，過度表達(dá)的CyclinD1與CDK4結(jié)合，兩者均是周期正性調(diào)控因子，促使細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖[11]。本文采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表明抑制FAM83H-AS1的表達(dá)后，胃癌細(xì)胞中cyclinD1和CDK4蛋白的表達(dá)降低。表明FAM83H-AS1可能通過減少細(xì)胞周期cyclinD1和CDK4蛋白的表達(dá)抑制細(xì)胞的增殖。EMT是上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型的細(xì)胞的生物學(xué)過程，其在胚胎發(fā)育生理過程和腫瘤轉(zhuǎn)移病理過程中均發(fā)揮重要作用[12]。研究[13]報(bào)道抑制腫瘤細(xì)胞的EMT，腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力減弱，EMT是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示干擾FAM83H-AS1的表達(dá)后，胃癌細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)志分子E-cadherin蛋白表達(dá)增加，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物分子N-cadherin和Vinmentin蛋白表達(dá)降低。表明FAM83H-AS1在胃癌中通過調(diào)控EMT促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移。