燈盞花素調(diào)控NLRP3炎癥小體活化抑制慢性腦缺血大鼠神經(jīng)元細胞焦亡與凋亡作用

王少華，孫凡凡，薛 威，江 勤，董六一

慢性腦缺血(chronic cerebral ischemia，CCI)在臨床上神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起關鍵作用。長期慢性大腦缺血，引起神經(jīng)元蛋白質(zhì)合成減少、能量代謝障礙和神經(jīng)元缺失等，上述變化是CCI患者認知功能損害的重要病理生理學基礎與共同的病理學特征[1]。臨床上CCI患者致殘率、復發(fā)率和病死率均較高，如何有效改善CCI患者的病情，延緩其發(fā)展進程，是一個重要的科學問題。

研究[2]表明CCI后炎癥反應可加重神經(jīng)元損傷和認知功能障礙，抑制炎癥反應是有效抑制CCI后神經(jīng)元損傷的重要策略。細胞焦亡是一種細胞炎性壞死，參與了CCI的損傷過程[3]。燈盞花素(breviscapine，Bre)是菊科植物燈盞細辛中提取的有效黃酮類化合物單體成分，研究[4]顯示其有廣泛藥理學活性如抑制血栓形成等。但對Bre在CCI中抑制缺血后NLRP3炎癥小體活化觸發(fā)的細胞焦亡途徑鮮有報道，該文將進一步探討B(tài)re對CCI損傷所致認知功能的改善作用，初步探明Bre抑制CCI后神經(jīng)元損傷的細胞焦亡機制，為其臨床應用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動物50只SD雄性大鼠，體質(zhì)量260～280 g，SPF級，上海西普爾必凱實驗動物有限公司，生產(chǎn)合格證號：SZXK(滬)2016-001。飼養(yǎng)室飼養(yǎng)溫度23 ℃±2 ℃，飼養(yǎng)空氣濕度為45%～75%，實驗室照明周期為12 h/12 h，SD大鼠自由飲水攝食。

1.2 藥品與試劑Bre購于昆明龍津藥業(yè)股份公司，批號：20170615；BCA蛋白濃度測定試劑盒、Western blot一抗稀釋液、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜蛋白上樣緩沖液(5×)購于上海碧云天生物技術(shù)公司；Caspase-3抗體購于Abcam公司；β-actin單克隆抗體、辣根過氧化酶標記抗鼠IgG、辣根過氧化酶標記抗兔IgG購于北京中杉金橋有限公司； PVDF膜購于美國Merck Millipore公司；超敏度ECL發(fā)光液購于北京Bridgen公司；TUNEL試劑盒購于上海翊圣生物科技有限公司。

1.3 實驗儀器Morris水迷宮實驗系統(tǒng)購于中國生命科學院；石蠟切片機購于德國LECIA公司；TGL-16R高速冷凍離心機購于珠海黑馬儀器有限公司；BX-51型熒光正置顯微鏡購于日本Olympus Corporation公司；DYC-Mini1型垂直電泳槽、DYC-ZY2型轉(zhuǎn)印電泳槽購于北京東方瑞利電泳設備有限公司；EL104電子天平購于梅特勒-托利多儀器有限公司；TS-1水平搖床購于海門市其林貝爾儀器制造公司；MT 200水迷宮圖像追蹤系統(tǒng)監(jiān)測購于成都儀器廠；化學發(fā)光成像儀購于上海勤翔科學儀器公司；NW10UF超純水機購于深圳力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；制冰機購于常熟雪科電器有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1分組 將大鼠隨機均分為5組，分別為假手術(shù)組、2VO結(jié)扎組、2VO結(jié)扎+Bre 2.5 mg/kg組、2VO結(jié)扎+Bre 5 mg/kg組、2VO結(jié)扎+Bre 10 mg/kg 組。

1.4.2制備大鼠雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎(2VO)模型 SD雄性大鼠手術(shù)前禁食不禁水12 h，實驗前大鼠用水合氯醛(30 mg/kg)進行麻醉，麻醉后將其置于控溫電熱毯上，使大鼠體溫維持在37 ℃左右。之后將其仰臥位固定在大鼠板上，用脫毛劑脫去大鼠頸部的毛，脫毛皮膚用碘伏進行消毒處理。沿大鼠頸部正中線做1 cm縱向切口，分離皮膚組織，充分暴露頸部肌肉，用鑷子輕輕分開大鼠頸部肌肉，暴露大鼠雙側(cè)頸總動脈(避免損傷迷走神經(jīng))，用5-0號手術(shù)尼龍線結(jié)扎大鼠左右兩側(cè)頸總動脈。結(jié)扎后縫合大鼠頸部皮膚切口，縫合后用碘伏消毒。然后置于籠中飼養(yǎng)，自由飲水、攝食。假手術(shù)組SD大鼠僅行手術(shù)操作但不結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈。給藥組在大鼠成功造模后連續(xù)腹腔注射不同劑量的Bre(給藥容積為1 ml/100 g體質(zhì)量)4周，假手術(shù)組和2VO結(jié)扎組僅注射等量的生理鹽水。

1.4.3大鼠水迷宮實驗 大鼠水迷宮實驗參考文獻[5-6]稍改進，水迷宮按東南西北4 個方向?qū)A柱形水槽平均劃為4個象限(第一、第二、第三、第四)，平臺設在第三象限，位于水面下約3 cm，實驗時取第一象限為入水點(離平臺最遠象限)，面向池壁將大鼠輕輕放入水中，實時記錄大鼠60 s內(nèi)找尋到平臺的時間與軌跡。如大鼠60 s內(nèi)未找到平臺，引導大鼠至平臺上，熟悉30 s(記大鼠潛伏期為60 s)。各組大鼠每天訓練1次，連續(xù)訓練5 d。空間探索試驗：研究大鼠對空間位置的記憶能力。訓練后第6天，將第三象限平臺撤除，從第一象限將大鼠面向池壁放入水中，儀器自動采集和記錄SD大鼠在60 s內(nèi)的游泳距離、潛伏期、穿越目標象限次數(shù)和目標象限停留時間。造模后，各組大鼠分別有死亡，最終水迷宮實驗每組均有8只大鼠納入統(tǒng)計學分析。

1.4.4HE染色與TUNEL染色 實驗結(jié)束后處死大鼠，斷頭取5只大鼠腦置于4%多聚甲醛浸泡固定，1周后將大腦石蠟包埋制片，按照試劑盒說明書要求進行蘇木精-伊紅(HE)染色與TUNEL染色，然后置于正置顯微鏡攝片，進行圖片分析處理。神經(jīng)元細胞凋亡率=平均吸光度×陽性細胞百分比×100%。

1.4.5Western blot檢測相關蛋白表達 取50 mg大鼠海馬組織，冰上研磨成組織勻漿； RIPA裂解液適量進行裂解, 4 ℃低溫離心10 min，取上清液，測蛋白濃度進行定量。取30 μg蛋白上樣，凝膠電泳, 電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，進行牛奶封閉、TBST漂洗，然后加入NLRP3，Caspase 1、白細胞介素 (interleukin, IL)-6、IL-1β和cleaved Caspase-3蛋白一抗(1 ∶1 000), 置于4 ℃冰箱過夜，加入二抗(1 ∶1 000，辣根過氧化物酶標記) ，然后洗膜，將ECL化學發(fā)光顯影按1 ∶1的比例將A液、B液均勻混合，然后經(jīng)成像系統(tǒng)進行顯影拍照，用Image J分析軟件對條帶灰度值進行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 Bre對CCI大鼠認知功能的影響Morris水迷宮實驗顯示，造模4周后各組大鼠游泳速度沒有差異(F=1.185，P>0.05)(表1)。與假手術(shù)組比較，2VO結(jié)扎組大鼠找尋平臺的潛伏期延長(F=20.20，P<0.01)，Bre高中劑量組大鼠找尋到平臺的潛伏期縮短(P<0.01)；與假手術(shù)組相比，2VO結(jié)扎組大鼠在第三象限的停留時間縮短(F=21.69，P<0.01)，穿越平臺次數(shù)減少(F=16.89，P<0.01)，與2VO結(jié)扎組比較，Bre中、高劑量組大鼠在目標象限停留的時間明顯延長，穿越平臺次數(shù)增多(P<0.01)，提示Bre能改善CCI大鼠的空間學習和記憶能力。

表1 Bre對CCI大鼠認知功能的影響

2.2 Bre對CCI大鼠腦組織病理學作用病理學檢查結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元以及神經(jīng)膠質(zhì)細胞排列整齊，核膜核仁清楚，細胞形態(tài)正常，未見病理性損傷；2VO結(jié)扎組大鼠大腦皮層神經(jīng)元呈現(xiàn)變性、壞死，間質(zhì)細胞水腫，神經(jīng)元細胞與血管周圍間隙增寬，膠質(zhì)細胞胞質(zhì)透亮、腫脹明顯。Bre給藥組可不同程度減輕皮層神經(jīng)元細胞核固縮，神經(jīng)元細胞數(shù)量較多，形態(tài)改善。大鼠海馬CAl區(qū)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，2VO結(jié)扎組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞核濃縮深染，數(shù)目減少，Bre給藥組不同程度減輕CA1區(qū)神經(jīng)元細胞損傷。提示Bre可減輕CCI大鼠大腦皮層和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的損傷(圖1)。

圖1 Bre對CCI大鼠皮層和海馬CA1區(qū)病理學損傷的影響 HE染色×200A：假手術(shù)組；B：2VO結(jié)扎組；C：2VO結(jié)扎+Bre 2.5 mg/kg組；D：2VO結(jié)扎+Bre 5 mg/kg組；E：2VO結(jié)扎+Bre 10 mg/kg組；1：大腦皮層；2：海馬CA1區(qū)

2.3 Bre對CCI大鼠皮層和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響TUNEL染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠神經(jīng)元形態(tài)呈圓形或橢圓形，細胞間間隙明顯，細胞膜與細胞核界限分明，形態(tài)正常的神經(jīng)元豐富； 2VO結(jié)扎組大鼠皮層和海馬組織均可見染成棕黃色或棕褐色的凋亡神經(jīng)元細胞，褐色凋亡顆粒較多，與假手術(shù)組比較，有統(tǒng)計學差異(皮層：F=66.24，P<0.01；海馬：F=56.31，P<0.01)；與2VO結(jié)扎組相比，Bre給藥組大鼠皮層和海馬組織中棕黃色或棕褐色的凋亡神經(jīng)元數(shù)量較少(P<0.05或P<0.01)，正常神經(jīng)元數(shù)量較多(圖2)。

圖2 Bre對CCI大鼠皮層和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞TUNEL染色圖及凋亡百分比圖 TUNEL染色×200A：假手術(shù)組；B：2VO結(jié)扎組；C：2VO結(jié)扎+Bre 2.5 mg/kg組；D：2VO結(jié)扎+Bre 5 mg/kg組；E：2VO結(jié)扎+Bre 10 mg/kg組；1：大腦皮層；2：海馬CA1區(qū)；與假手術(shù)組比較：##P<0.01；與2VO結(jié)扎組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.4 Bre對CCI大鼠海馬組織NLRP3、Caspase 1、IL-6、IL-1β和cleaved Caspase-3蛋白表達的影響與假手術(shù)組相比，2VO結(jié)扎組大鼠海馬組織中NLRP3炎癥小體激活，NLRP3蛋白表達上調(diào)(F=45.84，P<0.01)，并且Caspase 1(F=34.80，P<0.01)，IL-6(F=19.86，P<0.01)和IL-1β(F=22.46，P<0.01)蛋白表達均上調(diào)，同時Caspase 3激活，cleaved Caspase-3蛋白表達上調(diào)(F=12.31，P<0.01)；與2VO結(jié)扎組比較，Bre給藥組均不同程度抑制大鼠海馬組織中NLRP3炎癥小體活化，NLRP3蛋白表達減少，并且Caspase 1、IL-6和IL-1β蛋白表達均受抑制，cleaved Caspase-3蛋白表達量減少(P<0.05或P<0.01)(圖3)。

圖3 Bre對CCI大鼠海馬組織NLRP3、Caspase 1、IL-6、IL-1β和cleaved-Caspase3蛋白表達的影響1：假手術(shù)組；2：2VO結(jié)扎組；3：2VO結(jié)扎+Bre 2.5 mg/kg組；4：2VO結(jié)扎+Bre 5 mg/kg組；5：2VO結(jié)扎+Bre 10 mg/kg組；與假手術(shù)組比較：##P<0.01；與2VO結(jié)扎組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

大鼠CCI損傷形成的機制是由于結(jié)扎2VO后，基底動脈和基底動脈環(huán)血流形成側(cè)枝循環(huán)，引起一種代償?shù)穆阅X血流低灌注狀態(tài)。大腦慢性低灌注極易造成腦組織產(chǎn)生不同于急性缺血再灌注的缺血缺氧性損害[7]。慢性低灌注可造成大腦持續(xù)慢性缺血缺氧，引起神經(jīng)元細胞功能下降、導致認知功能障礙。本實驗顯示，2VO結(jié)扎大鼠4周后，各組大鼠的游泳能力無明顯差異，但2VO結(jié)扎組大鼠腦內(nèi)的神經(jīng)元細胞明顯減少，結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，空間認知功能出現(xiàn)障礙，與臨床上慢性缺血性腦損傷有良好的相似性，該模型對臨床上CCI患者的防治研究具有重要的作用和積極的影響。Bre是從燈盞花植物中提取的天然糖苷類黃酮單體物質(zhì)，有研究[8]表明其可以擴張血管，協(xié)助微循環(huán)并充當氧自由基的清除劑。此外，Bre在治療心血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面有重要作用[9-10]。但Bre對慢性低灌注腦缺血損傷及其機制研究報道較少。本研究結(jié)果顯示CCI導致大鼠的空間學習與記憶能力明顯下降，而Bre可顯著改善大鼠的空間學習與記憶能力，同時Bre可減輕CCI后的病理性損傷，神經(jīng)元形態(tài)改善，數(shù)量增多。本研究結(jié)果提示Bre對大鼠CCI損傷具有良好的保護作用。

NLRP3炎癥小體是一種重要的固有免疫模式識別受體，參與各種缺血后的炎癥反應，而NLRP3炎癥小體可觸發(fā)Caspase 1的激活。有研究[11]報道腦缺血后NLRP3及Caspase 1等蛋白表達上調(diào)，NLRP3炎癥小體活化，白細胞介素分泌增多，Caspase 1抑制劑可減少神經(jīng)元死亡，改善缺血后腦損傷。細胞凋亡和細胞焦亡都是細胞程序性死亡，在形態(tài)上細胞焦亡具有壞死和凋亡特征，細胞會出現(xiàn)核濃縮、DNA斷裂與TUNEL染色陽性，這與細胞凋亡相似，但細胞焦亡是由Caspase 1介導的，不是由傳統(tǒng)凋亡分子Caspase 3介導[12]。本研究結(jié)果顯示大鼠CCI后海馬組織中NLRP3炎癥小體激活，NLRP3蛋白表達顯著上調(diào)，并且Caspase 1、IL-6和IL-1β蛋白表達增多，提示NLRP3炎癥小體觸發(fā)Caspase 1的激活，促進IL-6和IL-1β分泌，導致神經(jīng)元細胞焦亡和炎性損傷，這與文獻報道一致。但Bre治療后可抑制CCI大鼠海馬組織NLRP3炎癥小體激活，抑制Caspase 1、IL-6和IL-1β蛋白表達，從而減少神經(jīng)元細胞焦亡和炎性損傷。

神經(jīng)元細胞凋亡是腦缺血損傷的重要機制之一。Caspase-3 是Caspases一系列級聯(lián)反應中最關鍵的下行的凋亡執(zhí)行蛋白酶[13]，早期Caspase-3活化為Cleaved Caspase-3，裂解胞質(zhì)胞核底物，引起細胞凋亡，Caspase-3一旦被激活，細胞凋亡的發(fā)生將不可逆轉(zhuǎn)[14-15]。本研究結(jié)果顯示TUNEL染色顯示大鼠CCI后皮層和海馬組織中凋亡細胞增多，并且海馬組織中cleaved Caspase-3蛋白的表達水平顯著上調(diào)，活化的Caspase-3進一步促進神經(jīng)元細胞的凋亡，給予Bre治療后CCI大鼠皮層和海馬組織中深棕色和褐色凋亡細胞減少，大鼠海馬組織中cleaved Caspase-3蛋白表達減少，導致神經(jīng)元細胞凋亡受抑制。

總之，Bre對CCI大鼠神經(jīng)元細胞的保護作用與抑制NLRP3炎癥小體活化觸發(fā)的細胞焦亡和Caspase-3介導的凋亡途徑有關。