不同緩沖溶液對BSA蛋白硝化和脂質(zhì)過氧化的影響

張 燕，李 麗，馮席汶，劉 銘，孫 楊

（西華大學(xué)理學(xué)院，四川 成都 610039）

蛋白質(zhì)硝化主要是指蛋白質(zhì)中的酪氨酸硝化成3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine,3-NT)，是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾。脂質(zhì)過氧化是體內(nèi)氧應(yīng)激增強后發(fā)生的活性氧（reactive oxygen species,ROS）氧化生物膜的過程。許多生理和病理狀態(tài)下都能檢測到3-NT的存在以及脂質(zhì)過氧化的相關(guān)產(chǎn)物，多種疾病如心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、糖尿病等的發(fā)生發(fā)展與它們密切相關(guān)[1-6]。

相關(guān)研究表明，某些因素如pH值、催化劑等也會影響蛋白質(zhì)硝化和脂質(zhì)過氧化。Herold等[7]發(fā)現(xiàn)在氧化肌紅蛋白存在的情況下，酪氨酸硝化在酸性溶液介質(zhì)中更能有效地進(jìn)行。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)不同形態(tài)的鐵催化蛋白硝酸也有所差異[8]?？梢?，溶液的酸堿性、催化劑等多種因素會影響蛋白質(zhì)酪氨酸硝化和脂質(zhì)過氧化。

緩沖溶液對維持生物的正常pH值和正常生理環(huán)境起到重要作用。人體血液中以H2CO3-HCO3-在血液中濃度最高，緩沖能力最大，對維持血液正常的pH值起主要作用。Tris堿的堿性強，可以只用這一種物質(zhì)配制pH范圍由酸性到堿性的大范圍pH值的緩沖液，加之Tris緩沖液對生物化學(xué)過程干擾很??；因此，該緩沖液目前在生物化學(xué)研究中使用得越來越多。磷酸鹽緩沖液因其寬的pH范圍以及受溫度影響小的特點而成為生物化學(xué)研究中使用最廣泛的一種緩沖劑。Hepes緩沖能力較強，pKa值為7.55，幾乎不受外界因素影響，并且不易形成緩沖劑-金屬離子復(fù)合物，也是一種廣泛應(yīng)用的緩沖劑。但相關(guān)研究[9]表明，Hepes具有阻斷陰離子通道、影響培養(yǎng)細(xì)胞生長、抑制平滑肌肌力等生物學(xué)效應(yīng)，因此，用Hepes作為緩沖劑時，其生物學(xué)效應(yīng)不可忽視。檸檬酸鹽緩沖液主要成分為檸檬酸和磷酸氫鈉，常用于免疫分析。

本文選擇5種常用緩沖溶液（碳酸鹽緩沖溶液、Tris-HCl緩沖溶液、磷酸緩沖溶液、檸檬酸緩沖溶液、Hepes緩沖溶液）來研究緩沖溶液對2種不同形態(tài)鐵（EDTA-Fe(Ⅲ)和檸檬酸鐵）催化H2O2-NO2-導(dǎo)致BSA蛋白硝化和脂質(zhì)過氧化的影響，以此來探討影響蛋白質(zhì)硝化和脂質(zhì)過氧化的因素。

1 材料與方法

1.1 試劑

牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA），亞硝酸鈉（sodium nitrite,NaNO2），雙氧水（hydrogen peroxide,H2O2），檸檬酸鐵，EDTA-Fe(Ⅲ)，磷酸鹽（phosphoric acid,PBS），鹽酸萘乙二胺，三氯乙酸（trichloroacetic acid,TCA），硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid,TBA），正丁醇（n-butanol），碳酸鈉，Tris-Base，磷酸鈉，檸檬酸，Hepes(2-［4-(2-hydroxyethyl) piperazinyl］ethanesulfonic acid)。

1.2 硝基酪氨酸含量的測定

在pH ＞ 9.5的條件下，3-NT在430 nm處有最大吸收，因此可以依據(jù)吸收光譜來計算其濃度。具體操作如下：取1 mL 10 mg·mL-1的BSA置于10 mL容量瓶中，然后分別加入100 μL 4 mmol·L-1的EDTA（或檸檬酸鐵）、100 μL 0.1 mol·L-1NaNO2、100 μL 0.1 mol·L-1H2O2，最后用不同緩沖溶液補充至刻度，搖勻。將容量瓶置于37 ℃恒溫水浴鍋中水浴 30 min，然后取4.0 mL反應(yīng)液，加入400 μL 1 mol·L-1的NaOH溶液，搖勻后在430 nm處測定吸光度。

1.3 亞硝酸鹽含量的測定

酸性條件下，亞硝酸鹽與磺胺作用生成重氮化合物，再與N-1-奈基乙二胺鹽酸進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，生成紫紅色化合物，該化合物在550 nm處有最大吸收峰，可通過分光光度法比色測得[10]。具體步驟：取1.2中所述反應(yīng)液3 mL，然后加入3 mL Griess試劑，混勻后常溫反應(yīng)15 min，然后在550 nm處測定其吸光度值，同時做NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的測定

當(dāng)生物膜中的多不飽和脂肪酸受到氧自由基的攻擊就會引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，由此形成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，如醛基（丙二醛，MDA）、氫過氧基等。丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化的一個重要檢測指標(biāo)，而以硫代巴比妥酸（TBA）方法測得的MDA含量已被廣泛用作診斷組織傷害和脂質(zhì)過氧化程度的指標(biāo)。丙二醛可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產(chǎn)物（thiobarbituric acid reactive substances,TBARS），該化合物在532 nm處有最大吸收峰，由此可推算出脂質(zhì)過氧化的程度[11]。取1.2中所述反應(yīng)液2 mL，分別加入2 mL 20%三氯乙酸，5.0 mL 0.6%硫代巴比妥酸。沸水浴中反應(yīng)1 h，流水冷卻后，加入8 mL正丁醇，迅速用力上下晃動30 s，靜置片刻，7 000 r/min離心5 min后取上層澄清溶液，在532 nm處測定其吸光度值。

1.5 統(tǒng)計方法

試驗結(jié)果顯著性差異分析采用組間t檢驗法。當(dāng)P＜0.05時，則認(rèn)為2組數(shù)據(jù)有顯著性差異；當(dāng)P＜0.01 時,則認(rèn)為2組數(shù)據(jù)有極顯著性差異。

2 實驗結(jié)果

2.1 不同緩沖溶液中硝基酪氨酸含量的比較

圖1 不同緩沖溶液對BSA硝基酪氨酸濃度的影響

3-NT比較穩(wěn)定，所以它可以作為檢測細(xì)胞和組織損傷的一個生物標(biāo)志[12-13]。不同緩沖溶液中，F(xiàn)e(Ⅲ)-H2O2-NO2-對BSA硝基酪氨酸濃度的影響如圖1及表1所示。從圖1(a)及表1中可以看出，EDTA-Fe(Ⅲ)-H2O2-NO2-體系下，碳酸鹽緩沖溶液中硝基酪氨酸含濃度最高，可達(dá)23.6 μmol·L-1，Tris-HCl緩沖溶液中硝基酪氨酸的濃度最小，僅為8.7 μmol·L-1；5種緩沖溶液中硝基酪氨酸濃度順序為碳酸鹽 ＞ Hepes ＞ 磷酸鹽 ＞ 檸檬酸 ＞ Tris-HCl。從圖1(b)及表1中可以看出，在檸檬酸鐵-H2O2-NO2-體系下，碳酸鹽緩沖溶液中硝基酪氨酸濃度最高，可達(dá)10.3 μmol·L-1；Hepes緩沖溶液中硝基酪氨酸濃度最低，僅為7.1 μmol·L-1。5種緩沖溶液中硝基酪氨酸濃度順序為：碳酸鹽 ＞ 磷酸鹽 ＞ Tris-HCl ＞檸檬酸 ＞ Hepes。

表1 不同緩沖溶液中硝基酪氨酸的濃度

此外，我們發(fā)現(xiàn)，無論是在EDTA-Fe(III)還是檸檬酸鐵催化H2O2-NO2-體系中，磷酸鹽緩沖溶液中的硝基酪氨酸濃度都是最高的。另外，無論在哪種緩沖體系中，EDTA-Fe(Ⅲ)-H2O2-NO2-體系催化BSA發(fā)生蛋白硝化的能力均大于檸檬酸鐵-H2O2-NO2-體系。

2.2 不同緩沖溶液中亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比較

在生物體內(nèi)，亞硝酸鹽可被氧化成活性氮[14-15]，因此可通過測定其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的降低值來反映氧化量。Fe(III)-H2O2-NO2-體系在不同緩沖溶液中亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)如圖2及表2所示。由圖2可知，無論是在EDTA-Fe(III)還是檸檬酸鐵催化H2O2-NO2-體系中，所有緩沖溶液中亞硝酸鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有所降低，且質(zhì)量分?jǐn)?shù)順序均為：檸檬酸＞Tris-HCl＞碳酸鹽＞Hepes＞磷酸鹽。其中，在EDTAFe(III)催化H2O2-NO2-體系中，Hepes緩沖溶液及磷酸鹽緩沖溶液中亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較空白降低18%左右；在檸檬酸鐵催化H2O2-NO2-體系中，Hepes緩沖溶液及磷酸鹽緩沖溶液中亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)也較空白組降低13%左右。實驗結(jié)果說明，F(xiàn)e(III)-H2O2-NO2-體系在這2種緩沖溶液中，亞硝酸鹽最易被氧化。

2.3 不同緩沖溶液中脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的比較

圖2 不同緩沖溶液中亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比較

表2 不同緩沖溶液中亞硝酸鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

Fe(III)-H2O2-NO2-體系中，不同緩沖溶液對BSA脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物TBARS的影響如圖3及表3所示。實驗結(jié)果表明，無論是EDTA-Fe(III)-H2O2-NO2-體系還是檸檬酸鐵-H2O2-NO2-體系，BSA在Tris-HCl緩沖溶液中發(fā)生脂質(zhì)過氧化程度都最高，其脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物TBARS濃度可達(dá)2.2 μmol·L-1，檸檬酸緩沖溶液中最低，TBARS濃度僅為0.6 μmol·L-1。這 說 明，在Fe(III)-H2O2-NO2-體系中，BAS置于Tris-HCl緩沖溶液最易發(fā)生脂質(zhì)過氧化。五種不同緩沖溶液中，BSA發(fā)生脂質(zhì)過氧化程度順序為：Tris-HCl ＞ 碳酸鹽 ＞ 磷酸鹽 ＞ Hepes ＞檸檬酸。這表明，緩沖溶液對BSA的脂質(zhì)過氧化將產(chǎn)生一定的影響。

圖3 不同緩沖溶液對BSA脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物TBARS的影響

表3 不同緩沖溶液中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物TBARS的濃度

3 討論

蛋白質(zhì)硝化和脂質(zhì)過氧化的程度會因一些外部因素如緩沖溶液、pH值、催化劑等的影響而有所差異[7-8,16]。為了進(jìn)一步研究緩沖溶液對蛋白質(zhì)硝化、脂質(zhì)過氧化的影響，本文選用了碳酸鹽、Tris-HCl、磷酸鹽、檸檬酸、Hepes 5種常用的緩沖溶液，以Fe(III)-H2O2-NO2-體系造成BSA酪氨酸硝化及脂質(zhì)過氧化，以此來探究緩沖溶液對蛋白質(zhì)硝化和脂質(zhì)過氧化的影響。

實驗結(jié)果表明，EDTA-Fe(III)和檸檬酸鐵均能有效地催化H2O2-NO2-體系導(dǎo)致BSA發(fā)生酪氨酸硝化和脂質(zhì)過氧化，但在不同的緩沖溶液中，酪氨酸硝化及脂質(zhì)過氧化的程度有所不同。對于蛋白質(zhì)硝化，兩種催化體系下，Na2CO3緩沖溶液的硝化程度都最高，這說明一定濃度的碳酸鹽可能有助于蛋白質(zhì)硝化的形成。其原因可能是因為CO32-在生理pH值下，能迅速的氧化雙硫磷、DNA、RNA鳥嘌呤殘基、金屬蛋白和蛋白質(zhì)殘基，特別是色氨酸、半胱氨酸、酪氨酸，使得它們產(chǎn)生相應(yīng)的基團(tuán)[17-18]。對于脂質(zhì)過氧化，無論在EDTA-Fe(III)催化作用下還是在檸檬酸鐵催化作用下，5種緩沖溶液中BSA發(fā)生脂質(zhì)過氧化程度順序為：Tris-HCl ＞碳酸鹽 ＞ 磷酸鹽 ＞ Hepes ＞ 檸檬酸。在同一緩沖液中，EDTA-Fe(III)和檸檬酸鐵催化BSA發(fā)生酪氨酸硝化和脂質(zhì)過氧化程度也有所差異，這表明緩沖體系以及催化劑的選擇對蛋白質(zhì)硝化、脂質(zhì)過氧化會產(chǎn)生很大程度的影響。

本文對影響蛋白質(zhì)硝化、脂質(zhì)過氧化的因素只做了初步研究，實驗結(jié)果可為進(jìn)行細(xì)胞或其他體外氧化實驗提供一定的理論依據(jù)，但體內(nèi)發(fā)生蛋白質(zhì)硝化、脂質(zhì)過氧化的環(huán)境是復(fù)雜的；因此，對影響蛋白質(zhì)硝化、脂質(zhì)過氧化的因素還有待進(jìn)一步深入研究。