茶氨酸對酒精誘導(dǎo)人肝HL7702細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)理

李玉鋒，袁 源，張 慶，鄧楊龍

（西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039）

酒作為一種人們?nèi)粘ＯM(fèi)的飲品在生活中扮演著重要角色，適當(dāng)?shù)娘嬀茖θ说纳眢w有益，但是長期、過量等不合理飲酒方式會對人體產(chǎn)生極大的傷害，酒精性肝?。ˋlcoholic liver disease，ALD）便是其中最突出的代表[1]，它是由于長期無節(jié)制的飲酒導(dǎo)致的慢性中毒性肝損傷疾病。近幾年該病發(fā)病率不僅在國內(nèi)甚至是全世界范圍內(nèi)都呈逐漸上升趨勢，目前在我國，酒精性肝病已經(jīng)成為僅次于甲肝、乙肝等病毒性肝炎的第二大肝病[2]。一般患有嚴(yán)重酒精性肝病的患者往往會伴隨有其他并發(fā)癥，如高血壓、高血脂、動脈硬化等，會嚴(yán)重危害人體健康，甚至導(dǎo)致死亡[3]。作為一種由長期飲酒而導(dǎo)致的慢性肝臟疾病，人們對其基本生化特征以及病理特征的了解己很清楚，但其致病機(jī)制尚未闡述明確。ALD的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，與多種因素有關(guān)，其中氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化已經(jīng)得到許多學(xué)者的認(rèn)同，被認(rèn)為是酒精致肝損傷的主要原因[4-5]。除此之外，還包括炎癥和免疫反應(yīng)產(chǎn)生損傷以及局部缺氧、營養(yǎng)不良和病毒的疊加作用，這些都加重了肝臟病理性損傷的進(jìn)程[6]。

目前關(guān)于L-茶氨酸對酒精誘導(dǎo)肝損傷保護(hù)與修復(fù)的論文不多。He等[7]采用D-氨基半乳糖制造大鼠肝損傷模型發(fā)現(xiàn)，L-茶氨酸可以顯著抑制谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的升高，減輕D-氨基半乳糖造成的肝臟損傷。Sugiyama等[8]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，L-茶氨酸在細(xì)胞內(nèi)可以代謝為谷氨酸，有利于補(bǔ)充GSH含量，避免了阿霉素引起的GSH含量下降，從而防止脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激反應(yīng)。在L-茶氨酸和酒精性肝損傷關(guān)系的探索方面，Sadzuka等[9]通過采用急性酒精性肝損傷模型證實(shí),腹腔注射L-茶氨酸能夠提升ADH和ALDH活性,抑制活性CYP2E1的升高，加速了酒精代謝的同時(shí)避免CYP2E1激活導(dǎo)致的呼吸鏈亢進(jìn)和脂質(zhì)過氧化。Sadzuka的這項(xiàng)研究從乙醇代謝有關(guān)的酶的角度證實(shí)了L-茶氨酸能夠抑制酒精性肝損傷，但沒有深入探討抗氧化物質(zhì)和酒精性肝損傷之間的關(guān)系。本文以不同濃度的茶氨酸提取物預(yù)保護(hù)模型濃度酒精處理過的細(xì)胞，測定細(xì)胞存活率，檢測其過氧化氫（H2O2）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶活性（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）含量及總抗氧化能力（T-AOC）水平，系統(tǒng)地從細(xì)胞氧化損傷及氧化應(yīng)激方面研究關(guān)鍵酶和代謝產(chǎn)物對人體肝細(xì)胞的影響及茶氨酸的保護(hù)作用與機(jī)理。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

茶氨酸提取物（純度＞90%）來自西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室；RPMI-1 640培養(yǎng)基、胎牛血清購自北京蘭杰柯有限公司；青鏈霉素購自美國美倫公司；0.25%胰蛋白酶購自美國HyClone公司；MTT試劑購自美國西格瑪公司；PBS緩沖溶液購自Biosharp公司；過氧化氫測試盒(H2O2）、谷胱甘肽一過氧化物酶測試盒(GSH-PX)、超氧化物歧化酶測試盒(SOD）、總抗氧化能力測定試劑盒(TAOC）、丙二醛檢測試劑盒（MDA）購自南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

Molecular Devices SpectraMaxi3X型多功能酶標(biāo)儀（美谷分子儀器有限公司）；3 543型CO2培養(yǎng)箱（美國賽默飛世爾科技公司）；BCN-1360B生物潔凈工作臺（哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)公司）；IX-50倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；LD5-10低速臺式離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；UV-2 600紫外可見分光光度計(jì)（上海尤尼柯儀器有限公司）；HHS-數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）。

1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

HL7702人體正常肝細(xì)胞株購自上海華文生物科技有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞的復(fù)蘇及傳代培養(yǎng)

細(xì)胞的復(fù)蘇[10]。將裝有細(xì)胞的凍存管在37 ℃恒溫水浴中解凍，1 640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青鏈霉素）37 ℃預(yù)熱，吸取解凍的細(xì)胞懸浮液于裝有5 mL 1 640完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，輕微晃動混勻，放入37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔8 h觀察及換液，供傳代處理或細(xì)胞種板。

細(xì)胞傳代培養(yǎng)。將從冰箱中拿出的培養(yǎng)基和胰酶放入37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行預(yù)熱處理。取出培養(yǎng)皿，在顯微鏡下觀察細(xì)胞的狀態(tài)及細(xì)胞密度等，當(dāng)細(xì)胞融合90%以上時(shí)即顯微鏡下細(xì)胞布滿整個(gè)培養(yǎng)皿底部時(shí)便可進(jìn)行傳代[11]。在酒精燈外焰附近進(jìn)行如下操作：吸走原培養(yǎng)基，然后吸取PBS溶液潤洗培養(yǎng)皿，隨后加入l mL胰酶，在37 ℃環(huán)境中進(jìn)行消化，1～3 min后拿出在顯微鏡下觀察，觀察到細(xì)胞形態(tài)變化即變圓并且開始貼壁松動后，吸去胰酶中止消化，反復(fù)多次吸取培養(yǎng)基，輕輕吹打培養(yǎng)皿底部，使細(xì)胞基本脫落。將消化并吹打后的細(xì)胞懸液用移液槍移至10 mL離心管內(nèi)，1 600 r/min轉(zhuǎn)速下離心4 min；去除上清液，用移液槍往其中加入2 mL 1 640完全培養(yǎng)基，之后用巴氏吸管吹打使離心管中的細(xì)胞充分分散在培養(yǎng)基內(nèi)形成細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液用移液槍移取適量至事先預(yù)熱的含有5 mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在顯微鏡下觀察細(xì)胞的密度以及狀態(tài)后，置于培養(yǎng)箱（37 ℃，5%CO2）中培養(yǎng)。

2.2 酒精損傷模型的建立方法

1）MTT法原理及試劑的配制。依據(jù)Yang 等[12]所述，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能與MTT反應(yīng)，形成不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜，利用二甲基亞砜能夠溶解甲臜，在酶標(biāo)儀490 nm處測定溶液吸光值，根據(jù)公式（1）計(jì)算細(xì)胞生存率，該方法可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量。

以PBS緩沖液為溶劑將MTT配成濃度為5 mg/ml的溶液。首先取20 mLPBS緩沖液于50 mL規(guī)格的無菌離心管中，從中吸取約1 mL緩沖液至裝有MTT試劑的離心管內(nèi)，反復(fù)吹打至混合均勻，倒入PBS緩沖液中混勻，重復(fù)操作幾次避免MTT管內(nèi)殘留液體。完全混勻后，用0.22 μm濾膜過濾，分裝避光在-20 ℃以下環(huán)境可長期保存。

2）模型的建立。選取生長處于對數(shù)周期且細(xì)胞融合為90%的HL7702細(xì)胞均勻接種于96孔板中，約5 000個(gè)/孔，培養(yǎng)24 h。設(shè)置只有培養(yǎng)基的空白對照組，培養(yǎng)基加細(xì)胞的正常對照組。實(shí)驗(yàn)組以500 mmol開始分別選取梯度為100 mol的6個(gè)酒精濃度處理細(xì)胞，每組設(shè)置4個(gè)平行復(fù)孔。24 h后，MTT法測定細(xì)胞存活率：每孔加入配制好的MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h后，用巴氏吸管輕輕吸取孔內(nèi)培養(yǎng)液，隨后每孔內(nèi)加入150 μL的DMSO終止反應(yīng)，電動震蕩器上震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，立即以自動酶標(biāo)儀測定490 nm波長處各孔光吸收值。各組別實(shí)驗(yàn)結(jié)果以設(shè)置的4個(gè)平行數(shù)據(jù)的平均值表示計(jì)算細(xì)胞的存活率，最終篩選細(xì)胞生存率在50%左右的酒精濃度確定為造模濃度[13]。

2.3 考察茶氨酸適宜作用濃度范圍的方法

選取生長處于對數(shù)周期且細(xì)胞融合為90%的HL7702細(xì)胞均勻接種于96孔板中，約5 000個(gè)/孔，培養(yǎng)24 h。設(shè)置不做茶氨酸處理的正常對照組，茶氨酸處理組分別以200、400、600、800、1 000、2 000 μg/mL濃度的茶氨酸培養(yǎng)，每組設(shè)置4個(gè)平行復(fù)孔。24 h后用MTT法測定細(xì)胞存活率，計(jì)算細(xì)胞存活率，篩選茶氨酸對HL7702細(xì)胞作用適宜的濃度范圍。

2.4 考察茶氨酸對酒精損傷的HL7702細(xì)胞生存率影響的方法

選取生長處于對數(shù)周期且細(xì)胞融合為90%的HL7702細(xì)胞均勻接種于96孔板中，約5 000個(gè)/孔，培養(yǎng)24 h。正常對照組：不做處理。模型組：根據(jù)實(shí)驗(yàn)2.2確定的造模濃度對細(xì)胞進(jìn)行處理。茶氨酸組：預(yù)先加入200、400、600、800 μg/mL濃度的茶氨酸處理24 h后，再加入造模濃度的酒精共同培養(yǎng)24 h，每組設(shè)置4個(gè)平行復(fù)孔。利用MTT法測定細(xì)胞存活率，計(jì)算各組細(xì)胞生存率，探究茶氨酸對酒精損傷HL7702細(xì)胞生存率的影響。

2.5 考察茶氨酸對HL7702細(xì)胞保護(hù)作用的方法

選取生長處于對數(shù)周期且細(xì)胞融合為90%的HL7702細(xì)胞均勻接種于96孔板中，約5 000個(gè)/孔，培養(yǎng)24 h。按照2.4中方法設(shè)置正常對照組、模型組和茶氨酸組培養(yǎng)后，參照李金蓮[14]裂解細(xì)胞的方法，在低溫冷凍離心機(jī)中離心10 min，得到可以用于檢測的上清液。按照試劑盒說明書的操作步驟測定細(xì)胞的MDA、H2O2含量以及SOD、GSH-PX活性和T-AOC水平。

MDA的含量水平反映了肝細(xì)胞氧化損傷程度。SOD的主要功能是清除自由基，在一定程度上反映了氧化應(yīng)激反應(yīng)的程度[15]。H2O2是一種重要的ROS，氧化性較強(qiáng)，可以直接作用于一些酶的巰基，使酶失去活性。GSH-PX是一類廣泛存在于機(jī)體內(nèi)，能催化過氧化氫分解的重要酶，也是GSH對H2O2的還原反應(yīng)的特異催化酶，能起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用[16]。人體抗氧化防御系統(tǒng)的強(qiáng)弱與其健康程度有密切關(guān)系，通過測定細(xì)胞總抗氧化能力可反映細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)的強(qiáng)弱。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較采用鄧肯（Duncan）檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)過程及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 酒精損傷模型的建立

預(yù)實(shí)驗(yàn)用100～500 mmol濃度進(jìn)行處理，與對照組相比，細(xì)胞在該酒精濃度范圍的生存率無顯著差異，因此選擇500～1 000 mmol濃度酒精繼續(xù)進(jìn)行處理，倒置顯微鏡下觀察酒精對HL7702細(xì)胞損傷形態(tài)學(xué)改變。由圖1可以觀察到，不同濃度酒精處理后的細(xì)胞形態(tài)與對照組比較，隨著酒精濃度升高，細(xì)胞由原有的梭性形態(tài)慢慢變小，邊緣逐漸模糊，失去原有形狀，呈不規(guī)則形態(tài)。用MTT法檢測細(xì)胞生存率，MTT檢測結(jié)果顯示，隨著酒精濃度的升高，細(xì)胞的生存率下降(p＜0.05)。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取800 mmol的酒精濃度作為損傷模型濃度。具體結(jié)果見表1。

3.2 茶氨酸對細(xì)胞毒性的濃度篩選

選取0、200、400、600、800 μg/mL濃度的茶氨酸對細(xì)胞進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與對照組相比，在該濃度范圍內(nèi)細(xì)胞的生存率變化不大。持續(xù)加大茶氨酸濃度到1 000、2 000 μg/mL，由圖2可知，各濃度的茶氨酸對HL7702細(xì)胞均無明顯的毒性作用，相反有一定的增殖作用，當(dāng)茶氨酸濃度達(dá)到200 μg/mL時(shí)，其對HL7702細(xì)胞的增殖效果最明顯。因此，判斷茶氨酸濃度在2 000 μg/mL以下對HL7702細(xì)胞無毒性。根據(jù)茶氨酸在實(shí)際情況中的含量，選擇200～800 μg/mL濃度范圍的茶氨酸進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.3 茶氨酸對酒精損傷HL7702細(xì)胞生存率的影響

圖1 不同濃度酒精處理細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化

表1 不同濃度酒精對細(xì)胞生存率的影響（n=4，）

表1 不同濃度酒精對細(xì)胞生存率的影響（n=4，）

注：同列數(shù)據(jù)標(biāo)記不同小寫字母表示顯著性差異（p＜0.05）。

利用MTT比色法得到各組別細(xì)胞存活率，正常組（陰性對照組）細(xì)胞存活率為99.75%，模型組（陽性對照組）細(xì)胞存活率為53.43%。數(shù)據(jù)顯示800 mmol酒精損傷的模型組存活率明顯降低（p＜0.01），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。茶氨酸處理組與模型組比較，經(jīng)酒精損傷后的HL7702細(xì)胞在200、400、600、800 μg/mL的茶氨酸預(yù)保護(hù)24 h后細(xì)胞生存率分別提高到57.76%、64.76%、70.26%、78.66%（p＜0.05），細(xì)胞生存率隨著茶氨酸濃度的增加而升高。此實(shí)驗(yàn)證明茶氨酸對酒精損傷HL7702細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，結(jié)果見表2。

圖2 不同濃度茶氨酸對細(xì)胞生存率的影響

3.4 茶氨酸對T-AOC、SOD、GSH-PX、MDA、H2O2含量的影響

茶氨酸對模型細(xì)胞H2O2、GSH-PX、SOD、MDA、T-AOC水平的影響見表3。根據(jù)表3的數(shù)據(jù)，模型組與正常組相比，T-AOC、SOD、GSH-PX含量減少，MDA、H2O2的含量增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。茶氨酸組與模型組相比，T-AOC、SOD、GSH-PX含量增加，MDA、H2O2的含量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。

表2 不同濃度茶氨酸對酒精損傷細(xì)胞生存率的影響（n=4，）

表2 不同濃度茶氨酸對酒精損傷細(xì)胞生存率的影響（n=4，）

注：同列數(shù)據(jù)標(biāo)記不同小寫字母表示顯著性差異（p＜0.05）。

4 茶氨酸的作用機(jī)理

H2O2是一種重要的活性氧成分，過量的H2O2會對細(xì)胞造成氧化損傷。GSH-PX是能催化分解H2O2，使GSH和H2O2發(fā)生還原反應(yīng)的特異催化酶。通過測定酒精處理HL7702細(xì)胞中的H2O2含量及GSH-PX酶活性可知，酒精在肝細(xì)胞中氧化產(chǎn)生大量的H2O2，并抑制了GSH-PX的活性，使得大量的H2O2不能分解，肝細(xì)胞發(fā)生了較為嚴(yán)重的氧化損傷。茶氨酸預(yù)保護(hù)后，與模型組相比，GSH-PX活性顯著升高，H2O2含量顯著下降，提示細(xì)胞內(nèi)的氧化損傷程度有所緩解，并與茶氨酸的濃度呈劑量依賴型。茶氨酸通過抑制酒精刺激下GSH-PX活性的降低，從而抑制了H2O2含量升高的作用機(jī)理，對酒精誘導(dǎo)發(fā)生氧化損傷的人正常肝細(xì)胞起到保護(hù)作用。

當(dāng)氧化與抗氧化作用失衡，細(xì)胞內(nèi)便會發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，SOD在機(jī)體氧化和抗氧化平衡中具有重要作用，主要功能是清除自由基，在一定程度上反映了氧化應(yīng)激反應(yīng)的程度。配合測定MDA含量與SOD活性，SOD活力高低間接反應(yīng)了機(jī)體清除氧自由基的能力，而MDA含量高低間接反應(yīng)了細(xì)胞受到自由基攻擊的程度。在酒精誘導(dǎo)損傷的人正常肝細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)顯示MDA含量明顯升高，表明在細(xì)胞中發(fā)生了較為嚴(yán)重的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，SOD活性顯著降低，提示細(xì)胞內(nèi)的氧化和抗氧化平衡被破壞，細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了一定程度的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

茶氨酸預(yù)保護(hù)后，與模型組相比，MDA含量顯著下降，提示機(jī)體細(xì)胞受到自由基攻擊的程度減弱，而SOD活性升高，表明細(xì)胞清除氧自由基能力增強(qiáng)，氧化應(yīng)激反應(yīng)受到了一定程度的抑制。茶氨酸通過抑制酒精刺激下SOD活性的降低，從而抑制MDA含量升高的作用機(jī)理，對酒精誘導(dǎo)發(fā)生在人正常肝細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)起到了抑制作用，從而對人正常肝細(xì)胞起到保護(hù)作用。

細(xì)胞總抗氧化能力與細(xì)胞的健康程度呈正相關(guān)。通過測定茶氨酸預(yù)保護(hù)后的人肝細(xì)胞抗氧化能力，與酒精損傷組相比，茶氨酸保護(hù)組的抗氧化能力得到了顯著的提高，印證了細(xì)胞內(nèi)氧化損傷程度顯著降低，表明了茶氨酸通過提升細(xì)胞的抗氧化能力，從而對酒精損傷的人肝細(xì)胞起到保護(hù)作用。

綜上所述，茶氨酸通過抑制酒精刺激下抗氧化關(guān)鍵酶活性的降低及氧化反應(yīng)中間產(chǎn)物的產(chǎn)生，抑制酒精刺激下細(xì)胞總抗氧化能力的下降，維持細(xì)胞內(nèi)抗氧化關(guān)鍵酶的活力，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的含量，保持了細(xì)胞內(nèi)氧化和抗氧化平衡，從而避免人正常肝細(xì)胞在酒精誘導(dǎo)下發(fā)生的氧化損傷及氧化應(yīng)激反應(yīng)。

表3 茶氨酸對模型細(xì)胞H2O2、GSH-PX、SOD、MDA、T-AOC水平的影響（n=4，xˉ ±s）

5 結(jié)論

本文用不同濃度的茶氨酸預(yù)保護(hù)酒精損傷的HL7702肝細(xì)胞，測定其生存率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明茶氨酸在細(xì)胞發(fā)生氧化損傷及氧化應(yīng)激反應(yīng)方面均被證明對酒精誘導(dǎo)人正常肝細(xì)胞氧化損傷具有一定的保護(hù)作用。茶氨酸作為茶葉中主要的生物活性成分之一，已經(jīng)證實(shí)其安全無毒副作用，彌補(bǔ)了其他藥物在防治酒精性肝損傷時(shí)可能存在毒副作用的不足[17]，為防治酒精性肝損傷藥物的研發(fā)提供了新的理論基礎(chǔ)及思考方向。