基于響應(yīng)面法優(yōu)化柱前衍生-高效液相色譜法分析傳統(tǒng)郫縣豆瓣中8種生物胺

黃玉坤 ，宋亞寧，陳 芳,3，王力均，楊 瀟，車振明，陳祥貴

（1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；2.宜賓西華大學(xué)研究院，食品非熱加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品非熱加工工程技術(shù)研究中心，四川 宜賓 644004；3.成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，四川 成都 610036）

生物胺（biogenic amines，BAs）是一類堿性含氮的低分子量低生物活性的極性或半極性化合物，可在食品腐爛或發(fā)酵過(guò)程中由不同的微生物誘導(dǎo)產(chǎn)生[1-2]，包括革蘭氏陰性菌、腸桿菌、假單胞桿菌和乳酸菌等[3]。BAs形成途徑主要依靠氨基酸脫羧以及醛或酮的轉(zhuǎn)氨基作用[4]。研究表明，適量BAs可調(diào)節(jié)人體正常生理功能，但過(guò)量BAs會(huì)在體內(nèi)激發(fā)其潛在的毒性作用[5]，如過(guò)敏、血管毒性和神經(jīng)毒性等[6]。BAs中組胺和酪胺毒性最強(qiáng)，并且當(dāng)腐胺和尸胺同時(shí)存在時(shí)會(huì)抑制組胺降解而進(jìn)一步加強(qiáng)組胺和酪胺毒性[7]。另外，有關(guān)研究[8]表明，BAs含量增加會(huì)增大誘發(fā)癌癥的可能性。目前國(guó)內(nèi)外僅對(duì)少部分食品的個(gè)別BAs確定了推薦最高攝入量[9]，大部分BAs沒(méi)有限量標(biāo)準(zhǔn)。鑒于BAs具有個(gè)體差異以及不同BAs之間具有協(xié)同作用而產(chǎn)生的毒性，檢測(cè)食品中BAs含量以及建立發(fā)酵制品BAs推薦攝入量就具有重要意義。

BAs存在于動(dòng)植物及其制品[10-12]、乳酪及其制品[13-14]、發(fā)酵飲料[15-16]、巧克力及咖啡[6]、發(fā)酵豆腐乳[17-18]等多種食物中。在醬油[19]、醋[20]、豆豉[21]、黃豆醬[22]和韓國(guó)大醬[23]等發(fā)酵豆制品中的BAs被廣為研究，但在基質(zhì)更為復(fù)雜的郫縣豆瓣中的BAs未見(jiàn)深入研究。郫縣豆瓣是四川傳統(tǒng)特色發(fā)酵調(diào)味品，在世界“發(fā)酵辣椒醬”中獨(dú)樹(shù)一幟，深受大家的喜愛(ài)[24]。但由于采用自然發(fā)酵工藝，環(huán)境中各種能產(chǎn)生氨基酸脫羧酶的微生物可能參與發(fā)酵過(guò)程，并且原料富含蛋白質(zhì)，在基于發(fā)酵的過(guò)程中蛋白酶的持續(xù)分解作用使豆瓣醬中氨基酸態(tài)氮含量逐漸增加，最終導(dǎo)致豆瓣醬中BAs可能超量[5]。李冉冉等[2]等采用了響應(yīng)面法優(yōu)化丹磺酰氯衍生生物胺的衍生條件，針對(duì)生臘肉中生物胺的衍生做了相應(yīng)研究。曾雪晴等[5]研究了21種郫縣豆瓣醬中BAs的含量和種類，其中個(gè)別樣品中的組胺、酪胺及 β-苯乙胺的含量超過(guò)了建議范圍，對(duì)人體健康有不良影響。另外，研究[5,25]表明腐胺、尸胺、以及毒性較高的酪胺和組胺是郫縣豆瓣醬中主要的生物胺。因此，建立檢測(cè)傳統(tǒng)發(fā)酵豆瓣中生物胺含量的有效方法對(duì)食品安全具有重要意義。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于BAs的檢測(cè)法主要分為色譜法，包括高效液相色譜法（HPLC）、超高效液相色譜法（UPLC）、薄層色譜法（TLC）、離子色譜法（IC）等；串聯(lián)質(zhì)譜法，包括高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS/MS）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）等；其他方法，包括生物傳感器法、毛細(xì)管電泳法（CE）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）等[26]。近年出現(xiàn)的新型方法有納米纖維膜試紙技術(shù)、競(jìng)爭(zhēng)性熒光分子印跡聚合物（MIP）技術(shù)、高光譜成像技術(shù)等[2]。因高效液相色譜法檢測(cè)成本低、操作簡(jiǎn)單，經(jīng)常被基層、企業(yè)等作為常用檢測(cè)方法[27]。BAs屬于強(qiáng)極性化合物，無(wú)法在反相柱上得到保留[28]，且BAs本身沒(méi)有紫外吸收和熒光發(fā)射特性，需經(jīng)衍生化反應(yīng)后才能進(jìn)行HPLC測(cè)定；因此，選擇合適的提取溶劑并優(yōu)化BAs的色譜衍生條件，有利于提高基于HPLC技術(shù)分析郫縣豆瓣中BAs含量方法的靈敏度。

1 材料、儀器與方法

1.1 材料與試劑

郫縣豆瓣樣品（A：發(fā)酵2.5年；B：發(fā)酵1.5年；C：發(fā)酵0.5年）采樣自四川省某公司生產(chǎn)的郫縣豆瓣醬；組胺（Histamine，His，純度≥99%）購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；酪胺（Tyramine，Tyr）、色胺（Tryptamine，Trp）、腐胺（Putrescine，Put）、尸 胺（Cadaverine，Cad）、精 胺（Spermine，Spm）、亞精胺（Spermidine，Spd）、β-苯乙胺（βphenylethylamine，Phe）、丹磺酰氯（（Dansyl Chloride，Dns-Cl，純度均≥98%）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；甲醇（色譜純）、丙酮（色譜純）、乙腈（色譜純）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（Waters 2 695），美國(guó) Waters公司；5810R 冷凍離心機(jī)，德國(guó) Eppendorf 公司；VORTEX 3渦旋混勻器，德國(guó) IKA；顯數(shù)式 pH 計(jì)，成都世紀(jì)方舟科技有限公司；HN132樣品濃縮儀，濟(jì)南海能儀器股份有限公司；電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；Milli-Q 超純水處理器，美國(guó) Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取各BAs標(biāo)準(zhǔn)品100 mg（精確到0.001 g），用0.1 mol/L鹽酸溶解后定容到10 mL容量瓶?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液：分別移取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL置于10 mL容量瓶，用0.1 mol/L鹽酸定容至刻度，再用0.1 mol/L鹽酸逐級(jí)稀釋至最終質(zhì)量濃度分別為1 000、500、200、100、50、10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取5 g均質(zhì)豆瓣樣品置于50 mL離心管中，加入10 mL 5%三氯乙酸（TCA）渦旋混勻，超聲提取20 min后離心（4 ℃，5 000 r/min，10 min），轉(zhuǎn)移上清液置于25 mL容量瓶，下層再萃取1次，合并2次上清液，用5% TCA定容至刻度，混勻，待衍生。

1.3.3 衍生

衍生過(guò)程參考GB 5 009.208—2016[19]并作進(jìn)一步探索和優(yōu)化。準(zhǔn)確量取1.0 mL樣品置于離心管中，依次加入1 mL飽和碳酸氫鈉溶液（用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為8.93）、1 mL Dns-Cl（質(zhì)量濃度為12.45 mg/mL），渦旋混勻后置于41 ℃恒溫水浴鍋中衍生37.95 min，取出，分別加入100 μL谷氨酸鈉溶液，渦旋混勻，41 ℃恒溫反應(yīng)15 min，取出冷卻至室溫，于每個(gè)離心管中加入1 mL 超純水，渦旋混勻，40 ℃下氮?dú)鉂饪s除去丙酮，加入0.5 g氯化鈉渦旋振蕩至完全溶解，再加入5 mL無(wú)水乙醚，渦旋振蕩2 min，靜置分層后，轉(zhuǎn)移上層有機(jī)相于10 mL離心管中，下層水相再萃取1次，合并2次乙醚萃取液，40 ℃下氮?dú)獯蹈?。加? mL乙腈復(fù)溶，0.22 μm 濾膜針頭濾器過(guò)濾，待上機(jī)測(cè)定。

1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)確定研究水平即衍生提取溶劑為5% TCA、0.4 mol/L高氯酸、丙酮、無(wú)水乙醇、無(wú)水甲醇和乙腈，衍生試劑Dns-Cl質(zhì)量濃度為3、7、11、15和25 mg/mL，衍生體系pH值為8、9、10、11和12，衍生溫度為20、40、60、80、100 ℃，衍生時(shí)間為10、20、30、40和50 min。實(shí)驗(yàn)每組平行測(cè)定3次，以8種BAs總面積為響應(yīng)值確定最佳實(shí)驗(yàn)水平。

1.3.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Box-Behnken中心組和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)四因素三水平（共29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，5個(gè)區(qū)域中心點(diǎn)），以8個(gè)生物胺濃度平均響應(yīng)值為指標(biāo)（Y，mg/mL），選取衍生溫度（A，℃）、衍生時(shí)間（B，min）、Dns-Cl濃度（C，mg/mL）和pH值（D）4個(gè)變量，進(jìn)行響應(yīng)面分析（response surface analysis，RSA），響應(yīng)面因素水平如表1進(jìn)行設(shè)計(jì)。

1.3.6 色譜條件

采用上海月旭公司Ultimate XB-C18色譜柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm），二極管陣列檢測(cè)器波長(zhǎng)254 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速0.8 mL/min。流動(dòng)相A為10%乙腈/90%（含0.1%乙酸的0.01 mol/L乙酸銨溶液），流動(dòng)相B為90%乙腈/10%（含0.1%乙酸的0.01 mol/L乙酸銨溶液）。梯度洗脫程序[29]見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平

表2 梯度洗脫程序

2 結(jié)果與分析

2.1 柱前衍生條件的優(yōu)化

2.1.1 衍生反應(yīng)的單因素實(shí)驗(yàn)

Dns-Cl是生物胺衍生化反應(yīng)中常見(jiàn)的衍生試劑，微溶于水，其衍生物化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇以Dns-Cl為衍生試劑。由圖1可知，以5%TCA作為提取溶劑時(shí)，8種BAs均可被檢測(cè)且所對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值最大；Dns-Cl質(zhì)量濃度為7 mg/mL時(shí)，峰面積響應(yīng)值迅速增強(qiáng)（組胺除外），隨后增長(zhǎng)緩慢，分析其原因可能是隨著Dns-Cl質(zhì)量濃度增大，衍生反應(yīng)更充分；pH=9時(shí)響應(yīng)值為最大值，pH＞9時(shí)，8種生物胺響應(yīng)值均不同程度減少直至趨于平緩，這與文獻(xiàn)[26]的研究結(jié)論一致，即pH過(guò)高會(huì)導(dǎo)致二胺和多胺產(chǎn)生非目標(biāo)衍生物；衍生溫度40 ℃時(shí)響應(yīng)值達(dá)到最大，除腐胺和亞精胺外，其余生物胺衍生物峰面積響應(yīng)值均呈先增加后減少趨勢(shì)。李冉冉等[2]和劉景等[30]研究也表明：適當(dāng)?shù)纳郎貢?huì)使衍生物產(chǎn)量增加，但溫度過(guò)高則會(huì)造成衍生物產(chǎn)量減少；衍生時(shí)間為40 min時(shí)響應(yīng)值達(dá)到最大值，且隨衍生時(shí)間增加響應(yīng)值減小。

因此實(shí)驗(yàn)選擇以5% TCA作為提取溶劑，衍生劑質(zhì)量濃度范圍為10～15 mg/mL，衍生pH范圍為8～10，衍生溫度范圍為20～60 ℃，衍生時(shí)間范圍為30～50 min。

2.1.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化衍生反應(yīng)

2.1.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，依據(jù)Box-Behnken中心組和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

2.1.2.2 方差顯著性分析

依據(jù)Box-Behnken中心組和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，獲得回歸方程并進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

術(shù)中導(dǎo)絲斷裂分析其主要原因是操作技術(shù)不當(dāng)，置入椎弓根螺釘時(shí)出現(xiàn)與導(dǎo)絲成角，螺釘旋入過(guò)程將導(dǎo)絲截?cái)啵浯问菍?dǎo)絲反復(fù)使用。

由表4知，因素B、D、AC、A2、B2、C2、D2對(duì)8種生物胺濃度響應(yīng)值影響極顯著（P＜0.001）。其中AC在8種BAs衍生過(guò)程中存在協(xié)同增效作用。由F值可知，5種因素對(duì)生物胺濃度響應(yīng)值的影響程度為：衍生時(shí)間＞衍生體系pH值＞衍生溫度＞衍生劑質(zhì)量濃度，且衍生溫度和衍生劑濃度AC具有強(qiáng)的交互作用。劉景等[30]利用響應(yīng)面法分析干酪中的組胺衍生條件發(fā)現(xiàn)4種因素影響程度大小為：衍生劑質(zhì)量濃度＞衍生時(shí)間＞衍生體系pH值＞衍生溫度，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致。其原因可能是本實(shí)驗(yàn)同時(shí)探討了8種生物胺的衍生條件，因此需考慮8種生物胺的影響而不是單一考慮組胺。

由表4可知，實(shí)驗(yàn)所選回歸模型的P＜0.000 1，表明回歸模型對(duì)8種生物胺濃度的響應(yīng)值極顯著；失擬項(xiàng)P=0.256 3＞0.05，表明模型選擇合理、可靠；相關(guān)系數(shù)R2為0.983 8，表明生物胺濃度響應(yīng)值的實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間具有很好的擬合關(guān)系；變異系數(shù)C.V較小，表明該實(shí)驗(yàn)精確度良好，實(shí)驗(yàn)具有可靠性。因此，該方程能較好地描述各因子與生物胺濃度響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。

2.1.2.3 響應(yīng)面分析

通過(guò)方差分析對(duì)具有顯著交互作用因素的等高線和響應(yīng)面圖進(jìn)行分析，可直觀、深入地探討相關(guān)變量之間交互作用的影響，找到最佳交互點(diǎn)。等高線形狀能反映任意2個(gè)因素間交互作用的強(qiáng)度，其中橢圓形和馬鞍形表示交互作用顯著，圓形則表示相互作用不顯著[31]。響應(yīng)面和等高線分析結(jié)果如圖2、圖3所示。

圖1 各單因素對(duì)生物胺總面積的影響

由圖2和圖3可知，衍生溫度與其他3個(gè)因素兩兩交互作用顯著，衍生時(shí)間和衍生體系pH值交互作用顯著。綜上，模擬得到8種生物胺的最佳衍生條件為：Dns-Cl質(zhì)量濃度為12.45 mg/mL，衍生體系pH=8.93，衍生溫度為41.35 ℃，衍生時(shí)間為37.95 min，所預(yù)測(cè)的8種生物胺質(zhì)量濃度響應(yīng)值為2.377 1 mg/mL?？紤]實(shí)際情況，最終確定Dns-Cl質(zhì)量濃度為11 mg/mL，衍生體系pH=9，衍生溫度為41 ℃，衍生時(shí)間為38 min。在此條件下進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，得到的質(zhì)量濃度響應(yīng)值平均值為2.295 5 mg/mL。實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值吻合率達(dá)到103.5%，驗(yàn)證了模型的準(zhǔn)確性。

2.2 方法建立及其驗(yàn)證

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

按1.3.1配制各濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行線性試驗(yàn)，每個(gè)質(zhì)量濃度3次平行。按照上述響應(yīng)面法優(yōu)化獲得的最佳條件（Dns-Cl濃度為11 mg/mL，衍生體系pH=9，衍生溫度為41 ℃，衍生時(shí)間為38 min）進(jìn)行衍生，并按照1.3.6色譜條件進(jìn)行定量分析。以3倍信噪比為檢出限確定標(biāo)準(zhǔn)，以10倍信噪比為定量限確定標(biāo)準(zhǔn)。8種BAs的線性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表3 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

配制1.000 mg/mL生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照最佳衍生條件進(jìn)行處理，按照1.3.6色譜條件進(jìn)行定量分析。在同一天內(nèi)和連續(xù)三天內(nèi)分別測(cè)定日內(nèi)精密度和日間精密度，每個(gè)樣品連續(xù)測(cè)定6次。精密度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。

由表6可知，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的日內(nèi)精密度和日間精密度分別在1.01%～3.76% 和3.31%～4.92% 范圍內(nèi)，精密度良好。

表4 生物胺濃度響應(yīng)值的回歸方程方差分析

2.2.3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

在線性范圍內(nèi)選取50、100和200 mg/L 3個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，按照最佳衍生條件進(jìn)行處理，按照1.3.6色譜條件進(jìn)行定量分析，每個(gè)加標(biāo)樣品平行測(cè)定3次。加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。

由表7可知，3個(gè)加標(biāo)水平下8種生物胺的平均回收率在90.44%～109.29%。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.02%～2.54%。說(shuō)明此法準(zhǔn)確性高，可用于郫縣豆瓣中生物胺的定性定量分析。

2.3 郫縣豆瓣中BAs測(cè)定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品和實(shí)際樣品的圖譜

圖2 各因素交互作用對(duì)生物胺響應(yīng)值的響應(yīng)面圖

以5%TCA為提取溶劑，衍生時(shí)間為38 min、衍生溫度為41 ℃、反應(yīng)體系pH值為9、Dns-Cl質(zhì)量濃度為11 mg/mL條件下進(jìn)行分析，得到標(biāo)準(zhǔn)品和郫縣豆瓣中BAs的HPLC圖譜，見(jiàn)圖4。由圖4可知，8種BAs在40 min內(nèi)均被完全洗脫出來(lái)，各BAs分離度好且峰型對(duì)稱，雜峰干擾少，由此說(shuō)明本方法適用于郫縣豆瓣中BAs的分析。

2.3.2 3個(gè)發(fā)酵年份郫縣豆瓣樣品中BAs的種類和含量

由表8可知，在3個(gè)不同發(fā)酵年份的豆瓣中檢測(cè)出6種生物胺，其中β-苯乙胺含量最高為19.15±0.21 mg/kg，酪胺、腐胺、亞精胺的含量較高，依次為8.60±0.16、7.28±0.12、4.43±0.07 mg/kg，組胺和尸胺未檢出。這與Byun等[32]的研究結(jié)論相符，其研究也表明中國(guó)市場(chǎng)的豆瓣生物胺含量依次為β-苯乙胺＞腐胺＞酪胺＞亞精胺＞精胺。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)[32]不同的是酪胺含量高于腐胺含量，其原因可能是郫縣豆瓣采用自然的發(fā)酵工藝以及制備豆瓣原料的不同而造成的差異性。

豆瓣樣本中生物胺總量范圍在16.77±0.32 mg/kg～34.69±0.65 mg/kg，其范圍均低于陳功等[25]報(bào)道的37.86±6.69 mg/kg～158.11±8.53 mg/kg。究其原因，可能是樣品來(lái)源的發(fā)酵環(huán)境和時(shí)間跨度不同，以及蠶豆瓣作為郫縣豆瓣原料的一部分，其含量相對(duì)較少，最終BAs含量并不會(huì)很高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3個(gè)發(fā)酵年份的BAs總量大小依次為B（發(fā)酵1.5年）＞C（發(fā)酵2.5年）＞A（發(fā)酵0.5年），說(shuō)明發(fā)酵時(shí)間影響郫縣豆瓣中BAs的形成。推測(cè)該現(xiàn)象發(fā)生的原因可能是：在發(fā)酵初期階段，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)逐漸分解形成氨基酸，在微生物脫羧作用下BAs總量含量逐漸增加。當(dāng)發(fā)酵至一定時(shí)間，發(fā)酵豆瓣中的葡萄糖和乳酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷消耗殆盡時(shí)，BAs會(huì)發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞代謝和生長(zhǎng)等活性作用。在后期發(fā)酵過(guò)程中，BAs作為氮源進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化、降解，例如腐胺、精胺亞和精胺等。當(dāng)BAs的降解速度大于其合成速度，就導(dǎo)致其在豆瓣發(fā)酵后期的總量降低。另有研究[5]表明，可能由于在發(fā)酵后期微生物群落演替發(fā)生變化，主要是含氨基酸脫羧酶的微生物種群比例發(fā)生變化，微生物的生物胺氧化酶大量表達(dá)抑制其氨基酸脫羧酶的產(chǎn)生；因此，導(dǎo)致隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，豆瓣中BAs總量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。

圖3 各因素交互作用對(duì)生物胺響應(yīng)值的等高線圖

表5 線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)個(gè)別魚(yú)類產(chǎn)品中的生物胺[33-34]，以及對(duì)食品中毒性較強(qiáng)的組胺和酪胺進(jìn)行了限量規(guī)定并提出了合理建議，但對(duì)腐胺、精胺等少有制定相應(yīng)的法規(guī)[35]。有研究者認(rèn)為，通用食品中組胺、酪胺和苯乙胺的毒性閾值分別為：100、100～800、30 mg/kg[10]，這遠(yuǎn)高于郫縣豆瓣樣品中的組胺、酪胺和苯乙胺的含量，證明此實(shí)驗(yàn)所使用郫縣豆瓣安全性良好。食品限量標(biāo)準(zhǔn)的制定存在不合理性，即對(duì)新鮮食品與發(fā)酵食品分別形成的BAs特點(diǎn)及其食品組分、食用頻率等的差異性未加考慮。另外，郫縣豆瓣僅作為調(diào)味品參與居民飲食，平均每日攝入生物胺的量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于普通食品中限定標(biāo)準(zhǔn)，但考慮生物胺總量應(yīng)該是來(lái)自不同食物中所有胺的總和；因此，測(cè)定豆瓣中生物胺的含量具有必要性。且郫縣豆瓣采用的自然發(fā)酵工藝以及原料具有高蛋白質(zhì)的特殊性，可能會(huì)造成其氨基態(tài)氮增加，最終導(dǎo)致BAs含量超標(biāo)；因此，建立有效的高靈敏檢測(cè)郫縣豆瓣中的生物胺的方法對(duì)控制食品中生物胺的含量具有重要意義。

表6 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表7 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）

3 結(jié)論

本文建立的柱前衍生-HPLC法可同時(shí)測(cè)定郫縣豆瓣中的組胺、酪胺、尸胺、腐胺、苯乙胺、色胺、精胺和亞精胺。利用此法對(duì)3個(gè)不同發(fā)酵年份的某郫縣豆瓣進(jìn)行檢測(cè)分析得出，酪胺、腐胺和亞精胺是郫縣豆瓣中的主要BAs，BAs總量范圍在16.77±0.32～34.69±0.65 mg/kg。目前，國(guó)內(nèi)外并未制定針對(duì)郫縣豆瓣等傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品中BAs的限量標(biāo)準(zhǔn)。由于郫縣豆瓣中BAs的種類和含量受原料、發(fā)酵環(huán)境、溫度、pH值抑制氨基酸脫羧酶生成的微生物諸多因素的影響，會(huì)造成在生產(chǎn)和儲(chǔ)存中任意環(huán)節(jié)BAs的積累。因此，郫縣豆瓣中BAs含量的安全檢測(cè)評(píng)估不僅可以科學(xué)認(rèn)識(shí)傳統(tǒng)發(fā)酵工藝安全性問(wèn)題，而且對(duì)優(yōu)質(zhì)郫縣豆瓣走向世界也有較大的推進(jìn)作用。另外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供一定的理論依據(jù)。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)品和郫縣豆瓣樣品中BAs衍生物HPLC色譜圖

表8 郫縣豆瓣中生物胺的含量（n=3） mg/kg