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    pH偏移對(duì)花椒籽蛋白理化指標(biāo)及乳化性能的影響

    2020-10-15 12:54:20劉慶慶羅宇柯何玉鑫袁永俊

    劉慶慶,黃 河,羅宇柯,何玉鑫,袁永俊

    (西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,四川 成都 610039)

    花椒籽是花椒(果皮)生產(chǎn)的副產(chǎn)物,產(chǎn)量比花椒(果皮)高約20%,含油脂27.1%、蛋白質(zhì)18.7%[1]?;ń纷训牡鞍子汕宓鞍祝?7.65%)、球蛋白(35.68%)、醇溶蛋白(8.75%)、谷蛋白(12.33%)和剩余蛋白(15.59%)組成[2]?;ń纷训鞍椎奶崛『凸δ苄再|(zhì)研究[2-3]、酶解制備降血壓肽的研究[4]等已有相關(guān)報(bào)道。

    蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能,改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可以改變其功能。pH偏移使蛋白質(zhì)分子展開-重折疊,可得到結(jié)構(gòu)介于天然態(tài)和完全伸展態(tài)之間的“熔球態(tài)”[5]而改變其功能。經(jīng)適宜的pH偏移處理后,乳清蛋白[6]、大豆分離蛋白[7-8]、大豆?jié)饪s蛋白[9]、豌豆蛋白[10]和肌球蛋白[11]等的功能得到不同程度的改善,將pH偏移聯(lián)合超聲處理豌豆蛋白[12]、聯(lián)合熱處理大豆分離蛋白[13]使其表面疏水性、乳化性等部分功能得到進(jìn)一步改善。

    花椒籽蛋白的重要應(yīng)用領(lǐng)域有乳化食品、藥物遞送載體等,但有關(guān)改善花椒籽蛋白乳化性能的研究卻鮮見報(bào)道。為此,本文研究了pH偏移對(duì)花椒籽蛋白乳化性能的影響,以期為花椒籽蛋白的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    花椒籽,蛋白質(zhì)含量為30.5%±0.25%,購(gòu)于成都市本地菜市場(chǎng);脫脂花椒籽粉(80目),實(shí)驗(yàn)室自制;SDS、β-巰基乙醇、NaOH、HCl、考馬斯亮藍(lán)等均為分析純;SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒、蛋白質(zhì)Marker,上海源葉生物科技有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    電子天平(JA2003),上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;紫外可見分光光度計(jì)(UV-2600A),上海尤尼柯儀器有限公司;pH計(jì)(PHS-3S),上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;電泳儀(DYY-8C),北京市六一儀器廠;全自動(dòng)凱氏定氮儀(K1100),山東海能科學(xué)儀器有限公司;納米粒度及電位分析儀(ZEN 3 600),馬爾文儀器有限公司;冷凍干燥機(jī)(Lyolab 3 000),丹麥Heto Holten公司。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 花椒籽蛋白質(zhì)的提取

    按寇明鈺[2]的方法并適當(dāng)修改。取適量脫脂花椒籽粉,按料液比1∶10加入蒸餾水,調(diào)pH10并維持pH恒定條件下,于25 ℃攪拌提取1 h后,4 000 r/min離心10 min,收集上清液并調(diào)pH 5.5酸析2 h后,10 000 r/min離心10 min,沉淀用蒸餾水溶解并調(diào)節(jié)pH7.0,于4 ℃透析48 h(截留分子量,3 500 Da)后,凍干得到花椒籽蛋白,-20 ℃保存。所得花椒籽蛋白的蛋白質(zhì)含量為85.45%±0.31%。

    1.3.2 pH偏移處理花椒籽蛋白質(zhì)

    按JIANG等[8]以及YILDIZ[9]的方法并適當(dāng)修改。配制1 mg/mL的花椒籽蛋白溶液,用0.1 mol/L的 HCl或NaOH分別調(diào)pH1、pH2、pH3和pH11、pH12、pH13并于20 ℃維持pH恒定1 h后,調(diào)pH7.0并于4 ℃透析(3 500 Da)48 h后凍干,于-20 ℃保存。

    1.4 分析方法

    1.4.1 還原與非還原電泳(SDS-PAGE)

    按孫雪梅等[14]的方法并適當(dāng)修改。聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮膠與分離膠濃度分別為5%和12%(w/v)。將濃度1 mg/mL的花椒籽蛋白溶液與上樣緩沖液(25 mL 0.5 mol/L Tris,20 mL甘油,40 mL10%SDS,15 mL水,pH6.8)按4∶1混合并煮沸5 min后,冰浴并離心(10 000 r/min)10 min。還原電泳中的每1 mL上樣緩沖液含50 μL的 β-巰基乙醇,非還原電泳中上樣緩沖液不加β-巰基乙醇,開始電壓為80 V,樣品進(jìn)入分離膠后調(diào)整電壓為120 V。

    1.4.2 粒徑

    按YILDIZ[9]的方法并適當(dāng)修改。將花椒籽蛋白用磷酸鹽緩沖液(10 mmol·L-1,pH7.0)稀釋成1 mg/mL的溶液,用注射器取樣于馬爾文納米粒度與電位分析儀的樣品池中,動(dòng)態(tài)光散射(DLS)于25 ℃測(cè)定。

    1.4.3 Zeta電位

    按JIANG等[15]的方法并適當(dāng)修改。將花椒籽蛋白用磷酸鹽緩沖液(10 mmol·L-1,pH7.0)稀釋成1 mg/mL的溶液,用注射器取樣于馬爾文納米粒度與電位分析儀的樣品池中,激光多普勒測(cè)速法(LDV)于25 ℃測(cè)定。

    1.4.4 表面疏水性

    按潘成磊等[16]的方法并適當(dāng)修改。稱取一定質(zhì)量的花椒籽蛋白于磷酸緩沖溶液中,于轉(zhuǎn)速1 500 r/min勻漿1 min。取1 mL樣液于2.5 mL離心管中,加入200 μL(1 mg/mL)溴酚藍(lán)溶液,在常溫下振蕩均勻,隨后8 000 r/min離心10 min。將上清液用蒸餾水稀釋10倍后在595 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ),用磷酸鹽緩沖液替代樣液做空白。花椒籽蛋白的表面疏水性表示為溴酚藍(lán)的吸附量,計(jì)算公式如下:

    式中:A對(duì)照為空白溶液的吸光值;A樣品為被測(cè)樣品溶液的吸光值。

    1.4.5 蛋白溶解度

    按MIR等[17]的方法并適當(dāng)修改。10 mg花椒籽蛋白分散于1 mL蒸餾水中并攪拌1 h,然后于20 ℃離心分離(10 000 r/min)30 min,上清液中溶解的蛋白質(zhì)采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。溶解度的計(jì)算公式為

    式中:S為溶解度;NS為上清液中蛋白質(zhì)數(shù)量;N總為樣品中的蛋白質(zhì)數(shù)量。

    1.4.6 乳化性

    按CHEN等[6]以及YILDIZ[9]的方法并適當(dāng)修改。取1 mg/mL的花椒籽蛋白溶液8 mL與2 mL大豆油混合,于16 000 r/min勻漿1 min后,分別在0和10 min時(shí)從底部吸取100 μL乳化液并以0.1% SDS溶液稀釋50倍,于500 nm處測(cè)定吸光值,以0.1% SDS溶液作為空白。乳化活性指數(shù)(EAI,m2/g)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI,min)計(jì)算公式如下:

    式中:A0為0時(shí)吸光值;A10為10 min時(shí)吸光值;N為稀釋倍數(shù),50;C為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,g/mL;θ為油相體積分?jǐn)?shù),0.2。

    1.5 數(shù)據(jù)分析

    數(shù)據(jù)結(jié)果采用OriginPro 2018C作圖。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”顯示。使用IBM SPSS Statistics 20軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析,在P<0.05水平上顯著相關(guān)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 SDS-PAGE電泳圖譜

    非還原SDS-PAGE電泳中,SDS作為變性劑和助溶劑,能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵,使分子去折疊而破壞蛋白分子的二、三級(jí)結(jié)構(gòu),可觀察蛋白質(zhì)原始狀態(tài)。還原SDS-PAGE電泳中,強(qiáng)還原劑β-巰基乙醇能斷裂蛋白分子間的二硫鍵,可觀察蛋白單體甚至亞基。以未經(jīng)pH偏移的花椒籽蛋白為對(duì)照,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1和圖2所示。

    圖1 非還原SDS-PAGE電泳圖譜

    由圖1可見:pH1和pH2泳道中分子量大于45 kDa的條帶消失,14.4 kDa下方出現(xiàn)新的條帶,pH3泳道的條帶與對(duì)照相似但顏色變淺;pH11和pH12泳道中的條帶與對(duì)照相似但14.4、45~66.2 kDa之間的條帶顏色加深,pH13泳道中18.4~35 kDa之間出現(xiàn)新條帶,分子量大于116 kDa的條帶顏色變淺,14.4和45 kDa上方的條帶顏色變深。由圖2可見:pH1、pH2泳道新增了條帶,25、35 kDa的條帶消失或顏色變淺,pH3泳道的條帶與對(duì)照相似;pH11、pH12和pH13泳道中的條帶與對(duì)照相似,但pH13泳道中35 kDa的條帶顏色比對(duì)照深。

    圖2 還原SDS-PAGE電泳圖譜

    綜上,pH1-3偏移處理后使得非還原及還原電泳圖譜中大量大分子條帶消失而小分子條帶增多,而pH11-13偏移處理對(duì)花椒籽蛋白的非還原及還原電泳圖譜的影響相對(duì)較小,與YONGSAWATDIGUL等[18]的報(bào)道類似。原因可能在于pH1-3偏移處理對(duì)蛋白質(zhì)共價(jià)作用的影響較大,使蛋白質(zhì)的部分肽鍵斷裂,但同時(shí)通過二硫鍵連接形成了更多的聚集產(chǎn)物,從而使其在電泳上樣緩沖液中的溶解度降低(與下文圖3、圖6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)應(yīng)),而pH11-13偏移處理主要改變了蛋白質(zhì)內(nèi)部非共價(jià)作用,如氫鍵、范德華力、疏水相互作用等。

    2.2 pH偏移對(duì)花椒籽蛋白粒徑的影響

    蛋白質(zhì)粒徑是影響其乳化活性和乳化穩(wěn)定性的重要指標(biāo),一般來講,粒徑小有利于提高乳液的乳化穩(wěn)定性。pH偏移對(duì)花椒籽蛋白粒徑的影響如圖3所示。

    圖3 pH偏移對(duì)花椒籽蛋白粒徑的影響

    由圖3可知:對(duì)照組的聚集粒徑最大(762.82±6.95 nm),pH偏移使花椒籽蛋白在pH7.0緩沖溶液中的聚集粒徑減小,但pH1-3處理的聚集粒徑減小幅度小于pH11-13處理;pH2處理后的聚集粒徑(521.23±12.33 nm)為對(duì)照組的0.684,而pH11、pH12、pH13處理后的聚集粒徑為303.7±5.5、226.53±4.19和204.2±1.39 nm,分別為對(duì)照組的0.398 1、0.297和0.267 7??赡茉蚴莗H11-13處理時(shí),花椒籽蛋白因遠(yuǎn)離等電點(diǎn)而結(jié)構(gòu)更容易被破壞,分子內(nèi)及分子間的氫鍵、疏水力、范德華力等作用力減弱而使其較大的聚集體發(fā)生集聚,蛋白質(zhì)重折疊(pH 7.0)后依然保持著較小的粒徑[6,9]。

    2.3 pH偏移對(duì)花椒籽蛋白表面疏水性的影響

    表面疏水性與蛋白質(zhì)的乳化性能、起泡性能、凝膠性能等功能密切相關(guān)[12]。pH偏移對(duì)花椒籽蛋白表面疏水性的影響如圖4所示。

    圖4 pH偏移對(duì)花椒籽蛋白表面疏水性的影響

    由圖4可知:對(duì)照組疏水性最?。?5.3±2.35 μg),pH偏移顯著提高了表面疏水性。pH1-3處理后,表面疏水性隨pH增加而降低,pH1時(shí)表面疏水性最大(165.7±1.34 μg);pH11-13處理后,表面疏水性大于pH1-3處理,pH11、pH12和pH13的表面疏水性為187.3±0.54、201.3±0.46 和221.2±1.23 μg,分別是對(duì)照組的3.39、3.64、4.0倍。這可能是pH11-13遠(yuǎn)離花椒籽蛋白質(zhì)的等電點(diǎn),由于靜電斥力增強(qiáng)迫使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞,分子充分展開而暴露出更多的疏水基團(tuán),蛋白質(zhì)重折疊(pH7.0)后依然保持著較高的表面疏水性[6,9]。

    2.4 pH偏移對(duì)Zeta電位的影響

    Zeta電位表示粒子在溶液中的帶電情況,可反映蛋白質(zhì)在溶液中的懸浮穩(wěn)定性[19]。pH偏移處理對(duì)Zeta電位的影響如圖5所示。

    圖5 pH偏移對(duì)花椒籽蛋白Zeta電位的影響

    由圖5可知:除pH3處理的花椒籽蛋白的Zeta電位(-17.5±1.11 mV)絕對(duì)值略低于對(duì)照組(-18.3±1.01 mV)外,其余pH處理的花椒籽蛋白其Zeta電位絕對(duì)值均高于對(duì)照組;pH1-3處理后,pH2所得花椒籽蛋白的Zeta電位絕對(duì)值最高(-23.4±1.26 mV);pH11-13處理使Zeta電位絕對(duì)值的增大幅度整體大于pH1-3處理,pH12所得花椒籽蛋白的Zeta電位絕對(duì)值最高(-28.3±1.79 mV),為對(duì)照組的1.55倍。Zeta電位絕對(duì)值的增大表明靜電斥力增大,因而有利于防止蛋白質(zhì)在溶液中聚集而提高其懸浮穩(wěn)定性。

    2.5 pH偏移對(duì)花椒籽蛋白質(zhì)溶解度的影響

    溶解性是蛋白質(zhì)重要的功能性質(zhì)之一,極大影響蛋白質(zhì)在溶液中的使用比例,良好的溶解度是其作為乳化劑的先決條件[12]。pH偏移對(duì)花椒籽蛋白質(zhì)溶解度的影響如圖6所示。

    圖6 pH偏移對(duì)花椒籽蛋白溶解度的影響

    由圖6可知pH偏移處理可提高花椒籽蛋白的溶解度。pH1-3處理使溶解度略有提高,pH11-13處理使溶解度大幅度提高,pH12處理所得花椒籽蛋白的溶解度為85.31%±1.15%,為對(duì)照組(15.7%±1.4%)的5.43倍。可能原因是pH11-13偏移處理后蛋白質(zhì)分子內(nèi)及分子間的氫鍵、疏水力、范德華力等減弱,使得蛋白質(zhì)聚集體發(fā)生部分解聚,粒徑降低且表面積增大,暴露出更多親水基團(tuán),從而蛋白質(zhì)與水的離子關(guān)系得到強(qiáng)化[6,9],進(jìn)而促進(jìn)了溶解度提高。pH12處理大豆分離蛋白(SPI)、大豆?jié)饪s蛋白和豌豆蛋白[7-10]也顯著提高了溶解度。

    2.6 pH偏移對(duì)花椒籽蛋白乳化性能的影響

    乳化性能是蛋白質(zhì)重要的功能性質(zhì),常用乳化活性指數(shù)(EAI)與乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI)進(jìn)行評(píng)價(jià)。pH偏移對(duì)花椒籽蛋白乳化性能的影響如圖7所示。

    圖7 pH偏移對(duì)花椒籽蛋白乳化性能的影響

    由圖7可知pH偏移處理可提高花椒籽蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。pH1-3處理后,乳化活性指數(shù)隨pH增加而增加,乳化穩(wěn)定性指數(shù)則隨pH增加而降低,無法兼顧高乳化活性和高乳化穩(wěn)定性。pH11-13處理后,pH11和pH13同樣難以兼顧乳化活性和乳化穩(wěn)定性,但pH12處理的樣品則較好地兼顧了高乳化活性和高乳化穩(wěn)定性,其乳化活性指數(shù)(13.44±0.71 m2/g)為對(duì)照組(6.69±0.53 m2/g)的2.01倍,乳化穩(wěn)定性指數(shù)(97.80±0.74 min)為對(duì)照組(19.48±0.67 min)的5.02倍。pH12處理的花椒籽蛋白能兼顧高乳化活性和高乳化穩(wěn)定性,可能是因?yàn)榛ń纷训鞍拙哂休^小的粒徑、較大的表面疏水性和較強(qiáng)的靜電斥力及其三者之間的平衡,有助于蛋白質(zhì)快速吸附于油水界面并形成穩(wěn)定的界面彈性膜。

    3 結(jié)論

    pH偏移能明顯改變花椒籽蛋白的理化指標(biāo)及乳化特性,pH1-3與pH11-13的處理均能降低花椒籽蛋白的粒徑并提高花椒籽蛋白的Zeta電位、表面疏水性、溶解度、乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)。綜合來看,pH12的處理效果對(duì)于花椒籽蛋白理化指標(biāo)及乳化性質(zhì)的改善最為明顯,具體表現(xiàn)為pH12偏移處理后所得到的花椒籽蛋白的粒徑由762.82±6.95 nm降低至226.53±4.19 nm、Zeta電位由-18.3±1.01 mV降低至-28.3±1.79 mV、表面疏水由55.3±2.35 μg增大至201.3±0.46 μg、溶解度由15.7%±1.4%增大至85.31%±1.15%、乳化活性指數(shù)由6.69±0.53 m2/g增大至13.44±0.71 m2/g、乳化穩(wěn)定 性 指 數(shù) 由19.48±0.67 min增 大 至97.80±0.74 min。該結(jié)論為花椒籽蛋白的開發(fā)提供了理論依據(jù),對(duì)于提高花椒籽綜合利用水平具有積極意義。

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