蛹、米蟲草多糖含量及抗氧化活性比較研究

白麗丹，段懿涵，譚超杰，李春陽，王博，盛瑜

（北華大學藥學院，吉林吉林132013）

北蟲草（Cordyceps militaris），于1958年在吉林省首次發(fā)現(xiàn)，又名北冬蟲夏草，蛹蟲草，與冬蟲夏草同屬不同種[1]。它是由子座（即草部分，又稱子實體）與菌核（即蟲的尸體部分）組成的復合體[2]。研究發(fā)現(xiàn)，北蟲草的有效化學成分主要包括蟲草多糖、蟲草素、蟲草酸等，同時還含有各種蛋白質(zhì)和人體所必需的氨基酸，鈣、鋅、硒、錳等微量元素[3]。其中，蟲草多糖是北蟲草最豐富的成分之一，具有廣泛的生物活性，包括抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等功效，尤其在清除自由基的方面功能顯著[4]。研究表明，人體在新陳代謝過程中會產(chǎn)生超氧自由基、羥自由基、過氧化氫等活性氧，但一般處于低水平的平衡狀態(tài)，隨著人們年齡的增長，人體清除這些自由基能力會逐漸下降，殘留的自由基導致細胞和細胞膜過氧化損傷，從而加速各器官的衰老，并增加各種疾病發(fā)生的機率[5-7]。因此，具有清除自由基功效的蟲草多糖可作為天然的抗氧化劑，具備成為抗氧化保健食品和化妝品原料的潛質(zhì)。

目前，市場上常見的北蟲草子實體有兩種，一種是以蠶蛹為培養(yǎng)基的蛹蟲草，一種是以大米為培養(yǎng)基的米蟲草，二者因培養(yǎng)成本的差異導致其在市場上的價格有明顯區(qū)別，但在生產(chǎn)和生活中常被混淆使用，對于其功效是否一致未見報道。

本試驗以北蟲草子實體多糖的提取為基礎，以其體外抗氧化活性為指標，考察不同培養(yǎng)基（蠶蛹和大米）的北蟲草抗氧化能力的差異，為研究北蟲草多糖的藥理作用及機制奠定基礎，同時為進一步確立開發(fā)北蟲草多糖成為抗氧化保健食品的原料來源，為吉林省北蟲草生產(chǎn)基地提供相關信息，促進其增加北蟲草的產(chǎn)品附加值，增強其市場競爭力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米蟲草、蛹蟲草：沈陽聚鑫北蟲草菌業(yè)有限公司；澄清劑：北京正天澄清技術有限公司；DPPH：上海化成工業(yè)發(fā)展有限公司；三吡啶基三嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）：南京都萊生物技術有限公司；抗壞血酸：天津市永大化學試劑有限公司；無水乙醇、乙酸乙酯、冰乙酸、硫酸亞鐵（均為分析純）：天津市大茂化學試劑廠。

酶標儀（Infinite M200）：瑞士 Tecan公司；恒溫混勻儀（ThermoMixer C）：德國Eppendorf公司；恒溫水浴鍋（HH-S1-Ni）：北京長安科學儀器廠；真空干燥箱（DZ-1BCⅡ）：北京中西遠大有限公司；電子天平（AL204）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蟲草多糖的提取與純化

取蛹蟲草和米蟲草干燥子實體粉末（40目），乙酸乙酯、無水乙醇去除脂溶性、醇溶性雜質(zhì)，濾渣自然揮干，熱水浸提，Sevag法去蛋白，離心，取上清液，均分5等份，分別加入無水乙醇使溶液中乙醇體積分數(shù)達到50%、60%、70%、80%、90%，靜置 12 h，收集沉淀烘干，即得粗多糖。將上述粗多糖復溶，透析，除去小分子雜質(zhì)，冷凍干燥得精制多糖。

1.2.2 多糖含量測定

標準曲線的繪制：稱取葡萄糖標品10 mg，定容至100 mL容量瓶中，得濃度為0.1 mg/mL對照品溶液。依次吸取對照品溶液 0、0.05、0.1、0.2、0.4 mL，加 6%苯酚溶液0.5 mL，濃硫酸2.5 mL，充分振搖，室溫（20℃）放置10 min。于490 nm波長處測定吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

樣品含量測定：精密稱定精制多糖0.1 g，定容至50 mL容量瓶中，使終濃度為2 mg/mL，充分搖勻，即得。測定方法同葡萄糖標準品溶液，根據(jù)標準曲線計算多糖含量。

式中：X為樣品中多糖含量，%；C為多糖濃度，g/mL；D為樣品稀釋倍數(shù)；V為樣品體積，mL；G為菌絲體干重，g。

1.2.3 多糖抗氧化活性測定

1.2.3.1 DPPH自由基清除率測定

將各級醇沉多糖依次配制成濃度為2、1.6、1.2、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg/mL 的待測樣品溶液 100 μL，加入10 mmol/mL DPPH溶液100 μL，25℃恒溫箱靜置30 min，于517 nm處測量其吸光度（Ai）；每組3次平行試驗，以VC水溶液作陽性對照[8-9]。清除率公式計算如下：

式中：A0為蒸餾水代替樣品溶液的吸光度；Aj為無水乙醇替換DPPH溶液的吸光度。

1.2.3.2 羥基自由基（·OH）清除率測定

取濃度為 5、4、3、2、1、0.5 mg/mL 的樣品溶液各50 μL，加入 6 mmol/L FeSO4水溶液、6 mmol/L 水楊酸溶液、6 mmol/L H2O2溶液各50 μL，混合均勻，37℃恒溫箱靜置30 min在520 nm處測量其吸光度（Ai）。以VC水溶液作陽性對照[9-10]。按如下公式計算清除率：

式中：A0為蒸餾水代替樣品溶液的吸光度；Aj為蒸餾水替換雙氧水溶液的吸光度。

1.2.3.3 鐵離子還原能力法（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）法測定北蟲草多糖抗氧化能力

FRAP工作液300 mmol/L醋酸鹽緩沖液（pH3.6）、10 mmol/L TPTZ 溶液、20 mmol/LFeCl3，體積比 10 ∶1 ∶1混合，現(xiàn)用現(xiàn)配，以FeSO4溶液為標準液繪制標準曲線。樣品液稀釋至適宜濃度，精密吸取20 μL樣品溶液和150 μL工作液，于593 nm處測量其吸光度，F(xiàn)RAP以 FeSO4mmol/g 表示[11-13]。

1.2.4 北蟲草多糖對H2O2誘導PC12細胞損傷的保護作用

1.2.4.1 北蟲草多糖對正常PC12細胞的毒性試驗

從兩組多糖中各選出抗氧化活性較好的醇沉組分，即70%米蟲草多糖（Cordyceps oryzae polysaccharide，COP），80%蛹蟲草多糖（Cordycepsmilitarispolysaccharides，CMP）作為研究對象。試驗分組：正常對照組（CON）、米蟲草多糖（70%）試驗組（0.1、1、10、100 μg/mL）、蛹蟲草多糖（80%）試驗組（0.1、1、10、100 μg/mL）。選取處于對數(shù)生長期的PC12細胞（5×104個/mL），接種于 96 孔板，每孔 100 μL，每組各 3 個復孔，培養(yǎng)24 h后，試驗組加入100 μL不同濃度的北蟲草多糖，對照組加入100 μL培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔各加20 μL噻唑蘭 [3-（4，5-dimethy l-2-thiazoly l）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT]（5 mg/mL），4 h后將上清液吸出，加入150 μL二甲基亞砜，搖勻，放置5 min，酶標儀490 nm處測定吸光度值[14-16]。損傷組吸光度值與正常對照組的比值即為細胞活力值。

1.2.4.2 H2O2誘導PC12細胞損傷模型的構建

取對數(shù)生長期的PC12細胞，細胞懸液濃度調(diào)整為 5×104個/mL。設置正常對照組（CON）和H2O2濃度損傷組（100、200、300、400、500 μmol/L），將細胞接種于96孔板，每孔100 μL，每組各3個復孔。于37℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后，損傷組分別加入不同濃度的 H2O2溶液 100 μL，對照組加入 100 μL 培養(yǎng)液，各個濃度分別損傷 1、2、3、4、5 h。損傷結束后，MTT 法測定吸光度，計算細胞活力值[17-19]。

1.2.4.3 北蟲草多糖對H2O2誘導PC12細胞損傷的保護作用

選取處于對數(shù)生長期的PC12細胞（5×104個/mL），將其接種于96孔板，設置正常對照組（CON）、模型組（MOD）、米蟲草多糖（70%）試驗組（0.1、1、10、100 μg/mL）、蛹蟲草多糖（80%）試驗組（0.1、1、10、100 μg/mL）。每孔中加入細胞懸液 100 μL，在 37 ℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)24 h，模型組與試驗組每孔加入100 μL濃度為300 μmol/L的H2O2溶液培養(yǎng)3 h后將模型組和試驗組每孔吸出100 μL上清液，試驗組加入不同濃度的北蟲草多糖溶液100 μL，對照組與模型組各加入100 μL培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔各加20 μL MTT（5 mg/mL），4 h 后將上清液吸出，加入 150 μL 二甲基亞砜，搖勻，放置5 min，酶標儀490 nm處測定吸光度值，計算細胞活力值[18，20-22]。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每組試驗平行測定3次。采用軟件SPSS 19.0進行統(tǒng)計學分析。多糖含量、FRAP值均以（±S）表示，試驗數(shù)據(jù)分析由Graphpad Prism7.00統(tǒng)計軟件處理，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 多糖含量測定

2.1.1 葡萄糖標準曲線

葡萄糖溶液標準曲線見圖1。

以葡萄糖為對照品溶液，繪制標準曲線，得回歸方程Y=0.014 9x-0.009 2，相關系數(shù)R2=0.999，線性關系良好。

2.1.2 含量測定

兩種蟲草多糖提取率及純度比較見表1。

圖1 葡萄糖溶液標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose solution

表1 兩種蟲草多糖提取率及純度比較Table 1 Comparison of extraction rate and purity of CMP and COP

由表1結果可知，隨著沉淀體系中乙醇濃度的升高，米蟲草多糖與蛹蟲草多糖的提取率逐步增多，但各級醇沉組分多糖含量分布不均。多糖提取率以凍干后的多糖質(zhì)量占蟲草子實體粉末的質(zhì)量百分數(shù)表示[23]。

2.2 抗氧化活性分析

2.2.1 DPPH自由基清除率

由不同濃度乙醇沉淀的蟲草多糖對DPPH自由基清除率見圖2。

由圖2結果分析可知，米蟲草多糖和蛹蟲草多糖都具有清除DPPH自由基的作用，且清除能力呈量效正相關。乙醇濃度為50%時，兩種多糖對DPPH自由基的清除率無顯著差異，乙醇濃度為70%時，米蟲草多糖作用效果略高于蛹蟲草多糖，其余各級醇沉組分中蛹蟲草多糖清除能力較強，與米蟲草多糖相比差異較顯著。

兩種蟲草各級醇沉組分組間清除DPPH自由基能力大小順序如圖1G、圖1H所示，米蟲草多糖各級醇沉組分清除能力依次為70%、90%、80%、60%、50%。蛹蟲草多糖各級醇沉組分清除能力依次為80%、70%、90%、60%、50%。

圖2 不同濃度乙醇沉淀的兩種蟲草多糖DPPH自由基清除率比較Fig.2 Comparison of DPPH radical scavenging rate of COP and CMP precipitated by different concentrations of ethanol

2.2.2 ·OH清除率

由不同濃度乙醇沉淀的蟲草多糖對·OH清除率見圖3。

由圖3結果分析可知，兩種多糖各組分對羥基自由基均有一定的清除作用。乙醇濃度為70%時，米蟲草多糖清除率略高于蛹蟲草多糖，其余各級醇沉組分相比蛹蟲草多糖作用效果好。米蟲草各級醇沉組分組間清除羥基自由基能力依次為80%、70%、90%、60%、50%，蛹蟲草多糖各級醇沉組分清除能力大小與DPPH自由基清除能力一致。

2.2.3 北蟲草多糖的FRAP值

FeSO4標準曲線見圖4。

圖3 不同濃度乙醇沉淀的蟲草多糖對羥基自由基清除率比較Fig.3 Comparison of hydroxyl radical scavenging rate of COP and CMP precipitated by different concentrations of ethanol

圖4 FeSO4標準曲線Fig.4 FeSO4standard curve

根據(jù)593 nm測得FeSO4溶液的吸光值，繪制FeSO4標準曲線，得回歸方程Y=0.743x+0.038 3，相關系數(shù)R2=0.999 7。

不同乙醇濃度沉淀的蟲草多糖FRAP，見圖5。

圖5 不同乙醇濃度沉淀的蟲草多糖FRAPFig.5 FRAP of COP and CMP precipitated with different ethanol concentrations

由圖5結果分析可知，蛹蟲草多糖對Fe3+的還原能力高于米蟲草多糖。在兩種蟲草的不同醇沉組分中，90% CMP、70% COP 對 Fe3+的還原能力較強，F(xiàn)RAP分別為 0.744 4、0.564 7 mmol/g。

2.3 兩種蟲草多糖對H2O2誘導損傷的PC12細胞的保護作用

2.3.1 北蟲草多糖對正常PC12細胞的毒性試驗

北蟲草多糖對正常PC12細胞的增殖影響見圖6。

由圖6結果可知，兩種不同來源北蟲草中的多糖對PC12細胞的生長均無細胞毒性，濃度達到10、100 μg/mL時可促進細胞顯著增殖。

2.3.2 H2O2誘導PC12細胞損傷模型的構建

H2O2濃度及損傷時間的篩選見圖7。

由圖7結果分析可知，隨著H2O2濃度和損傷時間增加，PC12細胞的損傷情況也隨之加重，當H2O2濃度為300 μmol/L、損傷時間3 h時，細胞活力為57.91%，損傷程度適宜，因此將其作為構建PC12細胞損傷模型的條件。

圖6 兩種蟲草多糖對PC12細胞增殖的影響Fig.6 Effect of COP and CMP on the proliferation of PC12 cells

圖7 H2O2濃度及損傷時間的篩選Fig.7 Screening of H2O2concentration and injury time

2.3.3 北蟲草多糖對H2O2誘導PC12細胞損傷的保護作用

北蟲草多糖對H2O2損傷的PC12細胞活力的影響見圖8。

圖8 兩種北蟲草多糖對H2O2損傷PC12細胞活力的影響Fig.8 Effect of COP and CMP on the viability of PC12 cells injured by H2O2

由圖8分析可知，經(jīng)H2O2處理后，PC12細胞的生長受到顯著抑制（P<0.01），與正常細胞相比，其存活率下降為57.63%。經(jīng)北蟲草多糖處理后，細胞的增殖活性呈現(xiàn)升高趨勢，當劑量達到100 μg/mL時，細胞存活率的升高具有顯著性差異（P<0.01），蛹蟲草多糖細胞存活率達到90.45%，米蟲草多糖細胞存活率達到82.62%。

3 結論

在對兩種不同來源蟲草的多糖研究中發(fā)現(xiàn)，米蟲草多糖在提取率及含量方面高于蛹蟲草多糖，兩種多糖的提取率隨著乙醇濃度增加而增加，但多糖含量分布不均。兩種北蟲草的各級醇沉多糖中，80% CMP和70% COP清除自由基能力較強；FRAP法結果表明蛹蟲草各級醇沉組分作用效果優(yōu)于米蟲草。結合兩種蟲草組間各級醇沉多糖抗氧化能力分析，當乙醇濃度為70%～90%時所得多糖體外抗氧化效果較好，但從資源成本方面考慮，不宜用90%的濃度進行醇沉?？傮w來看，兩種蟲草多糖均具有一定的體外抗氧化能力，蛹蟲草多糖作用效果優(yōu)于米蟲草多糖。

根據(jù)體外抗氧化能力試驗結果，選取沉淀體系為乙醇濃度80%的蛹蟲草多糖和70%的米蟲草多糖為研究對象。當多糖濃度為10 μg/mL和100 μg/mL、作用時間24 h時，可顯著促進正常PC12細胞的增殖。由H2O2誘導氧化損傷的PC12細胞經(jīng)兩種不同來源的蟲草多糖處理后，細胞存活率都有不同程度的提升，呈濃度依賴性；當多糖濃度為100 μg/mL時，細胞存活率顯著增加，且蛹蟲草多糖作用效果優(yōu)于米蟲草多糖，與體外抗氧化活性測定結果一致。試驗通過確定二者在有效成分含量和功效方面的差異，可為提高北蟲草質(zhì)量控制標準提供理論和試驗基礎。