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    抑制石榴枯萎病菌的化學(xué)農(nóng)藥和木霉菌株篩選

    2020-10-14 11:50:38馬麗婷魯海菊羅玉端李昱賢
    紅河學(xué)院學(xué)報(bào) 2020年5期
    關(guān)鍵詞:三唑酮化學(xué)農(nóng)藥枯萎病

    馬麗婷,魯海菊,羅玉端,胡 婕,李昱賢

    (1.紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,云南蒙自 661199;2.蒙自海關(guān)綜合技術(shù)中心,云南蒙自 661199)

    石榴(Punica granatum)是云南重要的經(jīng)濟(jì)林果之一。蒙自萬(wàn)畝石榴園享有“中國(guó)石榴之鄉(xiāng)”的美譽(yù)。近年來(lái),由于石榴栽培越來(lái)越集中,樹齡越來(lái)越大,石榴病害日漸嚴(yán)重,石榴枯萎病是其中最嚴(yán)重且最難防的病害之一。石榴枯萎病是一種毀滅性土傳植物真菌病害,其病原菌是甘薯長(zhǎng)喙殼(Ceratocystis fimbriata)。[1,2]每年4—5月、8—9月為兩次發(fā)病高峰期,植株感病后葉片黃化、萎蔫,植株從根到主干木質(zhì)部橫切面變?yōu)楹稚?周后整個(gè)植株萎蔫死亡。[2-3]該病害在中國(guó)由劉云龍[2]等首次報(bào)道云南蒙自發(fā)生石榴枯萎病以來(lái),日益加重,至今仍未找到有效的防治措施。根據(jù)文獻(xiàn)記載,2004年發(fā)病率上升至15.0%,經(jīng)濟(jì)損失達(dá)1500萬(wàn)以上。[4]且發(fā)生石榴枯萎病的石榴園再植健壯的石榴苗也很難成活,石榴枯萎病可導(dǎo)致整個(gè)果園的毀滅,[5]嚴(yán)重影響了蒙自石榴產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。目前許多學(xué)者針對(duì)石榴枯萎病進(jìn)行研究,據(jù)報(bào)道,毛忠順等研究26種化學(xué)農(nóng)藥對(duì)石榴枯萎病菌的抑制作用,認(rèn)為枯萎必克、倍得豐、萬(wàn)霉靈、大佳托、果病靈和20%三唑酮 6 種化學(xué)農(nóng)藥可作為田間防效研究的備選農(nóng)藥。[6]經(jīng)袁陽(yáng)等研究表明,氟菌·氟環(huán)唑-大蒜復(fù)配對(duì)石榴枯萎病有很好的防治效果。[5]諸多研究者對(duì)生防菌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[7]、公牛鏈霉菌(Streptomyces tauricus)[8]、萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)[1]、壯觀鏈霉菌(Streptomyces spectabilis)[9]均對(duì)石榴枯萎病菌有拮抗作用。大薊石油醚提取物,[10]木姜子乙醇提取物,[11]苦參、黃連、細(xì)辛、板藍(lán)根、蘆薈等的提取物,[12]枯草芽孢桿菌YZS-B15和HB菌株及熒光假單胞桿菌YZS-Ph02菌株[13]均對(duì)石榴枯萎病菌具有很好的抑制作用。

    木霉(Trichodermaspp.)菌是一種普遍存在的真菌,是重要的生防因子。木霉菌通過(guò)分泌產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶類和次級(jí)代謝物、營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)等方式,進(jìn)行重寄生等作用,[14]拮抗其他植物病原菌。經(jīng)魯海菊等研究表明,枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株對(duì)枇杷根腐病病菌(Pestalotiopsissp.)、辣椒黃萎病病菌(Verticilliumdahliae.)、辣椒黑斑病病菌(Alternariasp.)、萬(wàn)壽菊葉斑病病菌(Alternariasp.)、康乃馨根腐病病菌(Fusariumsp.)和仙客來(lái)根腐病菌(Fusariumsp.)等6種植物病原菌有不同程度的抑菌作用。[15]綜上,木霉P3.9等菌株對(duì)石榴枯萎病菌是否有抑菌作用,值得我們?nèi)ヌ接?。石榴枯萎病危害面積不斷擴(kuò)大,至今仍然沒(méi)有明確有效地田間防治措施。由于化學(xué)農(nóng)藥易產(chǎn)生抗藥性,更新?lián)Q代較快,有必要篩選抑菌效果較好的新農(nóng)藥。此外,石榴枯萎病生物防治僅限于原核微生物及植物提取物,木霉是否對(duì)石榴枯萎病菌有抑制作用,至今未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此,本試驗(yàn)篩選抑制石榴枯萎病菌的化學(xué)農(nóng)藥和木霉菌株,為石榴枯萎病的田間防治提供有效的化學(xué)農(nóng)藥及生防菌種資源。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 供試菌株

    石榴枯萎病病原菌甘薯長(zhǎng)喙殼(Ceratocystis fimbriata)、木霉(Trichodermaspp.)菌株:J1、PJ1-1、PJ1-2、J2、PJ3、GD1、GM6、PZ1、抗氟硅唑PZ1、J3、抗三唑酮GD1、Y2、抗三唑酮Y2、抗三唑酮GM6、抗氟硅唑GM6、抗三唑酮PZ1、J5、PY2、J4、JD3、GD3、GD5,庫(kù)存于紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

    1.1.2 供試化學(xué)農(nóng)藥

    表1 供試化學(xué)農(nóng)藥相關(guān)信息

    1.1.3 供試培養(yǎng)基

    PDA:馬鈴薯 200 g、葡萄糖16 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1000 mL。以上培養(yǎng)基配好后在121℃高壓滅菌30分鐘。材料均購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)及試劑公司,試劑均為分析純。

    1.2 方法

    1.2.1 菌株的擴(kuò)繁

    將庫(kù)存的供試菌株接種到PDA平板上,石榴枯萎病菌于25℃恒溫培養(yǎng)14d,木霉菌于25℃恒溫培養(yǎng)7d。用直徑5mm打孔器取菌塊備用。

    1.2.2 測(cè)定不同化學(xué)農(nóng)藥對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率

    采用菌絲生長(zhǎng)速率法,[5]將化學(xué)農(nóng)藥按照使用說(shuō)明的濃度加到PDA培養(yǎng)液中,搖勻后倒入滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿中備用。又將供試活化后的石榴枯萎病菌菌塊接種到含化學(xué)農(nóng)藥的培養(yǎng)基平板中央,以石榴枯萎病菌菌塊接種到不含化學(xué)農(nóng)藥的PDA培養(yǎng)基平板中央為對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)3次,28℃下恒溫培養(yǎng)7d后,用十字交叉法[5]測(cè)量菌落直徑,記錄菌落擴(kuò)展情況,并用以下公式計(jì)算抑菌率:抑菌率(%)=(對(duì)照菌落增長(zhǎng)直徑-含藥培養(yǎng)基上菌落增長(zhǎng)直徑)/對(duì)照增長(zhǎng)菌落直徑×100。

    1.2.3 測(cè)定木霉菌株對(duì)石榴枯萎病菌的抑制率

    采用對(duì)峙培養(yǎng)法,[15]將木霉菌塊與石榴枯萎病菌菌塊兩兩組合,接種到距離平板中央相等的兩個(gè)點(diǎn)上,以不接種木霉菌塊作為對(duì)照,重復(fù)3次,于28℃恒溫培養(yǎng)7d,測(cè)定菌落直徑,計(jì)算抑制率:抑菌率(%)=(對(duì)照菌落增長(zhǎng)直徑-含藥培養(yǎng)基上菌落增長(zhǎng)直徑)/對(duì)照增長(zhǎng)菌落直徑×100

    1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

    所得數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行匯總,計(jì)算平均值和作圖,所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用 SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件Duncan氏多重比較法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)算處理間的差異顯著性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同化學(xué)農(nóng)藥對(duì)石榴枯萎病菌的抑制作用

    由圖1可知,經(jīng)Duncana多重比較發(fā)現(xiàn),咪鮮胺、丙環(huán)唑、多菌靈3種化學(xué)農(nóng)藥對(duì)石榴枯萎病菌菌落生長(zhǎng)差異不顯著,但與其余處理間的差異極顯著,病原菌菌落直徑為0.00mm,抑菌率達(dá)100%,抑制效果最好。甲基硫菌靈對(duì)石榴枯萎病菌生長(zhǎng)的影響與其余處理間差異極顯著,病原菌菌落直徑為7.00mm,抑菌率為63.79%。苯醚甲環(huán)唑、氟硅唑、三唑酮、百菌清4種化學(xué)農(nóng)藥抑菌率均小于50%。其中:氟硅唑和三唑酮抑菌差異不顯著,而苯醚甲環(huán)唑和百菌清抑菌差異極顯著。綜上,咪鮮胺、丙環(huán)唑和多菌靈可作為田間防治石榴枯萎病的首選化學(xué)農(nóng)藥。

    圖1 不同化學(xué)農(nóng)藥對(duì)石榴枯萎病菌的抑制作用

    2.2 不同木霉菌株對(duì)石榴枯萎病菌的抑制作用

    由圖2可知,經(jīng)Duncana多重比較發(fā)現(xiàn),PJ1-1、PJ1-2、J2和PJ3 4個(gè)木霉菌株對(duì)石榴枯萎病菌菌落生長(zhǎng)影響差異不顯著,但與其余菌株間的差異極顯著,病菌菌落直徑分別為8.83mm、9.00mm、8.67mm和8.83mm,抑菌率均達(dá)70%以上。J1木霉菌株對(duì)石榴枯萎病菌菌落生長(zhǎng)的影響,與PJ1-1、PJ1-2、J2、PJ3 4個(gè)菌株間的差異極顯著,病菌菌落直徑為7.67mm,抑菌率為76%,抑制效果最好。PZ1木霉菌株對(duì)石榴枯萎病菌菌落生長(zhǎng)的影響,與其余菌株間的差異極顯著,病菌菌落平均直徑為10.83mm,抑菌率為66%。GM6、抗氟硅唑PZ1和J3 3個(gè)菌株對(duì)病菌生長(zhǎng)影響差異不顯著,但與其余菌株間的差異極顯著,病菌菌落直徑分別為11.77mm、12.00mm和11.88mm,抑菌率為63%。GD1與其余菌株間的影響差異極顯著,病菌菌落直徑為12.5mm,抑菌率為61%。綜上,J1、PJ1-1、PJ1-2、J2、PJ3 5個(gè)木霉菌株對(duì)石榴枯萎病菌抑菌率70%以上,可作為開發(fā)生防菌劑的菌種資源。

    圖2 抑菌率在60%以上木霉菌株對(duì)石榴枯萎病菌的抑制作用

    由圖3可知,經(jīng)Duncana多重比較發(fā)現(xiàn),Y2、抗三唑酮PZ1和J4 3個(gè)木霉菌株對(duì)石榴枯萎病菌菌落生長(zhǎng)的影響,與其余菌株差異極顯著,病菌菌落直徑分別為13.17mm、13.67mm和17.33mm,抑菌率分別為59%、57%和46%??谷蛲猋2和抗三唑酮GM6 2個(gè)菌株對(duì)石榴枯萎病菌生長(zhǎng)的影響差異不顯著,但與其余菌株間的差異極顯著,病原菌菌落直徑分別為14.67mm、14.50mm,抑菌率為55%。J5和抗氟硅唑GM6對(duì)石榴枯萎病菌生長(zhǎng)的影響差異不顯著,但與其余菌株間的差異極顯著,病菌菌落直徑均為15.83mm,抑菌率為51%。JD3、GD3和GD5 3個(gè)菌株對(duì)石榴枯萎病菌生長(zhǎng)的影響差異不顯著,但與其余菌株間的差異極顯著,病菌菌落直徑分別為20.00mm、19.83mm和19.33mm,抑菌率在38%-40%之間。

    圖3 抑菌率在60%以下木霉菌株對(duì)石榴枯萎病菌的抑制作用

    3 討論

    8種化學(xué)農(nóng)藥均對(duì)石榴枯萎病菌有抑制作用。其中:首先是咪鮮胺、丙環(huán)唑、多菌靈3種農(nóng)藥的抑菌效果最好,抑菌率高達(dá)100%,這與何平[16]等試驗(yàn)結(jié)果相符。其次是甲基硫菌靈,抑菌率為63.79%。苯醚甲環(huán)唑、氟硅唑、三唑酮、百菌清4種農(nóng)藥抑菌作用差且均小于50%。其中:多菌靈對(duì)石榴枯萎病菌室內(nèi)抑菌率為100%與毛忠順[5]等試驗(yàn)研究結(jié)果不一致,二者相差兩倍多。苯醚甲環(huán)唑抑制效果差與何平[16]試驗(yàn)結(jié)果一致。三唑酮和百菌清對(duì)石榴枯萎病抑制率低與毛忠順[5]等的試驗(yàn)結(jié)果,二者抑菌率相差四倍多,這可能病原菌發(fā)生突變、藥劑升級(jí)等原因有關(guān)。因此,在投入大田使用前應(yīng)做室內(nèi)抑菌率檢測(cè)。另外,根據(jù)張德勝等報(bào)載,苦參堿與甲基硫菌靈、百菌清和異菌脲混配使用對(duì)甘薯長(zhǎng)喙殼的抑制作用均優(yōu)于單獨(dú)使用。[17]今后,防治石榴枯萎病應(yīng)選擇使用混配劑。

    22個(gè)木霉菌株均對(duì)石榴枯萎病菌具有抑菌作用。抑菌率在22%~76%之間。其中:效果最好的是J1、PJ1-1、PJ1-2、J2和PJ3 5個(gè)木霉菌株,抑菌率均達(dá)70%以上。根據(jù)魯海菊等研究,PJ1-1、PJ1-2、PJ3抗藥性木霉菌株對(duì)病原菌的抑菌率高于原始菌株,[18]其中:此次檢測(cè)PJ1-1、PJ1-2抑菌率與魯海菊等試驗(yàn)結(jié)果不一致,可能與菌株退化酶活性降低等原因有關(guān)。萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)[1],板藍(lán)根、蘆薈的提取物[12]對(duì)石榴枯萎病菌的抑菌作用比此次檢驗(yàn)表現(xiàn)最好的木霉菌株低5%-20%??莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)[7]、公牛鏈霉菌(Streptomyces tauricus)[8]、壯觀鏈霉菌(Streptomyces spectabilis)[9]、大薊石油醚提取物[10],木姜子乙醇提取物,[11]苦參、黃連、細(xì)辛的提取物,[12]枯草芽孢桿菌菌株YZS-B15 和HB 及熒光假單胞桿菌菌株YZS-Ph02[13]對(duì)石榴枯萎病菌的抑制率比此次檢驗(yàn)表現(xiàn)最好的木霉菌株高5%-30%。但是,木霉菌和病原菌的相互作用機(jī)制在分子水平上有明顯的優(yōu)勢(shì),木霉菌具有延遲干旱脅迫和抵御病原菌侵害等功能,[19]提高農(nóng)作物的抗逆性。同時(shí),木霉菌及其代謝產(chǎn)物還能促進(jìn)植物生長(zhǎng),增加植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用,提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量,而且其廣泛存在于大自然,取材方便,成本低。綜上,利用木霉菌株防治石榴枯萎病的方案是可行的。根據(jù)文獻(xiàn)記載,木霉菌對(duì)黃瓜枯萎病[20]、香蕉枯萎病[21]、蔬菜土傳病害[22]等多種土傳真菌性病害均表現(xiàn)出很好的防治效果,說(shuō)明木霉菌對(duì)土傳真菌病害的抑制具有廣譜性,進(jìn)一步說(shuō)明了從22個(gè)供試木霉菌株中篩選抑菌率高的木霉菌株來(lái)防治石榴枯萎病是可行的。此外,木霉與化學(xué)農(nóng)藥協(xié)同防治蘋果輪紋病,[23]木霉菌與三唑酮混配對(duì)西瓜枯萎病的防效,[24]木霉菌與多菌靈協(xié)同防治灰霉病[25]等試驗(yàn)表明,菌-藥復(fù)配表現(xiàn)出明顯的增效作用,且降低了化學(xué)農(nóng)藥的用量。此次檢驗(yàn)抗藥性木霉菌株P(guān)J3抑菌率高于原始菌株,且本身的抗藥性可彌補(bǔ)木霉菌株缺乏抗藥能力的缺陷,保證其更好地發(fā)揮藥效。但抗藥性木霉菌株P(guān)J3與咪鮮胺、丙環(huán)唑、多菌靈3種農(nóng)藥復(fù)配是否具有協(xié)同增效作用,有待進(jìn)一步研究。因此,課題組后期將進(jìn)一步試驗(yàn)研究抗藥性木霉菌株P(guān)J3與咪鮮胺、丙環(huán)唑、多菌靈等3種化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配對(duì)石榴枯萎病菌的抑制作用。

    通過(guò)生物防治的方法來(lái)抑制石榴枯萎病菌,不僅能達(dá)到抗病增產(chǎn)的效果,減少化學(xué)農(nóng)藥的使用,還能減輕農(nóng)藥殘留。我國(guó)化學(xué)農(nóng)藥和肥料過(guò)度使用導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境受污染,耕地面積減少、質(zhì)量退化,農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留量高等現(xiàn)象較為嚴(yán)重,社會(huì)需要更多無(wú)毒無(wú)污染的生物農(nóng)藥來(lái)緩解這些問(wèn)題。木霉菌是較為廣譜且普遍存在的生防菌株,且可防治部分土傳真菌病害,[26]是當(dāng)前具有較大開發(fā)價(jià)值及潛力的生防菌株,且其對(duì)石榴枯萎病菌的防治作用篩選尚屬首次,有進(jìn)一步研發(fā)利用的價(jià)值。

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