抑制石榴枯萎病菌的化學(xué)農(nóng)藥和木霉菌株篩選

馬麗婷，魯海菊，羅玉端，胡 婕，李昱賢

（1.紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南蒙自 661199；2.蒙自海關(guān)綜合技術(shù)中心，云南蒙自 661199）

石榴（Punica granatum）是云南重要的經(jīng)濟(jì)林果之一。蒙自萬(wàn)畝石榴園享有“中國(guó)石榴之鄉(xiāng)”的美譽(yù)。近年來(lái)，由于石榴栽培越來(lái)越集中，樹齡越來(lái)越大，石榴病害日漸嚴(yán)重，石榴枯萎病是其中最嚴(yán)重且最難防的病害之一。石榴枯萎病是一種毀滅性土傳植物真菌病害，其病原菌是甘薯長(zhǎng)喙殼(Ceratocystis fimbriata)。[1,2]每年4—5月、8—9月為兩次發(fā)病高峰期，植株感病后葉片黃化、萎蔫，植株從根到主干木質(zhì)部橫切面變?yōu)楹稚?周后整個(gè)植株萎蔫死亡。[2-3]該病害在中國(guó)由劉云龍[2]等首次報(bào)道云南蒙自發(fā)生石榴枯萎病以來(lái)，日益加重，至今仍未找到有效的防治措施。根據(jù)文獻(xiàn)記載，2004年發(fā)病率上升至15.0%，經(jīng)濟(jì)損失達(dá)1500萬(wàn)以上。[4]且發(fā)生石榴枯萎病的石榴園再植健壯的石榴苗也很難成活，石榴枯萎病可導(dǎo)致整個(gè)果園的毀滅，[5]嚴(yán)重影響了蒙自石榴產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。目前許多學(xué)者針對(duì)石榴枯萎病進(jìn)行研究，據(jù)報(bào)道，毛忠順等研究26種化學(xué)農(nóng)藥對(duì)石榴枯萎病菌的抑制作用，認(rèn)為枯萎必克、倍得豐、萬(wàn)霉靈、大佳托、果病靈和20%三唑酮 6 種化學(xué)農(nóng)藥可作為田間防效研究的備選農(nóng)藥。[6]經(jīng)袁陽(yáng)等研究表明，氟菌·氟環(huán)唑-大蒜復(fù)配對(duì)石榴枯萎病有很好的防治效果。[5]諸多研究者對(duì)生防菌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[7]、公牛鏈霉菌(Streptomyces tauricus)[8]、萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）[1]、壯觀鏈霉菌（Streptomyces spectabilis）[9]均對(duì)石榴枯萎病菌有拮抗作用。大薊石油醚提取物，[10]木姜子乙醇提取物，[11]苦參、黃連、細(xì)辛、板藍(lán)根、蘆薈等的提取物，[12]枯草芽孢桿菌YZS-B15和HB菌株及熒光假單胞桿菌YZS-Ph02菌株[13]均對(duì)石榴枯萎病菌具有很好的抑制作用。

木霉（Trichodermaspp.）菌是一種普遍存在的真菌，是重要的生防因子。木霉菌通過(guò)分泌產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶類和次級(jí)代謝物、營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)等方式，進(jìn)行重寄生等作用，[14]拮抗其他植物病原菌。經(jīng)魯海菊等研究表明，枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株對(duì)枇杷根腐病病菌(Pestalotiopsissp.)、辣椒黃萎病病菌(Verticilliumdahliae.)、辣椒黑斑病病菌(Alternariasp.)、萬(wàn)壽菊葉斑病病菌(Alternariasp.)、康乃馨根腐病病菌(Fusariumsp.)和仙客來(lái)根腐病菌(Fusariumsp.)等6種植物病原菌有不同程度的抑菌作用。[15]綜上，木霉P3.9等菌株對(duì)石榴枯萎病菌是否有抑菌作用，值得我們?nèi)ヌ接?。石榴枯萎病危害面積不斷擴(kuò)大，至今仍然沒(méi)有明確有效地田間防治措施。由于化學(xué)農(nóng)藥易產(chǎn)生抗藥性，更新?lián)Q代較快，有必要篩選抑菌效果較好的新農(nóng)藥。此外，石榴枯萎病生物防治僅限于原核微生物及植物提取物，木霉是否對(duì)石榴枯萎病菌有抑制作用，至今未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本試驗(yàn)篩選抑制石榴枯萎病菌的化學(xué)農(nóng)藥和木霉菌株，為石榴枯萎病的田間防治提供有效的化學(xué)農(nóng)藥及生防菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

石榴枯萎病病原菌甘薯長(zhǎng)喙殼(Ceratocystis fimbriata)、木霉（Trichodermaspp.）菌株：J1、PJ1-1、PJ1-2、J2、PJ3、GD1、GM6、PZ1、抗氟硅唑PZ1、J3、抗三唑酮GD1、Y2、抗三唑酮Y2、抗三唑酮GM6、抗氟硅唑GM6、抗三唑酮PZ1、J5、PY2、J4、JD3、GD3、GD5，庫(kù)存于紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 供試化學(xué)農(nóng)藥

表1 供試化學(xué)農(nóng)藥相關(guān)信息

1.1.3 供試培養(yǎng)基

PDA：馬鈴薯 200 g、葡萄糖16 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1000 mL。以上培養(yǎng)基配好后在121℃高壓滅菌30分鐘。材料均購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)及試劑公司，試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 菌株的擴(kuò)繁

將庫(kù)存的供試菌株接種到PDA平板上，石榴枯萎病菌于25℃恒溫培養(yǎng)14d，木霉菌于25℃恒溫培養(yǎng)7d。用直徑5mm打孔器取菌塊備用。

1.2.2 測(cè)定不同化學(xué)農(nóng)藥對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率

采用菌絲生長(zhǎng)速率法，[5]將化學(xué)農(nóng)藥按照使用說(shuō)明的濃度加到PDA培養(yǎng)液中，搖勻后倒入滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿中備用。又將供試活化后的石榴枯萎病菌菌塊接種到含化學(xué)農(nóng)藥的培養(yǎng)基平板中央，以石榴枯萎病菌菌塊接種到不含化學(xué)農(nóng)藥的PDA培養(yǎng)基平板中央為對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)3次，28℃下恒溫培養(yǎng)7d后，用十字交叉法[5]測(cè)量菌落直徑，記錄菌落擴(kuò)展情況，并用以下公式計(jì)算抑菌率：抑菌率(%)=（對(duì)照菌落增長(zhǎng)直徑-含藥培養(yǎng)基上菌落增長(zhǎng)直徑）/對(duì)照增長(zhǎng)菌落直徑×100。

1.2.3 測(cè)定木霉菌株對(duì)石榴枯萎病菌的抑制率

采用對(duì)峙培養(yǎng)法，[15]將木霉菌塊與石榴枯萎病菌菌塊兩兩組合，接種到距離平板中央相等的兩個(gè)點(diǎn)上，以不接種木霉菌塊作為對(duì)照，重復(fù)3次，于28℃恒溫培養(yǎng)7d，測(cè)定菌落直徑，計(jì)算抑制率：抑菌率(%)=（對(duì)照菌落增長(zhǎng)直徑-含藥培養(yǎng)基上菌落增長(zhǎng)直徑）/對(duì)照增長(zhǎng)菌落直徑×100

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所得數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行匯總，計(jì)算平均值和作圖，所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用 SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件Duncan氏多重比較法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同化學(xué)農(nóng)藥對(duì)石榴枯萎病菌的抑制作用

由圖1可知，經(jīng)Duncana多重比較發(fā)現(xiàn)，咪鮮胺、丙環(huán)唑、多菌靈3種化學(xué)農(nóng)藥對(duì)石榴枯萎病菌菌落生長(zhǎng)差異不顯著，但與其余處理間的差異極顯著，病原菌菌落直徑為0.00mm，抑菌率達(dá)100%，抑制效果最好。甲基硫菌靈對(duì)石榴枯萎病菌生長(zhǎng)的影響與其余處理間差異極顯著，病原菌菌落直徑為7.00mm，抑菌率為63.79%。苯醚甲環(huán)唑、氟硅唑、三唑酮、百菌清4種化學(xué)農(nóng)藥抑菌率均小于50%。其中：氟硅唑和三唑酮抑菌差異不顯著，而苯醚甲環(huán)唑和百菌清抑菌差異極顯著。綜上，咪鮮胺、丙環(huán)唑和多菌靈可作為田間防治石榴枯萎病的首選化學(xué)農(nóng)藥。

圖1 不同化學(xué)農(nóng)藥對(duì)石榴枯萎病菌的抑制作用

2.2 不同木霉菌株對(duì)石榴枯萎病菌的抑制作用

由圖2可知，經(jīng)Duncana多重比較發(fā)現(xiàn)，PJ1-1、PJ1-2、J2和PJ3 4個(gè)木霉菌株對(duì)石榴枯萎病菌菌落生長(zhǎng)影響差異不顯著，但與其余菌株間的差異極顯著，病菌菌落直徑分別為8.83mm、9.00mm、8.67mm和8.83mm，抑菌率均達(dá)70%以上。J1木霉菌株對(duì)石榴枯萎病菌菌落生長(zhǎng)的影響，與PJ1-1、PJ1-2、J2、PJ3 4個(gè)菌株間的差異極顯著，病菌菌落直徑為7.67mm，抑菌率為76%，抑制效果最好。PZ1木霉菌株對(duì)石榴枯萎病菌菌落生長(zhǎng)的影響，與其余菌株間的差異極顯著，病菌菌落平均直徑為10.83mm，抑菌率為66%。GM6、抗氟硅唑PZ1和J3 3個(gè)菌株對(duì)病菌生長(zhǎng)影響差異不顯著，但與其余菌株間的差異極顯著，病菌菌落直徑分別為11.77mm、12.00mm和11.88mm，抑菌率為63%。GD1與其余菌株間的影響差異極顯著，病菌菌落直徑為12.5mm，抑菌率為61%。綜上，J1、PJ1-1、PJ1-2、J2、PJ3 5個(gè)木霉菌株對(duì)石榴枯萎病菌抑菌率70%以上，可作為開發(fā)生防菌劑的菌種資源。

圖2 抑菌率在60%以上木霉菌株對(duì)石榴枯萎病菌的抑制作用

由圖3可知，經(jīng)Duncana多重比較發(fā)現(xiàn)，Y2、抗三唑酮PZ1和J4 3個(gè)木霉菌株對(duì)石榴枯萎病菌菌落生長(zhǎng)的影響，與其余菌株差異極顯著，病菌菌落直徑分別為13.17mm、13.67mm和17.33mm，抑菌率分別為59%、57%和46%?？谷蛲猋2和抗三唑酮GM6 2個(gè)菌株對(duì)石榴枯萎病菌生長(zhǎng)的影響差異不顯著，但與其余菌株間的差異極顯著，病原菌菌落直徑分別為14.67mm、14.50mm，抑菌率為55%。J5和抗氟硅唑GM6對(duì)石榴枯萎病菌生長(zhǎng)的影響差異不顯著，但與其余菌株間的差異極顯著，病菌菌落直徑均為15.83mm，抑菌率為51%。JD3、GD3和GD5 3個(gè)菌株對(duì)石榴枯萎病菌生長(zhǎng)的影響差異不顯著，但與其余菌株間的差異極顯著，病菌菌落直徑分別為20.00mm、19.83mm和19.33mm，抑菌率在38%-40%之間。

圖3 抑菌率在60%以下木霉菌株對(duì)石榴枯萎病菌的抑制作用

3 討論

8種化學(xué)農(nóng)藥均對(duì)石榴枯萎病菌有抑制作用。其中：首先是咪鮮胺、丙環(huán)唑、多菌靈3種農(nóng)藥的抑菌效果最好，抑菌率高達(dá)100%，這與何平[16]等試驗(yàn)結(jié)果相符。其次是甲基硫菌靈，抑菌率為63.79%。苯醚甲環(huán)唑、氟硅唑、三唑酮、百菌清4種農(nóng)藥抑菌作用差且均小于50%。其中：多菌靈對(duì)石榴枯萎病菌室內(nèi)抑菌率為100%與毛忠順[5]等試驗(yàn)研究結(jié)果不一致，二者相差兩倍多。苯醚甲環(huán)唑抑制效果差與何平[16]試驗(yàn)結(jié)果一致。三唑酮和百菌清對(duì)石榴枯萎病抑制率低與毛忠順[5]等的試驗(yàn)結(jié)果，二者抑菌率相差四倍多，這可能病原菌發(fā)生突變、藥劑升級(jí)等原因有關(guān)。因此，在投入大田使用前應(yīng)做室內(nèi)抑菌率檢測(cè)。另外，根據(jù)張德勝等報(bào)載，苦參堿與甲基硫菌靈、百菌清和異菌脲混配使用對(duì)甘薯長(zhǎng)喙殼的抑制作用均優(yōu)于單獨(dú)使用。[17]今后，防治石榴枯萎病應(yīng)選擇使用混配劑。

22個(gè)木霉菌株均對(duì)石榴枯萎病菌具有抑菌作用。抑菌率在22%～76%之間。其中：效果最好的是J1、PJ1-1、PJ1-2、J2和PJ3 5個(gè)木霉菌株，抑菌率均達(dá)70%以上。根據(jù)魯海菊等研究，PJ1-1、PJ1-2、PJ3抗藥性木霉菌株對(duì)病原菌的抑菌率高于原始菌株，[18]其中：此次檢測(cè)PJ1-1、PJ1-2抑菌率與魯海菊等試驗(yàn)結(jié)果不一致，可能與菌株退化酶活性降低等原因有關(guān)。萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）[1]，板藍(lán)根、蘆薈的提取物[12]對(duì)石榴枯萎病菌的抑菌作用比此次檢驗(yàn)表現(xiàn)最好的木霉菌株低5%-20%?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)[7]、公牛鏈霉菌(Streptomyces tauricus)[8]、壯觀鏈霉菌（Streptomyces spectabilis）[9]、大薊石油醚提取物[10]，木姜子乙醇提取物，[11]苦參、黃連、細(xì)辛的提取物，[12]枯草芽孢桿菌菌株YZS-B15 和HB 及熒光假單胞桿菌菌株YZS-Ph02[13]對(duì)石榴枯萎病菌的抑制率比此次檢驗(yàn)表現(xiàn)最好的木霉菌株高5%-30%。但是，木霉菌和病原菌的相互作用機(jī)制在分子水平上有明顯的優(yōu)勢(shì)，木霉菌具有延遲干旱脅迫和抵御病原菌侵害等功能，[19]提高農(nóng)作物的抗逆性。同時(shí)，木霉菌及其代謝產(chǎn)物還能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增加植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量，而且其廣泛存在于大自然，取材方便，成本低。綜上，利用木霉菌株防治石榴枯萎病的方案是可行的。根據(jù)文獻(xiàn)記載，木霉菌對(duì)黃瓜枯萎病[20]、香蕉枯萎病[21]、蔬菜土傳病害[22]等多種土傳真菌性病害均表現(xiàn)出很好的防治效果，說(shuō)明木霉菌對(duì)土傳真菌病害的抑制具有廣譜性，進(jìn)一步說(shuō)明了從22個(gè)供試木霉菌株中篩選抑菌率高的木霉菌株來(lái)防治石榴枯萎病是可行的。此外，木霉與化學(xué)農(nóng)藥協(xié)同防治蘋果輪紋病，[23]木霉菌與三唑酮混配對(duì)西瓜枯萎病的防效，[24]木霉菌與多菌靈協(xié)同防治灰霉病[25]等試驗(yàn)表明，菌-藥復(fù)配表現(xiàn)出明顯的增效作用，且降低了化學(xué)農(nóng)藥的用量。此次檢驗(yàn)抗藥性木霉菌株P(guān)J3抑菌率高于原始菌株，且本身的抗藥性可彌補(bǔ)木霉菌株缺乏抗藥能力的缺陷，保證其更好地發(fā)揮藥效。但抗藥性木霉菌株P(guān)J3與咪鮮胺、丙環(huán)唑、多菌靈3種農(nóng)藥復(fù)配是否具有協(xié)同增效作用，有待進(jìn)一步研究。因此，課題組后期將進(jìn)一步試驗(yàn)研究抗藥性木霉菌株P(guān)J3與咪鮮胺、丙環(huán)唑、多菌靈等3種化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配對(duì)石榴枯萎病菌的抑制作用。

通過(guò)生物防治的方法來(lái)抑制石榴枯萎病菌，不僅能達(dá)到抗病增產(chǎn)的效果，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，還能減輕農(nóng)藥殘留。我國(guó)化學(xué)農(nóng)藥和肥料過(guò)度使用導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境受污染，耕地面積減少、質(zhì)量退化，農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留量高等現(xiàn)象較為嚴(yán)重，社會(huì)需要更多無(wú)毒無(wú)污染的生物農(nóng)藥來(lái)緩解這些問(wèn)題。木霉菌是較為廣譜且普遍存在的生防菌株，且可防治部分土傳真菌病害，[26]是當(dāng)前具有較大開發(fā)價(jià)值及潛力的生防菌株，且其對(duì)石榴枯萎病菌的防治作用篩選尚屬首次，有進(jìn)一步研發(fā)利用的價(jià)值。