基于色度原理分析安息香顏色與化學(xué)成分的相關(guān)性

謝 巧，廖 莉，栗圣榕，郭曉慶，王 建，車 靜，夏厚林

（成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137）

顏色是藥材經(jīng)驗(yàn)鑒別、質(zhì)量評(píng)價(jià)的常用指標(biāo)，然而人眼對(duì)顏色的判定往往受主觀因素的影響，缺乏客觀、可量化的標(biāo)準(zhǔn)［1］。近年來，分光測(cè)色儀逐漸應(yīng)用到中藥顏色測(cè)定中［2］，可快速測(cè)定藥材粉末、提取液的色度值，但不適用于中藥材、中藥飲片等形態(tài)非均勻性樣品的顏色測(cè)定［3］。顏色特征參數(shù)一定程度上彌補(bǔ)了測(cè)色儀的局限性，其通過計(jì)算機(jī)圖像處理技術(shù)對(duì)圖像分析加工，從而將藥材顏色客觀量化［4-5］。此外，研究表明，藥材顏色與化學(xué)成分含有量密切相關(guān)，如防風(fēng)［2］、龍膽［3］、西紅花［6］、大黃［7］等藥材的顏色與內(nèi)在成分含有量具有顯著相關(guān)性。

安息香具有開竅醒神、行氣活血、止痛的功效，常用于治療中風(fēng)痰厥、氣郁暴厥、中惡昏迷、產(chǎn)后血暈等癥［8］。現(xiàn)代藥理研究表明其具有腦保護(hù)［9］、抗炎解熱［10-11］以及促進(jìn)雌激素合成［12］等作用。安息香主要含有香脂酸類、木脂素類、三萜類等成分。香脂酸類是安息香發(fā)揮芳香開竅作用的活性成分［13］，主要為苯甲酸及其酯類，苯甲酸為香脂酸類的代表成分，2015 版《中國藥典》將其作為安息香的定性鑒別和含有量測(cè)定指標(biāo)。苯甲酸松柏酯為安息香中重要的香脂酸類成分，含有量為3.30%～66.75%［14］，具有促進(jìn)血腦屏障通透性、開竅醒神、抗內(nèi)毒素等作用，是安息香的藥效活性成分［13，15］。

安息香表面、斷面顏色是評(píng)價(jià)其品質(zhì)最直觀的指標(biāo)，在經(jīng)驗(yàn)鑒別中常稱為“斷面白”。本研究引入現(xiàn)代色度原理，用顏色特征參數(shù)L、a、b 值表征安息香的表面顏色，采用分光測(cè)色儀測(cè)定安息香斷面粉末的L*、a*、b*值，用HPLC 法測(cè)定苯甲酸、苯甲酸松柏酯的含有量，探討安息香表面、斷面的色度值和苯甲酸、苯甲酸松柏酯含有量的相關(guān)性，以期為安息香的質(zhì)量控制及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 18 批安息香樣品均購自成都市荷花池中藥材市場(chǎng)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室盧先明教授鑒定S1～S16 為安息香科植物Styrax tonkinensis（Pierre）Craib ex Hart 的干燥樹脂（藥典品種，商品名為泰國安息香），S17～S18 為安息香科植物Styrax ChineseHu et S.Y.Liang 的干燥樹脂（中華安息香）。

1.2 試劑與藥物 甲醇、乙腈（色譜純，美國Fisher 公司）；甲酸（分析純，成都市科龍化工試劑廠）；其余試劑均為分析純。

苯甲酸松柏酯對(duì)照品（實(shí)驗(yàn)室自制，純度＞98%）；苯甲酸對(duì)照品（成都克洛瑪生物科技有限公司，批號(hào)CHB180305，純度＞98%）。

1.3 儀器 Agilent1200 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；KQ-600DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XP205 電子分析天平（梅特勒-托利多上海儀器公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市宇翔儀器有限公司）；CM-5 型分光測(cè)色儀（日本柯尼卡美能達(dá)公司）；ZEISS 全自動(dòng)立體顯微鏡SteREO Discovery.V12（德國卡爾蔡司公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 傳統(tǒng)性狀觀察 在日光下以肉眼觀察18 批安息香表面及斷面顏色，結(jié)果見表1。18 批樣品表面多為黃棕色，斷面呈象牙白，與2015 年版《中國藥典》一部對(duì)安息香的性狀描述相符，部分樣品表面呈棕黑色，斷面有黃心。

2.2 表面色度值測(cè)定 采用全自動(dòng)立體顯微鏡采集安息香藥材的表面圖像。將安息香樣品放在固定圓形平臺(tái)上，將LED 冷光源顏色調(diào)整為6 000k（正白），Light 值為42，采用ZEN 2 pro 軟件多維采集安息香樣品圖像，保存為jpg 格式，使用Photoshop 軟件處理圖像，從各個(gè)顏色的直方圖中采集安息香表面的顏色特征參數(shù)L、a、b 值。每份樣品隨機(jī)采集3 次，記錄各參數(shù)的平均值，結(jié)果見表1。

2.3 斷面色度值測(cè)定

2.3.1 樣品前處理 將安息香刮去氧化表面，粉碎，過3 號(hào)篩，混勻，供安息香斷面色度值測(cè)定。

2.3.2 測(cè)定方法 取樣品斷面粉末約2 g，均勻平鋪在測(cè)色皿底部，測(cè)定條件為光源D65、視場(chǎng)10°、視角孔徑30 mm、起止波長360～740 nm、模式SCE（排除鏡面反射），儀器黑白板校正后測(cè)定。重復(fù)測(cè)定3 次，記錄L*、a*、b*平均值。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品S1 的斷面粉末，依法測(cè)定，平行測(cè)定6 份。L*、a*、b*值的RSD 分別為0.12%、0.48%、0.18%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品S1 的斷面粉末，依法于0、1、2、3、4、5、6 h 測(cè)定。L*、a*、b*值RSD 分別為0.17%、0.47%、0.26%，表明樣品在6 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 樣品測(cè)定 依法測(cè)定18 批樣品斷面粉末的L*、a*、b*值。結(jié)果見表1。

2.4 含有量測(cè)定

2.4.1 苯甲酸 參照2015 年版《中國藥典》一部安息香項(xiàng)下苯甲酸含有量測(cè)定方法測(cè)定18 批樣品中苯甲酸的含有量，結(jié)果見表1。

2.4.2 苯甲酸松柏酯 參照課題組建立的苯甲酸松柏酯含有量測(cè)定方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)［14］。

2.4.2.1 色譜條件 InertSustain C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-水-甲酸；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長268 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.4.2.2 供試品溶液制備 取安息香藥材，粉碎，過3 號(hào)篩，取粉末0.1 g，精密稱定，精密加入甲醇20 mL，超聲提取30 min，放冷，補(bǔ)足減失質(zhì)量，濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液1 mL 定容至50 mL，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.4.2.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱定苯甲酸松柏酯對(duì)照品5.16 mg，置于5 mL 棕色量瓶中，加入甲醇定容至刻度，制得質(zhì)量濃度為1.032 mg/mL對(duì)照品貯備液。

2.4.2.4 線性關(guān)系考察 取苯甲酸松柏酯對(duì)照品貯備液，稀釋成質(zhì)量濃度分別為5、10、20、50、100、200、500 μg/mL 的對(duì)照品溶液，在“2.4.2.1”項(xiàng)條件下測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行回歸得方程Y＝67.581X+134.91（r＝1.000 0），表明苯甲酸松柏酯在3.98～499.45 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2.5 樣品含有量測(cè)定 精密吸取各供試品溶液20 μL，在“2.4.2.1”項(xiàng)條件下測(cè)定峰面積，平行測(cè)定3 次。18 批樣品苯甲酸松柏酯含有量測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 安息香色度值及各成分含有量（n=3）Tab.1 Benzoin color value and content determination of various constituents（n=3）

2.5 相關(guān)性分析 采用SPSS 22.0 軟件對(duì)色度值和苯甲酸、苯甲酸松柏酯含有量進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，均符合正態(tài)分布，故采用Pearson 相關(guān)性分析，結(jié)果見表2。

表2 色度值與各成分含有量的相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis between chromaticity value and content determination of various constituents

2.6 成分含有量-色度值回歸方程建立 以色度值為自變量，苯甲酸、苯甲酸松柏酯含有量為因變量，采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行回歸分析，建立成分含有量-色度值的回歸方程，結(jié)果見表3～5。

3 分析與討論

顏色特征參數(shù)Lab 模式與測(cè)色儀L*a*b*模式均是在國際照明委員會(huì)（CIE）制定的顏色度量國際標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上建立的（L 為亮度，a 為紅-綠色軸，b 為黃-藍(lán)色軸）［3］，2 種方法均可快速將藥材顏色客觀量化，具有一定實(shí)用性。安息香表面顏色較均勻，采用樣品表面圖片提取顏色特征參數(shù)Lab 來體現(xiàn)安息香表面整體特征，重現(xiàn)性良好。由于部分安息香樣品斷面呈現(xiàn)不均勻黃心，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中多次測(cè)定斷面的顏色特征參數(shù)結(jié)果差異較大，不能準(zhǔn)確反映安息香的斷面顏色，因此將安息香刮去氧化表面、粉碎并混勻，用測(cè)色儀測(cè)定安息香斷面色度值L*a*b*可兼顧安息香斷面和內(nèi)部顏色，經(jīng)系統(tǒng)適應(yīng)性考察該方法可行。

表3 各成分含有量-色度值回歸分析結(jié)果Tab.3 Results of content determination of various consti tuents-chromaticity value regression coefficient

表4 方差分析Tab.4 Analysis of variance

表5 各成分含有量與色度值線性關(guān)系Tab.5 Linear relationships of various constituents and chromaticity value

傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別認(rèn)為安息香以“表面黃棕色、斷面象牙白”為優(yōu)［16］，本研究結(jié)果顯示，當(dāng)安息香表面為黃白色至黃棕色、斷面為象牙白時(shí)，苯甲酸、苯甲酸松柏酯含有量較高；當(dāng)表面為棕黑色、斷面多黃心時(shí)，苯甲酸、苯甲酸松柏酯含有量低，質(zhì)量較差。結(jié)合外觀性狀及色度值可知，安息香表面、斷面顏色與苯甲酸、苯甲酸松柏酯含有量具有一定相關(guān)性。本研究收集的中華安息香批次較少，未能充分闡明泰國安息香與中華安息香的區(qū)別，還需加大樣本量為不同品種安息香的定性鑒別提供依據(jù)。

由相關(guān)性分析可知，苯甲酸含有量與安息香表面a 值呈正相關(guān)，與表面L、b 值無相關(guān)性；苯甲酸含有量與安息香斷面L*值呈正相關(guān)，與斷面a*、b*值無相關(guān)性，即表面a 值、斷面L*值越大，苯甲酸含有量越高。苯甲酸松柏酯含有量與安息香表面L 值呈正相關(guān)，與表面a、b 值無相關(guān)性；苯甲酸松柏酯含有量與安息香斷面L*值呈正相關(guān)，與b*值呈負(fù)相關(guān)，與a*值無相關(guān)性，即表面L值、斷面L*值越大，斷面b*值越小，苯甲酸松柏酯含有量越高。由回歸分析可知，安息香表面、斷面顏色受苯甲酸松柏酯含有量的影響大于苯甲酸。由方差分析結(jié)果可知，本研究建立的成分含有量-色度值的-回歸方程具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可通過安息香表面、斷面色度值快速預(yù)測(cè)苯甲酸、苯甲酸松柏酯含有量。

本研究可為安息香“表面黃棕色，斷面象牙白”的經(jīng)驗(yàn)鑒別提供依據(jù)，以期為安息香藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)與質(zhì)量控制提供參考，但其有效性還需在今后工作中加大樣本量進(jìn)一步研究。