右美托咪定對老年患者單肺通氣相關(guān)肺損傷時(shí)NLRP3/Caspase-1通路的影響

王 磊，白艷輝，丁彥玲，馮 偉，王 蘭，高 璐

(1.保定市第一中心醫(yī)院 麻醉科,河北 保定 071000；2.保定市第一中心醫(yī)院 藥劑科,河北 保定 071000；3.保定市第一中心醫(yī)院 胸外科,河北 保定 071000)

隨著老齡化程度的不斷加重，行胸科手術(shù)治療的老年患者人數(shù)亦隨之增加，胸科手術(shù)往往需要單肺通氣，但此操作會(huì)造成肺內(nèi)分流、通氣/血流比例失調(diào)以及肺復(fù)張后因氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)還會(huì)造成肺損傷[1-3]。而老年患者隨年齡增長，自身各系統(tǒng)、器官功能均已發(fā)生退行性改變[4]，這些因素給圍術(shù)期管理更是帶來極大挑戰(zhàn)。NOD樣受體蛋白3(NLRP3)炎性小體由NLRP3、接頭蛋白ASC和胱冬肽酶-1(Caspase-1)構(gòu)成，在機(jī)體免疫反應(yīng)和疾病發(fā)生過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[5-6]。NLRP3/Caspase-1信號通路的激活可參與機(jī)體多種生理病理過程，但過度激活則會(huì)導(dǎo)致嗜中性粒細(xì)胞的大量聚集，造成炎癥相關(guān)的組織損傷[7]。右美托咪定作為α2受體激動(dòng)劑，可減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)組織器官功能[8-10]。故本研究以NLRP3/Caspase-1信號通路為切入點(diǎn)，以行單肺通氣老年患者為觀察對象，擬探討NLRP3/Caspase-1信號通路在右美托咪定減輕單肺通氣所致肺損傷的影響，為老年患者行胸科手術(shù)提供臨床參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號：2019-011)，并與患者或其家屬簽署知情同意書。選擇擬行擇期胸科手術(shù)患者64例，性別不限，年齡65～80歲，體重指數(shù)<30 kg/m2，ASA分級Ⅱ級或Ⅲ級，所有患者均無嚴(yán)重心腦血管疾病，無慢性阻塞性或限制性肺病，用力肺活量>80%預(yù)計(jì)值，第一秒呼氣率>70%預(yù)計(jì)值，預(yù)計(jì)手術(shù)時(shí)間≤4 h。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組(C組)和右美托咪定組(D組)，各32例。

1.2 麻醉方法 患者均無術(shù)前麻醉用藥，入室后常規(guī)面罩吸純氧2 L/min，監(jiān)測MAP、HR、ECG、SpO2和腦電雙頻指數(shù)(BIS)，建立外周靜脈通路，輸注復(fù)方氯化鈉注射液8 mL/(kg·h)。對側(cè)肘靜脈留置靜脈套管備靜脈采樣，局麻下橈動(dòng)脈穿刺行持續(xù)有創(chuàng)動(dòng)脈血壓監(jiān)測。參照文獻(xiàn)并結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)[11]，D組于麻醉誘導(dǎo)前15min，靜脈持續(xù)泵入右美托咪定(批號：H20183219，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司)負(fù)荷量0.5μg/kg，繼以0.3 mL/(kg·h)的速率持續(xù)泵入至術(shù)畢前30 min，C組給與等容量的生理鹽水。兩組麻醉誘導(dǎo)均采用靜脈注射咪達(dá)唑侖0.04 mg/kg、舒芬太尼0.5 μg/kg、異丙酚2.0 mg/kg、順阿曲庫銨0.15 mg/kg，誘導(dǎo)平穩(wěn)后經(jīng)口順利插入雙腔支氣管導(dǎo)管(根據(jù)年齡、身高預(yù)測雙腔管大小，氣管內(nèi)徑值=0.032×年齡(歲)+0.072×身高(cm)-2.043。根據(jù)性別、身高預(yù)測置管深度，男性置管深度(cm)=0.11×身高(cm)+10.53；女性置管深度(cm)=0.11×身高(cm)+10.94)，纖維支氣管鏡輔助確定氣管導(dǎo)管位置良好后，接麻醉機(jī)行機(jī)械通氣，設(shè)置潮氣量為8 mL/kg，通氣頻率12次/min，吸呼比1∶2，PEEP為0 cm H2O，吸入氧濃度50%，氧流量1.0 L/min，維持PETCO2分壓35～45 mmHg。麻醉維持以吸入1.5%～2.0%七氟醚(麻醉深度在1.0 MAC)為主，間斷靜脈注射順阿曲庫銨5 mg維持肌松，舒芬太尼5～10 μg，維持BIS值45～60，MAP、HR波動(dòng)幅度不超過基礎(chǔ)值的20%。OLV時(shí)潮氣量為6 mL/kg，通氣頻率調(diào)整為12～15次/min，吸入氧濃度100%，PEEP為3cmH2O，其它通氣參數(shù)維持不變。若術(shù)中發(fā)生低氧血癥(SpO2<90%時(shí)間長于3 min)時(shí)，經(jīng)纖維支氣管鏡再次確認(rèn)雙腔氣管導(dǎo)管位置及吸痰、實(shí)施正壓通氣等措施仍無效者，退出本研究并改為其它方法改善患者氧合狀態(tài)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 記錄患者年齡、性別、體重指數(shù)、ASA分級等一般情況，記錄手術(shù)時(shí)間、OLV時(shí)間等術(shù)中情況。

1.3.2 于麻醉誘導(dǎo)前15 min(T0)、OLV 30 min(T1)、OLV 90 min(T2)、恢復(fù)雙肺通氣即刻(T3)分別采集橈動(dòng)脈血2mL，利用血?dú)夥治鰞x(型號為ABL80，丹麥)計(jì)算OI=PaO2/FiO2，于T1-3計(jì)算Cdyn=VT/(Pmax-PEEP)。

1.3.3 ELISA檢測 于T0-3時(shí)抽取外周靜脈血，參照試劑說明，以1 000×g離心1 5min分離血清置于-80 ℃冰箱保存待測，采用ELISA檢測IL-1β、IL-18和SP-A濃度(試劑盒由Becton Dickinson公司提供)。操作過程嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。

1.3.4 qRT-PCR檢測 于T0-3采集標(biāo)本后用Ficoll分層液法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，加入Trizol試劑(購自Invitrogen公司)裂解細(xì)胞充分振蕩裂解后提取總RNA，選擇OD260/280值在1.6～2.0之間的總RNA標(biāo)本，加RNasin后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?μg RNA作為模板用于cDNA的合成，反應(yīng)體系20μL，反應(yīng)條件37℃ 60min，95℃ 5min，所得cDNA于-20℃保存。具體流程按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海生工生物工程有限公司)說明書進(jìn)行。引物的設(shè)計(jì)合成(由上海生工生物工程有限公司完成)見表1。采用PCR試劑盒(上海生工生物工程有限公司)進(jìn)行real-time PCR，反應(yīng)體系為20μL，包括2 × real time PCR緩沖液10μL，上、下游引物各0.4μL，cDNA模板2μL，DEPC水補(bǔ)足致20μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，93℃變性20s，56℃退火20s，75℃延伸30s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本做2個(gè)復(fù)孔，以GAPDH為內(nèi)參照基因，采用Image-pro plus 6.0軟件(Media Cybernetics)進(jìn)行分析，以積分光密度值反映目的基因表達(dá)，用2-△△Ct(△△Ct=D組平均△Ct-C組平均△Ct)計(jì)算表達(dá)差異的倍數(shù)。用2-△△Ct表示目的基因相對表達(dá)量。

表1 基因擴(kuò)增引物序列

2 結(jié)果

2.1 兩組老年患者一般情況及術(shù)中各項(xiàng)指標(biāo)比較 兩組老年患者的性別構(gòu)成、年齡、BMI、ASA分級、手術(shù)時(shí)間和OLV時(shí)間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 兩組老年患者一般情況和術(shù)中各項(xiàng)指標(biāo)比較(n=32)

2.2 兩組老年患者不同時(shí)間點(diǎn)OI和Cdyn的比較 與同組T0比較，老年患者在T1-3時(shí)OI降低(P<0.05)；與C組比較，D組老年患者在T1-3時(shí)OI、Cdyn升高(P<0.05，見表3)。

表3 兩組老年患者不同時(shí)間點(diǎn)OI和Cdyn的比較

2.3 兩組老年患者不同時(shí)間點(diǎn)IL-1β、IL-18、SP-A濃度比較 與同組T0比較，老年患者在T1-3時(shí)外周血IL-1β、IL-18、SP-A濃度上升(P<0.05)；與C組比較，D組老年患者在T1-3時(shí)外周血IL-1β、IL-18、SP-A濃度下降(P<0.05，見表4)。

表4 兩組老年患者不同時(shí)間點(diǎn)IL-1β、IL-18、SP-A濃度比較

2.4 兩組老年患者不同時(shí)間點(diǎn)NLRP3 mRNA 與Caspase-1 mRNA表達(dá)比較 與同組T0比較，老年患者在T1-3時(shí)NLRP3 mRNA 和Caspase-1 mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；與C組比較，D組老年患者在T1-3時(shí)NLRP3 mRNA 和Caspase-1 mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05，見表5)。

表5 兩組老年患者不同時(shí)間點(diǎn)NLRP3 mRNA 與Caspase-1 mRNA表達(dá)比較

3 討論

NLRP3炎性小體由于能被多種類型的病原體或危險(xiǎn)信號所激活，故作為固有免疫的重要組分在機(jī)體免疫反應(yīng)和疾病發(fā)生過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[5-6]。正常狀態(tài)下胞內(nèi)NLRP3的表達(dá)量極低，不能用于組裝或活化NLRP3炎性小體，只能保持不活躍但有應(yīng)答的泛素化狀態(tài)。在一定條件下被激活后，便會(huì)誘發(fā)下游通路炎性因子(如IL-1β和IL-18)釋放來調(diào)整機(jī)體炎癥反應(yīng)。雖然NLRP3炎性小體的激活有助于宿主抵御入侵的病原微生物及內(nèi)源性危險(xiǎn)信號，但過度激活則會(huì)導(dǎo)致嗜中性粒細(xì)胞的大量聚集，造成炎癥相關(guān)的組織損傷。劉振寧等[7]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，百草枯中毒所致急性肺損傷模型中，大鼠肺組織中NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高，肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-18濃度明顯上升，證明激活的NLRP3/Caspase-1信號通路參與其中。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)手術(shù)需要在將患者轉(zhuǎn)為單肺通氣后，以及手術(shù)操作完成后再轉(zhuǎn)為雙肺通氣后，因通氣側(cè)肺機(jī)械性損傷、高灌注性損傷及非通氣側(cè)肺復(fù)張性損傷、缺血再灌注損傷，T1-3時(shí)發(fā)現(xiàn)外周血IL-1β、IL-18、SP-A濃度升高，單核細(xì)胞中的NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA表達(dá)上調(diào)，提示NLRP3/Caspase-1通路參與了單肺通氣所致的肺損傷。

右美托咪定作為α2受體激動(dòng)劑，可減輕炎癥反應(yīng)，減輕單肺通氣造成的肺損傷[12-13]。本研究觀察兩組老年患者在單肺通氣時(shí)，D組較C組T1-3時(shí)氧合指數(shù)和肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性升高(P<0.05)，SP-A濃度降低(P<0.05)，提示右美托咪定可改善單肺通氣期氧合及肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性，減輕肺損傷。李靈豐等[14]實(shí)驗(yàn)證實(shí)右美托咪定通過抑制大鼠NLRP3炎癥小體的激活，可降低炎性反應(yīng)，減輕胸部撞擊-失血性休克復(fù)蘇所致的急性肺損傷。在體外高氧處理的RAW264.7細(xì)胞和體內(nèi)制作高氧血癥所致急性肺損傷模型中發(fā)現(xiàn)，右美托咪定通過抑制NLRP3炎性小體的激活，可改善高氧血癥引起的急性肺損傷[15]。本研究發(fā)現(xiàn)D組較C組在T1-3時(shí)炎性因子IL-1β、IL-18濃度降低(P<0.05)，T1-3時(shí)外周血單核細(xì)胞中的NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，提示NLRP3/Caspase-1信號通路的下調(diào)參與了右美托咪定減輕單肺通氣所致的炎性反應(yīng)。但本研究不足之處：樣本量較少且為單中心試驗(yàn)，存在一定的臨床局限性，其結(jié)果的普遍性還需多中心、大樣本的臨床試驗(yàn)進(jìn)一步論證。

綜上所述，行胸科手術(shù)的老年患者在圍術(shù)期應(yīng)用右美托咪定，可改善術(shù)中氧合及肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性，降低炎性因子，減輕炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與右美托咪定下調(diào)NLRP3/Caspase-1信號通路有關(guān)。