血漿miR-4728-3p與高甘油三酯血癥的相關(guān)性研究

張 意，周時高，王興榮，陸偉蘭，熊 漫，王 淼

(1.上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院 中醫(yī)經(jīng)典病房，上海 徐匯 200032；2.上海市金山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 內(nèi)科，上海 金山 200082)

肥胖(Obesity)、2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)以及非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)均是與生活方式密切相關(guān)的內(nèi)分泌代謝疾病，三者之間關(guān)系密切。脂代謝異常是三者之間的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。而脂代謝相關(guān)指標，如血漿甘油三酯(Triglyceride,TG)可作為一種簡單有效的方法用來評估T2DM、NAFLD以及心血管疾病等內(nèi)分泌代謝性相關(guān)疾病的發(fā)病風險[1]。

MicroRNA是一類內(nèi)源性的非編碼小RNA分子，可以通過與靶基因miRNA堿基配對引導沉默復合體抑制miRNA的翻譯或直接降解miRNA，從而沉默編碼基因的表達。研究表明，miRNA在許多疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，起著重要的調(diào)節(jié)作用。miRNA可以通過調(diào)控細胞的分化、增殖和程序性死亡等多種生理病理過程來影響癌癥的發(fā)生與發(fā)展[2-3]。miRNA也可以通過調(diào)控機體的炎癥、氧化應激以及自噬等多種通路途徑來調(diào)節(jié)其脂肪細胞分化情況和糖脂代謝水平[4-5]。調(diào)查顯示，人體血漿中的miRNA譜與其它組織器官存在著顯著的表達差異，這提示了組織細胞會選擇性的分泌釋放部分miRNA參與機體代謝的調(diào)節(jié)[6]。由于miRNA在調(diào)節(jié)脂肪組織的分布及代謝功能中起著重要的作用[7]，因此，循環(huán)miRNA就可能成為診斷和治療肥胖及其相關(guān)疾病潛在的治療靶點和生物標記物[8]。本研究中，我們應用了miRNA芯片和定量RT-PCR的檢測方法，比較了高甘油三酯血癥患者和健康對照組人群血漿miRNA的表達差異，篩選出可能作為高甘油三酯血癥的診斷標志物以及作為肥胖、非酒精性脂肪性肝病等脂代謝異常疾病的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2016年12月至我院體檢的高甘油三酯血癥患者137例及健康對照人群161例納入研究。高甘油三酯血癥組：男52例，女85例；年齡38～73歲，平均年齡(41.1±10.2)歲。健康對照組：男64例，女97例；年齡35～74歲，平均年齡(39.3±10.6)歲。兩組一般資料納入統(tǒng)計學軟件進行對比，組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本試驗的開展已通過上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院倫理委員會的審批。

納入標準：①年齡40～75歲，患者及家屬均充分了解本次研究內(nèi)容，并簽訂相關(guān)知情同意書；②高甘油三酯血癥組的診斷參照2016年中華醫(yī)學會發(fā)布的《中國成年人血脂異常防治指南》，即TG≥1.7 mmol/L；③健康對照組患者的血脂屬于正常范圍。

排除標準：膽囊疾病、腎臟疾病、精神疾病、認知障礙、交流障礙、血液疾病、免疫性疾病等；1月內(nèi)有酗酒以及過度吸煙、因用藥導致血脂水平異常升高的患者。

1.2 血漿分離和miRNA抽提 每例患者收集 EDTA抗凝全血5 mL，靜置15 min后于4℃ 1620 g的條件下離心15 min，取上清至無菌無RNase的離心管中即為血漿樣本。

血漿miRNA的提取使用mirVana PARIS試劑盒(Ambion，US)，按照試劑盒說明書提供的標準操作流程進行樣品的total RNA抽提，抽提所得經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent technologies，Santa Clara，US)電泳質(zhì)檢合格后備用。

1.3 芯片實驗 miRNA芯片使用的是Agilent Human miRNA(8*60K)V21.0芯片，miRNA數(shù)據(jù)庫來源于Sanger microRNA數(shù)據(jù)庫(miRbase)21.0版本，覆蓋了2549個人類相關(guān)的miRNAs。

樣品RNA采用Agilent miRNA芯片配套提供的試劑盒miRNA Complete Labeling and Hyb Kit (Agilent technologies，Santa Clara，US)，按照標準操作流程的標記部分對樣品中的miRNA分子進行雜交實驗。樣品在滾動雜交爐中滾動雜交20 h，雜交完成后在洗缸中洗片，洗片所用的試劑為Gene Expression Wash Buffer Kit(Agilent technologies，Santa Clara，US)。芯片結(jié)果采用Agilent Microarray Scanner進行掃描，用Feature Extraction software 10.7.1.1讀取數(shù)據(jù)，最后采用Gene Spring Software 12.6進行歸一化處理，所用的算法為Quantile。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄和RT-PCR miRNA的逆轉(zhuǎn)錄選用miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(TIANGEN，Beijing，China)，RT-PCR選用miRcute Plus miRNA qPCR Kit miRNA熒光定量檢測試劑盒(TIANGEN，Beijing，China)將稀釋引物至10μM，稀釋探針至5μM，以U6作為內(nèi)參照，目的基因和參照基因每個組各設(shè)至少兩個復孔，按照試劑盒說明書提供的標準操作流程進行操作實驗，用ABI Step One Plus Real-Time PCR System進行融解曲線分析(Melting/Dissociation Curve Analysis)。PCR反應條件：95 ℃預變性15min，94 ℃變性20 s，60 ℃退火34 s，40～45個循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料分析 本研究共納入高甘油三酯血癥患者137例及健康對照人群161例。比較兩組研究對象之間年齡、性別分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而高甘油三酯血癥組(Hypertriglyceridemia，HTC)血漿甘油三酯高于健康對照組(Normal triglyceride，NTC)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

表1 298例臨床樣本資料分析

2.2 miRNA芯片實驗 分別選取高甘油三酯血癥患者及健康對照人群血漿樣本各3例進行miRNA芯片實驗。通過對芯片結(jié)果的比較和分析，計算樣本之間的相關(guān)系數(shù)。樣品相關(guān)系數(shù)圖顯示兩組研究對象之間的基因表達存在顯著差異(見圖1A)。原始數(shù)據(jù)通過Gene Spring Software軟件進行歸一化，得到的差異基因散點圖同樣顯示兩組間存在表達顯著差異的基因位點(見圖1B)。最終，采用表達差異倍數(shù)(Fold change)以及t檢驗的統(tǒng)計學方法對差異基因進行篩選，選出12個有顯著差異的miRNAs，詳見表2。

表2 miRNA芯片表達差異分析

A：miRNA芯片實驗樣品相關(guān)性系數(shù)圖，表示樣品基因之間的表達關(guān)系及差異情況；N：健康對照組；H：高甘油三酯血癥組；B：差異基因散點圖，落在圖形中位線兩側(cè)45°線之外的點，代表這個探針點在兩張芯片中信號值差異fold change>2，g1：健康對照組，g2：高甘油三酯血癥組。圖1 miRNA芯片實驗樣品相關(guān)性系數(shù)圖和差異基因散點圖

2.3 RT-PCR 根據(jù)miRNA芯片實驗結(jié)果，設(shè)計相應的探針及特異性擴增引物，本研究選用U6作為內(nèi)參基因。miRNAs的特異性引物由上海閃晶分子生物科技有限公司合成，引物序列見表3。

表3 RT-PCR引物序列

在全部298例臨床樣本中針對miRNA芯片篩選出的12個候選miRNAs采用RT-PCR的方法進行驗證。結(jié)果顯示，與健康對照人群相比，高甘油三酯血癥患者血漿hsa-miR-4728-3p表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而包括miR-6716-5p、miR-193b-5p、miR-7855-5p、miR-30c-2-3p、miR-4508、miR-3187-3p、miR-5584-5p、miR-198、miR-6774-5p、miR-151b、miR-6891-3p在內(nèi)的其余11個miRNAs在兩組之間血漿表達水平無明顯差異(P>0.05，見圖2)。

圖2 miRNA血漿表達水平差異

3 討論

近年來，隨著肥胖、2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝病等多種以糖脂代謝紊亂為代表的慢性內(nèi)分泌代謝疾病的廣泛流行，各國的醫(yī)療工作者已經(jīng)進行了大量相關(guān)研究。研究認為，各種以糖脂代謝紊亂為標志的代謝性疾病，其中心環(huán)節(jié)在于胰島素抵抗，而在胰島素抵抗的發(fā)生與發(fā)展過程中，肥胖是一個重要的影響因素[9]。肥胖患者過度堆積的內(nèi)臟脂肪會導致脂肪細胞的異常肥大，而肥大的脂肪細胞由于其細胞膜上胰島素受體數(shù)量的相對減少，會導致機體胰島素敏感性及反應性的降低，從而引發(fā)胰島素抵抗[10]。胰島素抵抗，又會使外周組織對葡萄糖的利用率和對肝糖原生成的抑制作用明顯降低，進而導致游離脂肪酸的升高[11]。升高的游離脂肪酸可使胰島β細胞中甘油三酯和神經(jīng)酰胺的合成增多，其中，甘油三酯的異常增高又會促使脂肪重新分布，在一定程度上加重肥胖的程度[12]。由此，糖脂代謝的異常就形成了互為因果的惡性循環(huán)。

研究顯示，miRNA可有效控制炎癥、改善胰島素抵抗、抑制脂滴的形成[13-14]。本研究通過對高甘油三酯血癥患者和健康對照人群的血漿miRNA表達譜進行分析，希望找出能夠作為高甘油三酯血癥的診斷標志物及治療靶點。目前，人類基因庫中已發(fā)現(xiàn)2 000多種miRNA，參與了人體內(nèi)半數(shù)以上mRNA的調(diào)控環(huán)節(jié)，人體外周血液循環(huán)中也存在穩(wěn)定表達且數(shù)量較多的miRNA，miRNA可作為一類新型的疾病生物標志物[15]。miRNAs與肥胖和糖尿病關(guān)系密切，其通過諸多代謝關(guān)鍵靶點調(diào)節(jié)糖代謝、脂代謝及線粒體功能等，進而參與代謝性疾病、心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程，在機體糖脂代謝紊亂的病理狀態(tài)下，相關(guān) miRNA 的表達能夠快速、顯著的出現(xiàn)異常，比如：有研究表明高脂血癥患者的miR-365的表達水平明顯高于正常個體[16]；在高糖高脂的刺激下，血清miR-25-5p、miR-4658、miR-4773、miR-4132、miR-5771-5p和miR-3165在人群中顯著升高，miR-130b和miR-494-5p明顯降低[17]；miR-7在胰島細胞中高表達并參與了胰島素的生物合成和分泌等過程[18]；miR-126通過調(diào)節(jié)靶向胰島素受體底物1的水平間接參與了胰島素抵抗的發(fā)展[19]。因此，miRNAs可能成為代謝性疾病診斷和預后的重要潛在生物標志物。

我們的芯片實驗結(jié)果初步篩選出二者之間表達顯著異常的12個miRNAs，而后通過RT-PCR的方法進行進一步驗證，最終發(fā)現(xiàn)與健康對照人群相比，高甘油三酯血癥血漿hsa-miR-4728-3p表達水平明顯升高。有趣的是，在與腫瘤相關(guān)的研究中，預測miR-4728-3p的靶基因共有54個，靶基因功能主要富集于轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)、DNA結(jié)合及蛋白質(zhì)磷酸化氨基酸結(jié)合等方面[20]；miR-4728-3p被認為能夠下調(diào)MAPK信號通路的表達水平，而MAPK/mTOR信號通路能有效抑制細胞自噬的發(fā)生[21-22]。最新研究表明，自噬在細胞脂質(zhì)代謝的過程中起著至關(guān)重要的作用[23]。脂肪細胞因子的異常釋放能夠激活細胞的自噬信號通路，從而清理細胞內(nèi)受損的細胞器以及脂滴等脂毒性代謝產(chǎn)物，改善機體的炎癥及氧化應激狀態(tài)，調(diào)節(jié)脂肪的重新分布[24-25]。因此，調(diào)節(jié)細胞的自噬水平，保障細胞的代謝活力就成為了治療糖脂代謝紊亂疾病的一個有效途徑。我們認為，高甘油三酯血癥患者血漿miR-4728-3p表達水平的升高，很可能揭示了機體應激性自噬激活的生理過程，而該miRNA則有可能成為脂代謝異常疾病，尤其是高甘油三酯血癥的治療靶點。

值得一提的是，在之前的一些研究中有報道m(xù)iR-30c能夠影響人體脂肪的重新分布以及脂肪細胞因子的釋放[26]。高表達的miR-30c可以抑制纖溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)的mRNA和蛋白表達，導致血管內(nèi)皮細胞活力和遷移能力明顯增強，從而參與代謝相關(guān)的心血管疾病[27]；miR-30c還能通過沉默自噬相關(guān)蛋白Beclin-1，抑制自噬，從而保護糖代謝紊亂時的心臟功能，NF-κB是miR-30c重要的正向調(diào)控因子[28]；MiR-30c能誘導腫瘤細胞程序性死亡發(fā)揮抑癌作用，RAS/MAPK/ERK為MiR-30c的主要信號調(diào)控通路[29]。然而，在本研究中，盡管芯片實驗的初步篩選過程中發(fā)現(xiàn)了血漿miR-30c-2-3p水平的異常表達，但是，在后續(xù)的RT-PCR驗證中該miRNA在兩組人群之中卻并未顯示出有統(tǒng)計學意義的表達差異(見圖2)?？紤]到可能是由于本研究樣本量較少，實驗結(jié)果數(shù)據(jù)離散度較大所致，因此，在后續(xù)的研究過程中應進一步增加樣本量以明確該實驗結(jié)果的準確性。另外，雖然本研究明確了miR-4728-3p與高甘油三酯血癥的相關(guān)性，進而通過文獻對比提出了該miRNA可能通過MAPK/mTOR自噬信號通路影響脂肪細胞因子的釋放，然而，其具體調(diào)控機制仍不清楚。因此，我們希望能夠通過進一步深入的研究驗證并明確其作用靶點，為糖脂代謝紊亂相關(guān)疾病帶來全新的治療思路和方法。