膠質(zhì)瘤細(xì)胞中β-TrCP和Bmi-1之間可能的調(diào)節(jié)關(guān)系

倪衛(wèi)娟，王 超，倪殿軍，李歸宿

(1.深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，廣東 深圳 518109；2.杭州市腫瘤醫(yī)院 腫瘤科，浙江 杭州 310000；3.深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院 神經(jīng)外科，廣東 深圳 518109)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的侵襲性惡性腫瘤。根據(jù)WHO制定的分級(jí)系統(tǒng)可將腦膠質(zhì)瘤分為4級(jí)，其中1～2級(jí)者代表低級(jí)別膠質(zhì)瘤，表示惡性程度較低、預(yù)后效果好；3～4級(jí)者代表高級(jí)別膠質(zhì)瘤，表示惡性程度較高、預(yù)后效果差[1-2]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤會(huì)影響大腦功能，倘若其生長(zhǎng)位置特殊和生長(zhǎng)速度較快還可能導(dǎo)致患者生命受到威脅，因此積極、有效治療尤為重要[3]。目前，關(guān)于該病的治療方法包括手術(shù)、放射療法、化學(xué)療法、靶向療法和實(shí)驗(yàn)性臨床試驗(yàn)[4]。然而，由于臨床對(duì)于膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，在外科手術(shù)和輔助治療方面雖然取得了一定的進(jìn)展，但惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的生存時(shí)間幾乎不會(huì)改善[5]。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，探究腫瘤侵襲的分子機(jī)制和新的治療靶標(biāo)為癌癥治療開(kāi)辟了新的思路。

β-轉(zhuǎn)導(dǎo)重復(fù)相容蛋白(Beta-transducinrepeats-containingproteins，β-TrCP)是F-box蛋白家族的成員，是SCF(Skpl-Cullinl-F-box)型泛素連接酶E3的關(guān)鍵組分。β-TrcpDg能夠通過(guò)識(shí)別并泛素化降解特異性磷酸化底物，如IKB、β-catenin、Emil和Snail等進(jìn)而對(duì)NF-κB信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、細(xì)胞周期和細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移等進(jìn)行調(diào)控，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡以及腫瘤的發(fā)生[6-7]。近年來(lái)，已鑒定出許多β-TrCP底物，包括Bmi1，β-catenin，Emi1等[8-9]。其中B細(xì)胞特異性莫洛尼鼠白血病病毒插入位點(diǎn)1(B-cell-specific Moloney murine leukemia virus insertion site 1，Bmi-1)在多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢(shì)[10-11]。盡管對(duì)β-TrCP的基本生物學(xué)和發(fā)病機(jī)理的理解已有實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，但對(duì)β-TrCP在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的可能作用和臨床意義了解甚少。對(duì)此，本研究通過(guò)臨床組織樣品和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來(lái)探索神經(jīng)膠質(zhì)瘤中β-TrCP與Bmi-1的上下游表達(dá)關(guān)系，為β-TrCP在人類(lèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤進(jìn)展中所產(chǎn)生的作用提供有關(guān)的重要數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本 收集我院神經(jīng)外科手術(shù)后的腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤標(biāo)本及非腫瘤腦組織標(biāo)本，共收集臨床組織樣品78例。其中，WHO1～2級(jí)24例(WHO1～2)，WHO3～4級(jí)38例(WHO3～4)，非腫瘤腦組織臨床樣本16例(NC)。樣本均保存于-80℃冰箱。

1.1.2 細(xì)胞 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(U87)購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.3 試劑 BMI1 Rabbit Polyclonal一抗，β-TrCP Rabbit Polyclonal一抗，β-actin Rabbit Monoclonal antibody一抗和羊抗兔IgG-HPR二抗抗體均購(gòu)于武漢Proteintech公司；細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；蛋白定量試劑盒和熒光定量試劑盒購(gòu)于上海貝博生物公司；腺病毒和轉(zhuǎn)染試劑及siRNA均購(gòu)于吉馬基因公司。

1.2 方法

1.2.1 U87細(xì)胞培養(yǎng) U87細(xì)胞用含有10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)的培養(yǎng)基在37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染β-TrCP過(guò)表達(dá)腺病毒 培養(yǎng)U87細(xì)胞于六孔板中，細(xì)胞設(shè)置為3組，分別為空白對(duì)照組(NC，無(wú)添加)、陽(yáng)性對(duì)照組(Control，添加無(wú)目的基因序列的病毒Vector)、實(shí)驗(yàn)組(ad-β-TrCP，添加含有β-TrCP基因的腺病毒)。正式實(shí)驗(yàn)之前檢測(cè)不同濃度病毒轉(zhuǎn)染效率，選取轉(zhuǎn)染率90%左右病毒濃度用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組將50 μL病毒原液加入培養(yǎng)液中稀釋至1.5 mL，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度約70%分別加入1.5 mL 病毒稀釋液于細(xì)胞中。在細(xì)胞感染后12～48 h之間更換培養(yǎng)基，搖勻。待細(xì)胞密度90%左右收取細(xì)胞樣品于-80℃保存。

1.2.3 siRNA轉(zhuǎn)染β-TrCP沉默 培養(yǎng)U87細(xì)胞于六孔板中，細(xì)胞設(shè)置為3組，分別為空白對(duì)照組(NC，只添加轉(zhuǎn)染試劑)、陽(yáng)性對(duì)照組(Control，添加轉(zhuǎn)染試劑和無(wú)目的基因序列的siRNA)、實(shí)驗(yàn)組(si-β-TrCP，添加添加轉(zhuǎn)染試劑和含有β-TrCP基因的siRNA)。正式實(shí)驗(yàn)之前，檢測(cè)不同濃度siRNA的沉默效率，選取沉默效率70%左右siRNA濃度(100 nM)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組將siRNA加入培養(yǎng)液中稀釋至1.5 mL，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度約70%分別加入細(xì)胞中。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后12～48 h更換培養(yǎng)基，搖勻。待細(xì)胞密度90%左右收取細(xì)胞樣品于-80℃保存。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)組織標(biāo)本β-TrCP及Bmi-1基因表達(dá) 利用TRizol法提取組織樣品總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。設(shè)計(jì)合適的引物(序列見(jiàn)表1)，按照熒光定量PCR試劑盒完成擴(kuò)增反應(yīng)，即95℃ 5min，95℃ 10 s和95℃ 45 s循環(huán)40次，結(jié)果以2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.2.5 蛋白免疫印跡檢測(cè)細(xì)胞樣品β-TrCP及Bmi-1蛋白表達(dá) 向收集到的細(xì)胞樣品中加入100 μL含有1%蛋白酶磷酸抑制劑的蛋白裂解液，裂解離心后取上清蛋白。使用BCA Protein Quantification Kit試劑盒測(cè)定蛋白濃度。使用SDS-PAGE電泳法分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行封閉，將一抗按要求稀釋至最佳孵育濃度，4℃搖床一抗(BMI1一抗1∶2 000，β-TrCP一抗1∶2 000，β-actin一抗1∶5 000 )孵育過(guò)夜。第二天孵育二抗(羊抗兔IgG-HPR二抗1∶5 000)后進(jìn)行ECL顯色，Image lab進(jìn)行掃描成像并處理圖像和半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床樣本中β-TrCP和Bmi-1的基因表達(dá) 如圖1所示，與非腫瘤組織比較，不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織樣本中β-TrCP基因的表達(dá)水平均顯著低于非腫瘤組織(P<0.01)，Bmi-1基因的表達(dá)水平則顯著高于非腫瘤組織(P<0.01)。其中，WHO3～4級(jí)膠質(zhì)瘤的β-TrCP表達(dá)水平顯著低于WHO1～2級(jí)別膠質(zhì)瘤(P<0.05)，但WHO3～4級(jí)膠質(zhì)瘤的Bmi-1基因表達(dá)水平顯著高于WHO1～2級(jí)別膠質(zhì)瘤(P<0.05)。

A：實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織和非腫瘤組織中β-TrCP基因表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖，β-actin為內(nèi)參；B：實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織和非腫瘤組織中Bmi-1基因表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖，β-actin為內(nèi)參；采用t-test檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與NC組相比，*:P<0.05，**:P<0.01，***:P<0.001具有顯著差異性。圖1 β-TrCP和Bmi-1基因在膠質(zhì)瘤組織和非腫瘤組織中的表達(dá)

2.2 U87細(xì)胞中β-TrCP過(guò)表達(dá)后Bmi-1的蛋白表達(dá) 利用在U87細(xì)胞中感染腺病毒的方法使β-TrCP在細(xì)胞中高表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2，感染帶有目的基因片段的腺病毒后，U87細(xì)胞中β-TrCP蛋白表達(dá)顯著增加，而B(niǎo)mi-1蛋白的表達(dá)被抑制，呈現(xiàn)出低表達(dá)水平(P<0.001)。

2.3 U87細(xì)胞中β-TrCP沉默后Bmi-1的蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3，β-TrCP基因沉默表達(dá)后，U87細(xì)胞中β-TrCP蛋白表達(dá)被顯著抑制，而B(niǎo)mi-1蛋白的表達(dá)顯著增加(P<0.01)。

A：蛋白免疫印跡檢測(cè)β-TrCP和Bmi-1蛋白表達(dá)電泳圖，β-actin為內(nèi)參；B：3組細(xì)胞β-TrCP表達(dá)相對(duì)定量統(tǒng)計(jì)圖；C：3組細(xì)胞Bmi-1表達(dá)相對(duì)定量統(tǒng)計(jì)圖；采用t-test檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與NC組相比，***:P<0.001具有顯著差異性。圖2 在U87細(xì)胞中過(guò)表達(dá)β-TrCP后檢測(cè)β-TrCP和Bmi-1的蛋白表達(dá)

A：蛋白免疫印跡檢測(cè)β-TrCP和Bmi-1蛋白表達(dá)電泳圖，β-actin為內(nèi)參；B：3組細(xì)胞中β-TrCP表達(dá)相對(duì)定量統(tǒng)計(jì)圖；C：3組細(xì)胞中Bmi-1表達(dá)相對(duì)定量統(tǒng)計(jì)圖；采用t-test檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與NC組相比，**:P<0.01，***:P<0.001具有顯著差異性。圖3 在U87細(xì)胞中沉默β-TrCP后檢測(cè)β-TrCP和Bmi-1的蛋白表達(dá)

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一種發(fā)生在大腦和脊髓中的腫瘤，其始于周?chē)窠?jīng)細(xì)胞及幫助其發(fā)揮功能的膠狀支持細(xì)胞，如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。像大多數(shù)原發(fā)性腦腫瘤一樣，膠質(zhì)瘤的確切原因尚不清楚，但其發(fā)病率居神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤首位，根據(jù)WHO分型共分為4級(jí)。其中，1級(jí)和2級(jí)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)較緩慢，又稱(chēng)作低級(jí)別膠質(zhì)瘤，而生長(zhǎng)較為快速的3級(jí)和4級(jí)則被定義為高級(jí)別膠質(zhì)瘤。近年來(lái)，隨著靶向治療的發(fā)展，探究疾病的發(fā)生機(jī)制并尋找治療的基因靶點(diǎn)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床診療至關(guān)重要。

哺乳動(dòng)物會(huì)表達(dá)兩個(gè)β-TrCP旁系同源物，分別為β-TrCP1和β-TrCP2。兩者具有相似的氨基酸序列和功能。有研究表明，β-TrCP可以在人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS中泛素化降解Bmi-1蛋白從而達(dá)到治療的目的[12]。結(jié)合文獻(xiàn)，我們推測(cè)在膠質(zhì)瘤中β-TrCP可能也存在著可以下調(diào)Bmi-1的機(jī)制功能。在我們的研究中，與非腫瘤組織相比，膠質(zhì)瘤組織中β-TrCP1呈現(xiàn)低水平表達(dá)，但Bmi-1基因表達(dá)水平顯著較高；且與低級(jí)別膠質(zhì)瘤(WHO1～2)相比，高級(jí)別膠質(zhì)瘤(WHO3～4)的β-TrCP1基因表達(dá)顯著降低。可以推測(cè)，β-TrCP1和Bmi-1在腫瘤組織中具有特征性表達(dá)。此外，在U87細(xì)胞中沉默β-TrCP1表達(dá)足以引起B(yǎng)mi-1蛋白積聚，但過(guò)表達(dá)β-TrCP1則顯著抑制Bmi-1蛋白表達(dá)，這說(shuō)明β-TrCP1和Bmi-1具有顯著相關(guān)性。大量文獻(xiàn)表明，β-TrCP1和β-TrCP2均具有一個(gè)保守的功能模塊F-box域，該模塊將底物橋接至功能性E3泛素SCF復(fù)合體，而β-TrCP1促進(jìn)降解的能力在很大程度上取決于其與底物的磷酸化依賴(lài)性結(jié)合[13]。本文的研究數(shù)據(jù)也表明Bmi-1的基因表達(dá)在某種程度上受到β-TrCP1的調(diào)控。

隨著研究的深入，多種β-TrCP 底物陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，其中Emi1主要通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白因子的調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)β-TrCP的調(diào)控。在多種腫瘤細(xì)胞中，Bmi-1呈現(xiàn)高表達(dá)水平并通過(guò)參與腫瘤細(xì)胞周期調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，在某些人大腸腫瘤中，β-catenin的積累與高水平的β-TrCP1伴隨。此外，β-TrCP的積累還會(huì)增加NF-κB的反式激活，這暗示由Wnt的持續(xù)激活或β-連環(huán)蛋白或APC中的致癌突變引起的β-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定可能有助于腫瘤細(xì)胞依賴(lài)NF-κB的存活[15]。在前列腺癌中，β-TrCP的過(guò)度表達(dá)即能夠提高HIF-1的轉(zhuǎn)錄活性，降低β-TrCP的表達(dá)成為抗腫瘤治療的新途徑[16]。另有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，β-TrCP可通過(guò)促進(jìn)泛素蛋白水解作用，抑制血管生成以及甲狀腺癌細(xì)胞遷移或減弱癌細(xì)胞增殖侵襲能力[17]。然而，由于內(nèi)源性β-TrCPs呈低水平表達(dá)，其功能很容易被顯性負(fù)性構(gòu)建體或抑制性底物抑制[18]。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)上調(diào)β-TrCP1蛋白表達(dá)水平，會(huì)導(dǎo)致Bmi-1蛋白表達(dá)下調(diào)，提示Bmi-1蛋白表達(dá)下調(diào)可能是由β-TrCP1介導(dǎo)的翻譯后修飾反應(yīng)所引起。隨后進(jìn)一步研究β-TrCP1與Bmi-1表達(dá)存在的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)表明，在siRNA敲低β-TrCP1表達(dá)后，Bmi-1表達(dá)顯著提高；而在β-TrCP1過(guò)表達(dá)后，Bmi-1表達(dá)顯著降低。結(jié)合以往研究[19]分析可知，β-TrCP1與Bmi-1表達(dá)具有上下游的調(diào)節(jié)關(guān)系。

綜上，本次研究結(jié)果顯示β-TrCP和Bmi-1的表達(dá)與膠質(zhì)瘤具有密切關(guān)系。Bmi-1作為β-TrCP的底物，與β-TrCP之間具有相互調(diào)節(jié)關(guān)系，即β-TrCP的高表達(dá)會(huì)抑制Bmi-1的表達(dá)，而β-TrCP的低表達(dá)會(huì)解除對(duì)Bmi-1的抑制作用。這種相互關(guān)系對(duì)研究膠質(zhì)瘤的病理特征及疾病靶標(biāo)具有參考作用。