三種細(xì)莖類石斛藥材的分子生物學(xué)鑒別

陸安靜，曾 瑤，杜藝玫，秦 琳，魯艷柳，張倩茹，譚道鵬，何芋岐

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 國家級藥學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

據(jù)2015年版的《中國藥典》規(guī)定，石斛類藥材的法定來源依其形態(tài)性狀及化學(xué)成分主要分為兩大類：來源于金釵石斛DendrobiumnobileLindl.、鼓槌石斛D.chrysotoxumLindl.、流蘇石斛D.fimbriatumHook.的栽培品及其同屬植物近似種的新鮮或干燥莖統(tǒng)稱為石斛，而鐵皮石斛D.officinaleKimura et Migo的干燥莖被單列為鐵皮石斛藥材[1]。不同于與金釵石斛等石斛類藥材的性狀差異較大，以鐵皮石斛D.officinale為主要來源的加工品“環(huán)草”有較多近似種來源，如細(xì)莖石斛D.moniliforme、羅河石斛D.lohohense、廣東石斛D.wilsonii等“細(xì)莖類石斛”[2]，其中尤以細(xì)莖石斛、羅河石斛產(chǎn)量較大，市場上有以細(xì)莖石斛、羅河石斛冒充野生鐵皮石斛的現(xiàn)象?！凹?xì)莖類石斛”藥材使用極為混亂，植物分類較為困難，甚至各種分類之間也存在較大沖突[3]。因此，傳統(tǒng)的藥材鑒定方法對于細(xì)莖類石斛藥材的鑒別存在一定不足。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的DNA分子標(biāo)記技術(shù)逐漸應(yīng)用到石斛等多基源中藥材的鑒定。如樊洪泓等[4]用SRAP技術(shù)對部分藥用石斛的遺傳多樣性進(jìn)行了研究；邱婧等[5]采用RAPD技術(shù)對9種藥用石斛的遺傳多樣性及親緣關(guān)系進(jìn)行了分析；趙庭梅等[6]應(yīng)用基因組SSR標(biāo)記對鐵皮、金釵、疊鞘三種石斛的遺傳學(xué)多態(tài)性進(jìn)行了研究；婁勇軍等[7]采用ITS2序列對部分鐵皮石斛偽品進(jìn)行了鑒別。但很少有對石斛商品類別種間的研究報(bào)道，本文擬通過對鐵皮、細(xì)莖、羅河三種“細(xì)莖類石斛”ITS序列進(jìn)行比較分析，為混亂復(fù)雜的細(xì)莖類石斛藥材分類鑒別提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 實(shí)驗(yàn)樣品來見表1。

表1 樣品來源信息

1.1.2 主要試劑 新型快速植物基因組DNA提取試劑盒(GK4005，上海捷瑞生物工程有限公司)、即用型Taq酶PCR試劑盒(GK8006，上海捷瑞生物工程有限公司)、100 bp DNA Ladder(M1200，北京索萊寶科技有限公司)。本研究中使用的引物序列來源于Douzery等[8]設(shè)計(jì)的對石斛屬ITS區(qū)的擴(kuò)增引物，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.1.3 主要儀器 電熱恒溫水浴鍋(DK-98-Ⅱ，天津市泰斯特儀器有限公司)；超微量分光光度計(jì)(ND2000，美國Thermo公司)；PCR擴(kuò)增儀(C100 Touch，Bio-Rad)；電泳儀電源(DYY-6C型，北京市六一儀器廠)；瓊脂糖凝膠電泳儀(DYCP-33A，北京市六一儀器廠)；瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)(WP-9413B，北京市六一儀器廠)；DNA測序分析儀(ABI 3730，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 稱取約100 mg新鮮樣品葉片置于盛有液氮的研缽中并將其充分研磨成粉末狀。參照新型快速植物基因組DNA提取試劑盒說明書，在樣品中加入550 μL Buffer P1和6 μL RNase A劇烈渦旋振蕩1 min，65 ℃孵育20 min；加入130 mL Buffer P2充分混勻，12 000 rpm離心3 min；取上清溶液，加入1.5倍體積的Buffer P3，轉(zhuǎn)移到離心柱中，12 000 rpm 離心1 min；加入Wash Solution漂洗兩次；加入100 μL AE Buffer溶解，利用超微量分光光度計(jì)對所提的DNA濃度進(jìn)行檢測；-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增 采用Bio-Rad 普通PCR擴(kuò)增儀完成PCR擴(kuò)增反應(yīng)，體系為：2×Tap Master Mix 25 μL，Primer F 0.3 μL，Primer R 0.3 μL，DNA (50 ng/μL) 5 μL，加滅菌的ddH2O補(bǔ)足至50 μL。 DendrobiumF：TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGG，DendrobiumR：CGTAACAA GGTTT CCGTAGGTGAAC。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，72 ℃末端延伸10 min，共39個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，緩沖液為0.5×TBE緩沖液，電泳條件為：160V，60min。

1.2.3 DNA序列測定 經(jīng)電泳檢測合格后的PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司采用標(biāo)記終止物法對每個(gè)樣品進(jìn)行單向測序。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 利用Clustalx對石斛樣品序列進(jìn)行排序；對排序后的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Basic Local Aligment Search Tool (BLAST)分析；利用R 3.5.3語言中工具包phangorn的heat-map.2函數(shù)對9個(gè)石斛樣品的ITS序列進(jìn)行可視化處理；利用FigTree v1.3.1軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳 對9個(gè)石斛樣品rDNA ITS區(qū)(包括部分18S rDNA、ITS1、5.8S rDNA、ITS2和部分26S rDNA)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，左邊泳道為DNA Maker，泳道1～9為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。其中，泳道1～3模板為羅河石斛的PCR產(chǎn)物，泳道4～6模板為鐵皮石斛的PCR產(chǎn)物，泳道7～9模板為細(xì)莖石斛的PCR產(chǎn)物，均在700～800bp之間出現(xiàn)單一、明亮且清晰的條帶(見圖1)。

圖1 石斛樣本ITS區(qū)擴(kuò)增條帶瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 石斛樣本ITS序列的BLAST結(jié)果 將以上9個(gè)樣品的PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，對所得序列在NCBI網(wǎng)站分別進(jìn)行Nucleotide BLAST分析。分析結(jié)果如表2所示，BLAST分析中，匹配得分越高，表示相似度越高；E值越小，表示比對結(jié)果越可信；一致性表示比對序列與數(shù)據(jù)庫序列能匹配的比例；缺失值代表序列中插入或缺失的比例。通過BLAST進(jìn)行種屬比對，9個(gè)樣本的ITS序列與Genebank中同屬物種序列一致性均在99%，1～3號為D.lohohense(羅河石斛)，4～6D.catenatum(鐵皮石斛)，7～9號為D.moniliforme(細(xì)莖石斛)，可以準(zhǔn)確地對物種進(jìn)行鑒別。

表2 樣本ITS序列比對結(jié)果

2.3 石斛樣品ITS序列分析 利用Bio Edit軟件對9個(gè)樣品的ITS序列進(jìn)行比對，羅河石斛(1～3號)樣品ITS序列長度分別為693bp，692bp，692bp，A占堿基總數(shù)的均值為23.40%，T占23.93%，G占23.69%，C占28.98%，(G+C)含量占52.67%，(A+T)含量占47.33%；鐵皮石斛(4～6號)樣品ITS長度分別690bp，690bp，688bp，A占堿基總數(shù)的均值為22.78 %，T占24.22 %，G占24.42 %，C占28.58 %，(G+C)含量占53.00 %，(A+T)含量占47.00 %；細(xì)莖石斛(7～9號)樣品ITS序列長度分別為687bp，691bp，688bp，A、T、G、C占堿基總數(shù)的均值分別為23.04%、22.36%、24.83%、29.77%，(G+C)含量占54.60 %，(A+T)含量占45.40 %(見圖2)。

圖2 石斛樣品1～9石斛樣品的ITS序列

2.4 聚類與親緣關(guān)系分析 對9個(gè)石斛樣本的ITS序列進(jìn)行聚類分析，如圖3所示，圖中的每個(gè)矩形小方塊代表一個(gè)樣本的DNA序列。9個(gè)石斛樣本明顯分為三類，羅河石斛(1、2、3)聚為一類，鐵皮石斛(4、5、6)聚為一類，細(xì)莖石斛(7、8、9)聚為一類。為進(jìn)一步探討鐵皮石斛、羅河石斛、細(xì)莖石斛之間的親緣關(guān)系，對9個(gè)石斛樣本的ITS序列構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果見圖4。細(xì)莖石斛(7、8、9)與鐵皮石斛(4、5、6)的親緣關(guān)系較近，與羅河石斛(1、2、3)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，羅河石斛(1、2、3)與鐵皮石斛(4、5、6)的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖3 9個(gè)石斛樣本的可視化熱圖

圖4 9個(gè)石斛樣本的進(jìn)化樹圖

3 討論

石斛屬植物種類繁多，而石斛類藥材在數(shù)千年的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用中涉及到的品種多達(dá)60余種[3]，甚至有些石斛類藥材并非來源于石斛屬植物。自中華人民共和國成立以來，石斛類藥材的法定來源由1963年版《中國藥典》規(guī)定的石斛屬植物逐步固定為鐵皮石斛及石斛兩大類，后者是指來源于金釵石斛D.nobile、鼓槌石斛D.chrysotoxum、流蘇石斛D.fimbriatum的栽培品及其同屬植物近似種的新鮮或干燥莖的統(tǒng)稱。傳統(tǒng)認(rèn)為鐵皮石斛是優(yōu)質(zhì)的石斛藥材[7]，其加工品可分為：楓斗、環(huán)草、黃草等商品藥材類別，其中商品“環(huán)草”石斛的藥材來源除鐵皮石斛D.officinale外，還包括細(xì)莖石斛D.moniliforme、羅河石斛D.lohohense、廣東石斛D.wilsonii等“細(xì)莖類石斛”，特別是細(xì)莖石斛、羅河石斛還有較大的產(chǎn)量和使用地域[2,9]。

細(xì)莖類石斛藥材的原植物分類較為困難，并且不同分類方法之間存在較大沖突，致使細(xì)莖類石斛藥材來源更為混亂。尤其是鐵皮石斛與細(xì)莖石斛的分類存在較大爭議，如2005年版以前中國藥典鐵皮石斛拉丁名為D.candidum，1999年版《中國植物志》及2010版以后《中國藥典》鐵皮石斛拉丁名為D.officinale，而2009年出版的中國植物志英文版《Flora of China》又將鐵皮石斛D.officinale與霍山石斛D.huoshanese、黃石斛D.tosaense合并為同一個(gè)種D.catenatum，中文名定為黃石斛。金效華[10]對中藥石斛的植物來源考證發(fā)現(xiàn)不同的學(xué)者對鐵皮石斛及細(xì)莖石斛的來源存在較大的異議，如Pearce & Cribb將D.officinale處理為D.candidum的異名，Wood認(rèn)為D.candidum是D.moniliforme的異名，將D.officinale，D.tosaense處理為D.catenatum的異名，Jin等將D.candidum，D.huoshanense處理為D.moniliforme的新異名，Zhu等將D.huoshanense，D.tosaense，D.officinale處理為D.catenatum的新異名與2009版《Flora of China》一致，由此說明僅憑植物形態(tài)、藥材性狀對鐵皮石斛藥材親緣關(guān)系較近的植物進(jìn)行鑒別非常困難。羅河石斛分布于貴州省大部分地區(qū)及廣西、四川、云南、湖南、湖北、廣東等省部分地區(qū)[11]，歷來在地方上被作為石斛藥材使用，是“細(xì)莖類石斛”藥材的主要來源之一。李濤等[12]對其從植物形態(tài)、藥材性狀、顯微結(jié)構(gòu)等方面做了研究，但整體而言，關(guān)于羅河石斛的研究報(bào)道甚少。本文通過ITS序列對三種“細(xì)莖類石斛”的鑒別發(fā)現(xiàn)能夠很好的區(qū)分其各自來源，可以為“細(xì)莖類石斛”藥材的鑒別及質(zhì)量評價(jià)提供參考。