兒童糞便中四環(huán)素耐藥菌分離鑒定及四環(huán)素耐藥基因分析

徐先林，文 雯，孫澤敏，歐剛衛(wèi)

(遵義醫(yī)科大學 生物化學與分子生物學教研室，貴州 遵義 563099)

抗生素的濫用或習慣性使用[1-2]導致耐藥菌大量出現(xiàn)和各類抗生素耐藥基因(Antibiotic resistance genes，ARGs)在不同生態(tài)系統(tǒng)中轉移和傳播[3]。人類腸道中多種微生物共存，細菌通過水平基因轉移等[4]方式交換基因片段。已發(fā)現(xiàn)人類腸道微生物包含超過6 000種ARGs[5]，ARGs在腸道菌群間廣泛轉移可能破壞腸道菌群穩(wěn)態(tài)，對人體健康造成威脅。

雖然臨床已經(jīng)多年很少使用四環(huán)素(Tetracycline, TC)類抗生素治療或預防感染性疾病[6]，但TC仍被大量用于防治多種動物疾病以及家禽和家畜飼養(yǎng)中[7]，未被充分利用或代謝的TC被大量排泄到環(huán)境中[8]。我國不同地區(qū)和許多國家的污水和地表水等環(huán)境中均檢測到高濃度的TC殘留[9-10]，殘留的TC對生態(tài)系統(tǒng)中細菌產(chǎn)生選擇壓力，并通過移動基因元件(Mobile genetic elements，MGEs)[11-12]在細菌間轉移。腸道微生物群長期暴露于亞劑量TC中，有利于潛在耐藥菌生長[13]。

腸道菌群具有高度抗生素耐藥性[14]，目前對無抗生素使用史腸道耐藥菌及相應ARGs特征的認識仍不清楚。本研究從兒童糞便中篩選TC耐藥菌并評估細菌攜帶TC耐藥基因情況，了解腸道內可培養(yǎng)TC耐藥菌分布并分析耐藥基因與耐藥相關性，探討兒童腸道菌群攜帶TC耐藥基因的特點與規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 糞便標本采集 本研究招募了遵義市兒童4例(見表1)，均無TC使用史，征得監(jiān)護人同意后采集新鮮糞便樣本置于無菌EP管中，樣品編號為Z-1、Z-2、Z-3、Z-4，低溫條件運至實驗室，保存于-80℃，并盡快進行后續(xù)實驗。

表1 受試者的基本情況

1.1.2 主要藥物與試劑 四環(huán)素藥敏片(杭州微生物試劑有限公司)；四環(huán)素鹽酸鹽(50 mg/mL)(上海生工)；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、腦心浸液培養(yǎng)基、布氏瓊脂(青島海博生物)；MH培養(yǎng)基(索萊寶生物)；DNA分子量標準(碧云天生物)；PCR Master Mix(2×)(Fermentas公司)；GoldView核酸染料(碧云天生物)；引物(上海生工)；其它試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 TC耐藥菌株分離與保存 將糞便樣本分區(qū)劃線接種于TC選擇性培養(yǎng)基中進行耐藥菌株的篩選與分離，TC篩選濃度(150 μg/mL)參考文獻[15]。為了盡可能篩選出更多細菌，采用多種培養(yǎng)基分別在有氧和厭氧條件下培養(yǎng)糞便樣本。有氧條件：蘸取少許樣本用分區(qū)劃線法接種于新配制的營養(yǎng)瓊脂、腦心浸液、麥康凱、血平板等培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；隨機挑取平板上菌落外觀形態(tài)不同(大小、形態(tài)、顏色、邊緣情況、表面光澤、質地和透明度等)的菌落數(shù)個，分區(qū)劃線接種于新的平板上，37℃培養(yǎng)24 h；重復純化2～3次，直至平板上形成外觀形態(tài)單一的菌落。厭氧條件：挑取少許樣本分區(qū)劃線接種于新配制的腦心浸液和血平板中，迅速放入3.5 L厭氧罐，并立即放入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋(3.5 L，日本三菱)，封閉厭氧罐，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，同時以接種破傷風桿菌(本校微免實驗室提供)的平板作為厭氧條件驗證；隨機挑選平板上形態(tài)不同的菌落數(shù)個，置于厭氧條件下37℃培養(yǎng)48～72 h；重復純化2～3次直至厭氧純化平板上形成單一菌落。保存所有菌株，非厭氧菌置于含20%甘油的液體培養(yǎng)基中保存于-80℃；厭氧菌采用半固體穿刺保存。

1.2.2 革蘭氏染色 采用革蘭氏染色對細菌進行初步分類鑒定，確定革蘭氏染色情況。革蘭氏染色具體步驟參考文獻方法[16]，簡單描述為如下8步：涂片、晾干、固定、染色、媒染、脫色、復染、鏡檢。

1.2.3 分子生物學鑒定 采用16S rRNA基因PCR擴增法進行細菌鑒定，擴增通用引物見表2。PCR模板制備：取菌體少許加入100 μL無菌水中，渦旋混勻后置于沸水浴中加熱10 min，稍冷后12 000 rpm離心1 min，上清液作為模板直接用于16S rRNA基因PCR擴增。擴增體系(50 μL)：上游引物(10 pmol/μL) 1 μL；下游引物(10 pmol/μL)1 μL；PCR Master Mix(2×) 25 μL；模板(空白對照組以蒸餾水代替)5 μL；蒸餾水 18 μL。擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸90 s，30次循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR結束后取擴增產(chǎn)物5 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳，設定恒壓120V，電泳35min；在凝膠成像系統(tǒng)(Bio-RAD公司)下觀察結果，將能清晰分辨出目的條帶且具有一定亮度的PCR產(chǎn)物送至上海生工武漢測序部進行測序。將測序結果與GenBank中已知菌株的16S rDNA 序列進行同源性對比鑒定細菌。鑒定方法參考文獻[17]。

表2 引物序列信息

1.2.4 TC藥敏試驗 對所有細菌均進行TC藥敏試驗，非厭氧菌采用K-B紙片瓊脂擴散法，厭氧菌則采用瓊脂稀釋法。K-B紙片瓊脂擴散法：取菌落移至3～4 mL無菌生理鹽水中，渦旋振蕩混勻，用細菌比濁儀(法國梅里埃)調整其比濁度為0.50個麥氏比濁單位；無菌棉拭子蘸取菌液，均勻涂布于MH瓊脂平板表面，室溫下干燥3～5 min，用無菌鑷子取TC藥敏紙片(含藥量30 μg/片)緊貼于平板表面，藥敏紙片距平板內緣>15 mm，紙片之間距離不小于24 mm。將平板翻轉后置于37℃培養(yǎng)16～18 h，測量抑菌圈大小。根據(jù)CLSI(美國臨床與實驗室標準化協(xié)會)標準(見表3)，對各菌做出“敏感”、“中介”、“耐藥”的判斷。瓊脂稀釋法：取菌落直接懸浮于布氏肉湯培養(yǎng)基中，渦旋混勻，用細菌比濁儀調節(jié)菌液濁度為0.5個麥氏濁度單位。準確量取已經(jīng)校正比濁度的菌液各2 μL分別滴在在含不同濃度TC(0、2、4、8、16、32、150 μg/mL)的強化布氏瓊脂平板上。待平板吸收完菌液后翻轉平板，迅速放入?yún)捬鯒l件，37℃培養(yǎng)42～48 h觀察結果，判讀最小抑菌濃度(MIC)終點。與無TC(0 μg/mL)的平板對比，細菌生長顯著減少的TC濃度即為MIC值，并根據(jù)CLSI標準做出敏感(≤4 μg/mL)、中介(8 μg/mL)和耐藥(≥16 μg/mL)的判斷。

表3 K-B紙片擴散法TC藥敏判讀標準

1.2.5 TC耐藥基因檢測 對分離的細菌進行tet(A)、tet(B)、tet(G)、tet(L)、tet(M)、tet(O)、tet(Q)、tet(W) 8種四環(huán)素耐藥基因PCR擴增，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物基本信息見表2。PCR模板制備方法同1.2.3。擴增體系20 μL：16S rRNA基因上游引物(10 pmol/μL)0.5 μL，16S rRNA基因上游引物(10 pmol/μL)0.5 μL，TC耐藥基因上游引物(10 pmol/μL)0.5 μL，TC耐藥基因下游引物(10 pmol/μL)0.5 μL，PCR Master Mix(2×)10 μL，模板(空白對照以蒸餾水代替)3 μL，蒸餾水5 μL。擴增程序：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，退火溫度(見表2)45 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。電泳檢測：取PCR擴增產(chǎn)物5 μL進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，調整電壓為120 V，電泳40 min后用凝膠成像系統(tǒng)觀察結果。

2 結果

2.1 細菌鑒定 通過TC篩選培養(yǎng)基進行糞便培養(yǎng)，挑選出190個菌落進行純化培養(yǎng)，但在純化過程中有6株細菌未生長，對余下184株細菌進行革蘭氏染色和16S rRNA基因測序鑒定。革蘭氏染色結果顯示，各細菌涂片清晰、顏色單一、細菌形態(tài)一致，無形態(tài)多樣和染色同時出現(xiàn)紫色和紅色及染色不清楚的情況(見圖1)，表明各菌株已經(jīng)完全純化，可以用于后續(xù)實驗；通用引物擴增的16S rRNA基因大小約為1500 bp，采用雙向測序，將測序結果用SeqMan軟件去除測序圖譜兩端峰形較亂的序列，拼接雙向測序結果，查找并修正其中拼接錯誤。采用16S rRNA基因測序鑒定顯示共分離出163株非厭氧菌和21株厭氧菌，其中大腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、遲緩埃格特菌、產(chǎn)氣柯林斯菌是主要細菌種類。4例糞便樣本的細菌分離鑒定結果見表4。

A：大腸桿菌；B：鳥腸球菌；C：青春雙歧桿菌；D：產(chǎn)氣柯林斯菌。圖1 部分菌株革蘭氏染色結果(倍數(shù)10 ×100)

表4 4例樣本中分離鑒定的細菌

2.2 TC藥敏試驗 所有細菌均進行TC藥敏試驗，部分TC藥敏結果如圖2。由藥敏試驗結果(見表5)可知，184株細菌表型耐藥率為93.5%，表型敏感率為6.5%，無中介率。大腸桿菌耐藥率為91.8%，腸球菌、雙歧桿菌、產(chǎn)氣科特斯菌、遲緩埃格特菌耐藥率均為100%。9株敏感大腸桿菌均來Z-1樣本，另外3株敏感菌來自Z-3和Z-4。全部細菌藥敏試驗統(tǒng)計結果見表5。

A：屎腸球菌；B：大腸桿菌；C：大腸桿菌。圖2 部分細菌K-B紙片擴散法四環(huán)素藥敏試驗結果

表5 184株細菌四環(huán)素藥敏試驗結果

2.3 TC耐藥基因擴增 根據(jù)PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結果判斷是否擴增出目標耐藥基因，部分菌株耐藥基因PCR產(chǎn)物電泳結果見圖3。如表6、7所示，184株細菌中耐藥基因總檢出率為83.2%，12株TC敏感菌未檢出任何耐藥菌基因；其中tet(B)、tet(M)、tet(Q)、tet(W)、tet(A)檢出率分別為18.5%、32.1%、0.5%、8.7%、23.4%，未檢出耐藥基因比例為16.8%；172株耐藥菌中耐藥基因檢出率為89.0%，其中大腸桿菌主要檢測出tet(A)和tet(B)，腸球菌全部檢測到tet(M)，雙歧桿菌全部檢測到tet(W)，產(chǎn)氣柯林斯菌全部檢出tet(W)，19株耐藥菌(11.0%)未檢測到上述8種基因；所有細菌均未檢測到2種以上的耐藥基因，無細菌擴增出tet(G)、tet(L)、tet(O)。

A：DNA分子量標準；B：部分菌株tet(W)基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖，可見目的條帶(168 bp)和16S rRNA條帶(1500 bp)；C：部分菌株tet(G)基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖，可見16S rRNA條帶(1500 bp)，未見目的條帶(662 bp)。圖3 部分耐藥基因PCR產(chǎn)物電泳圖

表6 四環(huán)素敏感菌耐藥基因PCR擴增結果

(續(xù)表7)

2.4 攜帶tet(A)與tet(B)的大腸桿菌抑菌圈大小比較 4個樣本耐藥基因檢出率分別為92.6%、95.0%、82.1%、84.6%，耐藥基因檢出率較高；各樣本中大腸桿菌攜帶tet(A)與tet(B)比例差異較大，Z-1中tet(B)檢出率為30.9%，tet(A)檢出率為17.4%；Z-2中無細菌檢測出tet(B)基因，tet(A)檢出率為88.9%；Z-3中tet(B)為檢出率21.4%，tet(A)為檢出率53.6%；Z-4中tet(B)檢出率為65.0%，tet(A)檢出率為35.0%。統(tǒng)計4個樣本中所有耐藥大腸桿菌藥敏及耐藥基因檢測情況發(fā)現(xiàn)，tet(B)陽性大腸桿菌藥敏抑菌圈明顯小于tet(A)陽性大腸桿菌(見表8，圖4)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，抑菌圈越小表明敏感性低、耐藥性更強。

表8 K-B紙片擴散法四環(huán)素藥敏試驗抑菌圈大小

圖4 tet(A)陽性大腸桿菌與tet(B)陽性大腸桿菌抑菌圈直徑比較

3 討論

由于腸道菌群的復雜性及細菌培養(yǎng)技術的限制，分離的細菌種類和數(shù)量有限，不能全面分離腸道菌群中TC耐藥菌。但在現(xiàn)有技術條件下，通過細菌培養(yǎng)和PCR擴增等技術，分析腸道菌群TC耐藥情況、分析腸道細菌耐藥基因攜帶特點，對于初步了解兒童腸道菌群中可培養(yǎng)TC耐藥菌及TC耐藥基因攜帶情況，有助于深入了解耐藥基因在兒童腸道菌群中的分布狀態(tài)、存在方式和對兒童腸道菌群組成及遠期健康的影響。本研究從4例兒童糞便中分離、鑒定出184株細菌(見表4)，細菌種類在樣本間有較大差異，除了受可培養(yǎng)方法的缺陷及篩選細菌數(shù)量較少有關外，還因腸道微生物群在生命早期隨腸道發(fā)育而形成，易受多種因素影響[23]，如腸道類型、出生胎齡、分娩類型、母乳喂養(yǎng)方法、斷奶期、生活方式、飲食習慣等。

雖然預先通過多種高濃度TC選擇性培養(yǎng)基篩選耐藥菌，然而TC藥敏試驗結果顯示：184株細菌中172株細菌為TC耐藥，另外12株表現(xiàn)出對TC敏感。當通過高濃度的TC(150 μg/mL)篩選時，耐藥菌株能夠存活，其中有一些短暫性耐藥菌株，去除篩選壓力之后傾向于丟失存在于染色體外的耐藥基因[2]恢復其敏感狀態(tài)。在后續(xù)純化過程中去除TC的選擇性壓力后，攜帶耐藥基因對宿主將是不利因素，細菌會有丟失抗性基因的趨勢，尤其是位于質粒中的耐藥基因，可能重新建立其最初的敏感狀態(tài)，因此藥敏試驗中有少數(shù)細菌為敏感菌。結果中敏感細菌不攜帶任何耐藥基因，耐藥細菌耐藥基因檢出率高達89.0%，表明細菌耐藥是由于耐藥基因的表達。腸道是轉運ARGs的良好生態(tài)系統(tǒng)，腸道微生物群構成了一個巨大的ARGs儲蓄庫。研究者通過成對比較建模方法從人類腸道菌群中鑒定出超過6 000種抗生素耐藥基因[5]，表明腸道環(huán)境中抗生素耐藥基因的巨大多樣性。課題組前期研究結果也已經(jīng)表明無TC直接使用史兒童糞便中存在著tet(B)、tet(Q)、tet(M)等多種TC耐藥基因(結果未展示)，但并不清楚耐藥細菌攜帶何種耐藥基因。本研究通過分離TC耐藥菌探討多種TC耐藥基因攜帶情況。tet(A)、tet(B)、tet(G)、tet(L)、tet(M)、tet(O)、tet(Q)、tet(W)是常見的TC耐藥基因，tet(A)、tet(B)、tet(G)、tet(L)編碼外排泵蛋白，tet(M)、tet(O)、tet(Q)、tet(W) 編碼核糖體保護蛋白[24]。本實驗通過PCR擴增上述8中耐藥基因，結果顯示不同耐藥基因檢出率各不相同(見表7)，而且樣本間各耐藥基因檢出率差異較明顯。大腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌及產(chǎn)期柯林斯菌是分離的主要細菌種類，屬于腸道共生菌。腸道共生菌是天生抗生素耐藥菌[14]，大腸桿菌主要檢測到tet(A)、tet(B)，腸球菌全部攜帶tet(M)，雙歧桿菌和產(chǎn)氣柯林斯菌全部檢測到tet(W)，表明特定種屬細菌可能攜帶不同優(yōu)勢耐藥基因[24]，且不能在物種間轉移[5,25]。雖然現(xiàn)已知腸道耐藥基因種類龐大，但不同耐藥基因檢出率可能和細菌種類密切相關，表明細菌多樣性影響耐藥基因的檢出率?？股卦诃h(huán)境中高度殘留[9]及TC耐藥基因在環(huán)境中呈多樣性[26]，健康人群通過環(huán)境暴露和飲食攝取，腸道微生物群長期暴露于亞治療劑量TC中，但結果中耐藥菌均檢測出單一耐藥基因并無兩種及以上耐藥基因檢測情況，表明腸道細菌無TC直接篩選壓力，細菌耐藥強度比預期要低。由于細菌耐藥基因的表達是耗能的，攜帶耐藥基因并表達對細菌是不利因素[27]，細菌傾向攜帶更少的耐藥基因。

表7 四環(huán)素耐藥菌耐藥基因PCR擴增結果

tet(A)、tet(B)均編碼外排泵蛋白，結果顯示tet(B)陽性大腸桿菌藥敏實驗中抑菌圈直徑明顯小于tet(A)陽性菌株(P<0.05)，與Karami研究[28]結果相似，表明攜帶tet(B)基因的菌株耐藥強度可能大于tet(A)基因攜帶者。4份糞便樣本tet(B)和tet(A)陽性大腸桿菌比例差異較大(見表7)，表明個體差異可能導致細菌攜帶不同耐藥基因呈現(xiàn)不同耐藥強度，由于代謝狀態(tài)會影響細菌對抗生素的耐藥性[29]，推測這種差異可能和代謝差異有關。

因此，耐藥除了與耐藥基因表達耐藥蛋白有關外，還可能與細菌自身代謝狀態(tài)有關。結果中11.0%的耐藥菌未檢測到任何耐藥基因，可能攜帶著其它未檢測的耐藥菌基因，更可能是它們屬于表現(xiàn)耐藥，即為持留菌[30]，并不攜帶任何耐藥基因，其耐藥機制可能涉及細胞代謝狀態(tài)改變。細菌對亞治療水平的TC暴露反應具有種特異性、濃度依賴性，因特定細菌比例不同導致腸道細菌代謝狀態(tài)不同[31]，細菌代謝狀態(tài)影響細菌對抗生素的耐藥性，細菌代謝生理的變化影響細菌對抗生素的敏感性而促進耐藥與持留產(chǎn)生，調節(jié)細菌代謝能夠恢復抗生素敏感性[32]。既然細菌代謝與耐藥有關，那細菌代謝是否又會影響耐藥基因種屬特異性？腸道菌群龐大，抗生素與細菌之間的相互作用及其對宿主的影響非常復雜，細菌代謝如何影響抗生素耐藥值得進一步研究。

人體即使無直接TC使用史，其腸道菌群仍受到環(huán)境或食物來源的多種抗生素的影響，不同耐藥菌攜帶著種屬特異性耐藥基因；不同個體間的大腸桿菌可能攜帶不同優(yōu)勢耐藥基因而表現(xiàn)出不同的耐藥強度。由于樣本間細菌耐藥率和耐藥菌顯現(xiàn)出差異性，那么這些差異是否和腸道菌群代謝密切相關？TC對腸道菌群代謝的影響及菌群整體代謝狀態(tài)如何影響細菌耐藥性仍有待探討。