復(fù)方氨基酸（15）雙肽（2）注射液異常毒性及降壓物質(zhì)方法學(xué)研究

肖佳音，李慶忠，田冰

黑龍江省藥品檢驗(yàn)研究中心，哈爾濱 150088

生化藥品是指從動(dòng)物器官、組織、體液、分泌物中經(jīng)前處理、提取、分離、純化等制得的安全、有效、質(zhì)量可控的藥品，主要包括蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸及其衍生物、多糖、核苷酸及其衍生物、脂、酶及輔酶等［1］。生化藥注射劑是注射劑中較特殊的一類(lèi)，按照化學(xué)藥品質(zhì)量控制方式很難控制其質(zhì)量［2］，且有關(guān)生化藥不良反應(yīng)的報(bào)道時(shí)有發(fā)生［3-6］。因此，完善生化藥注射劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于保障臨床用藥安全具有重要意義。

1 試驗(yàn)材料

1.1 儀器

AL204 電子天平（METTLER TOLEDO）；PL602-S電子天平（METTLER TOLEDO）；RM6000 多導(dǎo)生理儀（日本光電工業(yè)株式會(huì)社）。

1.2 試藥

復(fù)方氨基酸（15）雙肽（2）注射液（生產(chǎn)企業(yè)：哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司；批號(hào)：Y140528E1、Y140531E1、Y140531E2；規(guī) 格：500 mL：67 g）；原研樣品（生產(chǎn)企業(yè)：Fresenius Kabi Austria GmbH；批號(hào)16HB0093；規(guī)格：500 mL：67 g）。磷酸組胺（批號(hào)150510-200412，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；氯醛糖（批號(hào)：BCBK9603V，SIGMA 公司）；滅菌注射用水（批號(hào)1408043，天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司）；氯化鈉注射液（批號(hào)140113D17，哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司）。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

小鼠，80 只，昆明種，體重17～20 g，雌雄各半，購(gòu)自長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（吉）2011-005；貓，4 只，體重2.7～3.5 kg，雄性。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境為屏障環(huán)境，貓飼養(yǎng)環(huán)境為普通級(jí)環(huán)境，許可證號(hào)：SYXK（黑）2014004，溫度（23±2）℃，濕度（55±10）%。

2 試驗(yàn)方法

2.1 異常毒性檢查法限值的確定

2.1.1 設(shè)定限值前研究因本品為大輸液，先以靜脈注射最大劑量0.8 mL/20 g 體重給予小鼠，結(jié)果小鼠即刻死，故測(cè)定LD50。

LD50預(yù)試驗(yàn)：取昆明種小鼠20 只，體重17～20 g，雌雄各半，分成5 組，每組4 只，進(jìn)行LD50預(yù)試驗(yàn)。以1∶0.7 為劑量比，按原液0.80、0.56、0.39、0.27、0.19 mL/只五個(gè)劑量分別尾靜脈注射，注射速度為0.1 mL/s，觀察72 h。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。同時(shí)比較原研樣品，結(jié)果基本一致。

表1 小鼠的LD50預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

LD50正式試驗(yàn)：在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，取昆明種小鼠60 只，體重17～20 g，雌雄各半，隨機(jī)分成6 組，每組10 只。以1∶0.9 為劑量比，用氯化鈉注射液稀釋?zhuān)鹘M劑量分別相當(dāng)于原液0.40、0.36、0.32、0.29、0.26、0.24 mL/只，藥物采用低比稀釋法配制，給藥體積為0.50 mL/只，尾靜脈注射給藥，給藥后觀察動(dòng)物毒性反應(yīng)及死亡情況，連續(xù)觀察72 h，記錄動(dòng)物毒性反應(yīng)狀況和死亡動(dòng)物分布。

表2 小鼠的LD50正式試驗(yàn)結(jié)果

因?yàn)榈谝唤M和第二組死亡動(dòng)物數(shù)均為10 只，故第一組不參與計(jì)算。第二至第六組實(shí)驗(yàn)結(jié)果用改進(jìn)寇氏法計(jì)算LD50值及95%可信限，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 小鼠的LD50測(cè)定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方氨基酸（15）雙肽（2）注射液靜脈注射LD50值為1 974.24 mg/kg，95%可信限為1 874.74～2 073.74 mg/kg。

2.1.2 限值的確定《中國(guó)藥典》2015 版四部［7］通則9301 注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則中規(guī)定，異常毒性的限值可采用小于LD50可信限下限的1/4。本品半數(shù)致死量為1 974.24 mg/kg，95%可信限為1 874.74～2 073.74 mg/kg，LD50可信限下限的1/4為468.68 mg/kg，折合小鼠體重為9.37 mg/20 g·bw，因靜脈注射體積為0.50 mL，即應(yīng)將本品稀釋成18.74 mg/mL。綜上所述，為便于計(jì)算將本品的異常毒性檢查項(xiàng)的限值“取本品，加氯化鈉注射液制備成7 倍的稀釋液（1∶6 稀釋?zhuān)?，依法檢查（《中國(guó)藥典》2015 版四部通則1141 異常毒性檢查法），靜脈注射給藥，應(yīng)符合規(guī)定”。

2.1.3 驗(yàn)證以上述限值進(jìn)行了3 個(gè)批次的檢驗(yàn)，結(jié)果均符合規(guī)定。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 異常毒性檢查法驗(yàn)證

2.2 降壓物質(zhì)檢查法限值的確定

2.2.1 限值確定前研究選取靈敏度測(cè)試合格的貓按照《中國(guó)藥典》2015 版四部通則1145 降壓物質(zhì)檢查法進(jìn)行了兩次預(yù)試驗(yàn)，取復(fù)方氨基酸（15）雙肽（2）注射液（以下簡(jiǎn)稱(chēng)受試樣品）及原研樣品以不同給藥體積對(duì)貓降壓作用進(jìn)行了預(yù)試驗(yàn)，靈敏度測(cè)試及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5-8。

表5 靈敏度測(cè)試第一次預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

表6 降壓物質(zhì)檢查法第一次預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

表7 靈敏度測(cè)試第二次預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

表8 降壓物質(zhì)檢查法第二次預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 限值的確定上述試驗(yàn)結(jié)果表明，該供試品本身有一定的降壓作用，和原研樣品基本一致，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，我們將貓?bào)w重每1 kg 靜脈注射0.5 mL原液作為限值，同樣符合指導(dǎo)原則［7］中“按最大無(wú)降壓反應(yīng)劑量的1/2～1/4 作為劑量限值”這一原則。故將降壓物質(zhì)檢查項(xiàng)設(shè)定為“取本品，依法檢查（《中國(guó)藥典》2015 版四部通則1145 降壓物質(zhì)檢查法），按貓?bào)w重每1 kg 靜脈注射0.5 mL，應(yīng)符合規(guī)定”。

2.2.3 驗(yàn)證以上述限值對(duì)3 個(gè)批次的樣品進(jìn)行了3次驗(yàn)證，見(jiàn)表9-11，結(jié)果均符合規(guī)定。

表9 降壓物質(zhì)檢查法第一次驗(yàn)證試驗(yàn)

表10 降壓物質(zhì)檢查法第二次驗(yàn)證試驗(yàn)

表11 降壓物質(zhì)檢查法第三次驗(yàn)證試驗(yàn)

3 結(jié)論

根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為應(yīng)在原標(biāo)準(zhǔn)安全性檢查項(xiàng)中增加異常毒性及降壓物質(zhì)檢查項(xiàng)。其中異常毒性檢查項(xiàng)限值設(shè)定為“取本品，加氯化鈉注射液制備成7 倍的稀釋液（1∶6 稀釋?zhuān)?，依法檢查（《中國(guó)藥典》2015 版四部通則1141 異常毒性檢查法），靜脈注射給藥，應(yīng)符合規(guī)定”，降壓物質(zhì)檢查項(xiàng)限值設(shè)定為“取本品，依法檢查（《中國(guó)藥典》2015 版四部通則1145 降壓物質(zhì)檢查法），按貓?bào)w重每1 kg靜脈注射0.5 mL，應(yīng)符合規(guī)定”。

4 討論

復(fù)方氨基酸（15）雙肽（2）注射液為腸外營(yíng)養(yǎng)制劑，適用于不能口服或經(jīng)腸道補(bǔ)給營(yíng)養(yǎng)，以及通過(guò)這些途徑補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)不能滿足需要的患者，尤其適用于中度至重度分解代謝狀況的患者。在其原標(biāo)準(zhǔn)中安全性檢查項(xiàng)只收載了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)，不足以起到保證臨床用藥安全的作用。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局在2008 年1 月10 日發(fā)布的《關(guān)于發(fā)布化學(xué)藥品注射劑和多組分生化藥注射劑基本技術(shù)要求的通知》（國(guó)食藥監(jiān)注［2008］7 號(hào)）中提到，涉及到多組分生化藥特性的安全性指標(biāo)應(yīng)訂入標(biāo)準(zhǔn)，如過(guò)敏物質(zhì)、降壓物質(zhì)、異常毒性等?？紤]到本品種為15 種氨基酸組成的水溶液，在合成過(guò)程中存在氨基酸脫羧形成組胺或類(lèi)組胺物質(zhì)的可能，且用理化分析方法受到多種因素干擾［8-9］，難以分析，故考慮增加降壓物質(zhì)檢查項(xiàng)；同時(shí)，考慮到其在生產(chǎn)過(guò)程中有新生雜質(zhì)或污染物的可能并引起不正常的毒性反應(yīng)，故擬增加異常毒性檢查項(xiàng)。