基于支持向量機(jī)模型的中藥揮發(fā)油化學(xué)成分類型與皮膚細(xì)胞毒性關(guān)聯(lián)性研究

楊文國，喬兆穎，戴沭寧，張沁晶，朱學(xué)敏，姚俊宏，陳軍

基于支持向量機(jī)模型的中藥揮發(fā)油化學(xué)成分類型與皮膚細(xì)胞毒性關(guān)聯(lián)性研究

楊文國1，喬兆穎2，戴沭寧2，張沁晶2，朱學(xué)敏3，姚俊宏3，陳軍3，4

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)人工智能與信息技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院，江蘇 南京 210023；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；4.南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023

探尋中藥揮發(fā)油的化學(xué)成分類型與皮膚細(xì)胞毒性之間的關(guān)聯(lián)性，并建立皮膚細(xì)胞毒性預(yù)測(cè)模型。應(yīng)用位于活性表皮的人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT評(píng)價(jià)皮膚毒性，并通過氣相色譜-質(zhì)譜分析得到揮發(fā)油的化學(xué)成分分類。運(yùn)用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)和支持向聯(lián)機(jī)選取特征變量并建立預(yù)測(cè)模型。不同毒性程度中藥揮發(fā)油的單萜化合物、單萜氧化物、倍半萜氧化物和單萜與芳香族復(fù)合結(jié)構(gòu)與中藥揮發(fā)油皮膚細(xì)胞毒性存在顯著關(guān)聯(lián)（＜0.05）。基于上述4種化學(xué)成分進(jìn)行特征構(gòu)造，利用支持向量機(jī)建立的皮膚細(xì)胞毒性預(yù)測(cè)模型具有良好的預(yù)測(cè)性能。支持向量機(jī)模型可用于闡明中藥揮發(fā)油化學(xué)成分類型與皮膚細(xì)胞的關(guān)聯(lián)性。

中藥揮發(fā)油；皮膚細(xì)胞毒性；非參數(shù)統(tǒng)計(jì)；支持向量機(jī)

經(jīng)皮給藥是中藥除口服外的常用給藥途徑，具有給藥方便、血藥濃度平穩(wěn)、避免首過效應(yīng)和胃腸道不良反應(yīng)、可隨時(shí)中止用藥等諸多優(yōu)勢(shì)。但由于皮膚角質(zhì)層的屏障作用，經(jīng)皮給藥生物利用度偏低，嚴(yán)重限制了藥效的發(fā)揮。透皮吸收促進(jìn)劑（penetration enhancers，PE）是目前最常用的解決這一問題的制劑學(xué)手段[1]，而中藥揮發(fā)油是常用的一大類PE[2]，具有促滲作用好、毒性低、藥效協(xié)同的特點(diǎn)。

除促滲作用外，PE皮膚毒性是決定其應(yīng)用前景的主要因素。與常規(guī)的化學(xué)合成PE相比，皮膚毒性相對(duì)較低是中藥揮發(fā)油的主要優(yōu)勢(shì)。前期研究表明，中藥揮發(fā)油的皮膚細(xì)胞毒性遠(yuǎn)低于以氮酮為代表的化學(xué)合成PE[3]。因此，本研究選擇經(jīng)典的、位于活性表皮層的人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT作為模型，考察33種辛味中藥揮發(fā)油的皮膚細(xì)胞毒性，并借助數(shù)據(jù)挖掘和數(shù)學(xué)建模手段分析中藥揮發(fā)油化學(xué)成分類型與皮膚細(xì)胞毒性的關(guān)聯(lián)性。

1 儀器、試藥與細(xì)胞

調(diào)溫電熱器（南通市通州申通電熱器廠），揮發(fā)油提取器，WAY-2S型阿貝折光儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司），BAS-124S型電子天平（德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），INCO108型CO2培養(yǎng)箱（德國Memmert公司），XD-202型倒置顯微鏡（南京江南永新光學(xué)有限公司），SW-CJ-IF型超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），Spectramax M5型多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司），96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（康寧公司），DW-86L338型-80 ℃冰箱（海爾生物醫(yī)療），血細(xì)胞計(jì)數(shù)板（上海求精生化試劑儀器有限公司），EPED-10TF型實(shí)驗(yàn)室超純水器（南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司）。

中藥飲片干姜、高良姜、小茴香、蛇床子、廣藿香、莪術(shù)、蓽澄茄、羌活、細(xì)辛、草果、香附、川芎、荊芥、石菖蒲、丁香、當(dāng)歸、花椒、吳茱萸（批號(hào)分別為20150301、20140701、150401、150601、20141201、20140701、20150416、20150506、20150801、20150412、20141201、20140801、20150618、150601、20141201、20150308、150106、150212），安徽銅陵中藥飲片有限公司；陳皮、檀香、青皮、沒藥、豆蔻、辛夷、烏藥、草果（批號(hào)分別為170101、160927、161216、161209、161109、161206、161130、161016），蘇州市天靈中藥飲片有限公司；楓香脂（批號(hào)170119），南京海源中藥飲片有限公司；肉桂（批號(hào)150121），亳州市永剛飲片有限公司；藁本（批號(hào)161018012），江西濟(jì)世堂藥業(yè)有限公司；香薷（批號(hào)111126006），北京仟草中藥飲片有限公司；紫蘇葉（批號(hào)151201），東營百佳益中藥飲片有限公司。松節(jié)油（批號(hào)20140924），永華化學(xué)科技（江蘇）有限公司；薄荷油（批號(hào)150326），黃山天目薄荷藥業(yè)有限公司。胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，批號(hào)150624），0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（上海立菲生物技術(shù)有限公司，批號(hào)1828698），青霉素-鏈霉素溶液（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)C0222），MTT細(xì)胞毒性試劑盒（上海生工生物工程有限公司，批號(hào)150614），二甲基亞砜（DMSO，江蘇凱基生物股份有限公司，批號(hào)130815），無水硫酸鈉（南京化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)150302367D），超純水（實(shí)驗(yàn)室自制），其他試劑均為分析純。

人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT，購自江蘇凱基生物股份有限公司，以DMEM（高糖）培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素-鏈霉素溶液）培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油制備及氣相色譜-質(zhì)譜分析

除松節(jié)油和薄荷油外，采用水蒸氣蒸餾法提取其余31種中藥揮發(fā)油[3-4]。

2.2 揮發(fā)油對(duì)HaCaT細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

取對(duì)數(shù)生長期的HaCaT細(xì)胞，制成單個(gè)細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度，以7×103個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)過夜，分別加入不同濃度揮發(fā)油溶液，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。以不加PE溶液的細(xì)胞懸液作為陰性對(duì)照組，并以不含細(xì)胞的培養(yǎng)基作為空白組調(diào)零。處理24 h后，每孔加入含0.5 mg/mL MTT的不含胎牛血清培養(yǎng)基120 μL，培養(yǎng)4 h，吸棄上清，每孔加DMSO 150 μL，搖床10 min搖勻，于酶標(biāo)儀570 nm波長處測(cè)定吸光度，計(jì)算存活率和IC50。存活率（%）＝（A揮發(fā)油組－A空白組）÷（A陰性對(duì)照組－A空白組）×100%。根據(jù)IC50將揮發(fā)油毒性分為小、中、大3類，結(jié)果見表1。

2.3 揮發(fā)油化學(xué)成分毒性非參數(shù)統(tǒng)計(jì)

以Y代表毒性，X1～X12依次代表單萜化合物、單萜氧化物、倍半萜化合物、倍半萜氧化物、二萜及其氧化物、脂肪族及脂肪酸類成分、芳香族成分、單萜與芳香族復(fù)合結(jié)構(gòu)、倍半萜與芳香族復(fù)合結(jié)構(gòu)、單萜氧化物與芳香族復(fù)合結(jié)構(gòu)、苯酞類成分和其他。利用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)X1～X12進(jìn)行分析，根據(jù)偏態(tài)系數(shù)發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)均呈右偏分布。單樣本Kolmogorov- Smirnov擬合優(yōu)度檢驗(yàn)適合在分布未知和樣本量比較小的條件下分析樣本分布與正態(tài)分布間是否存在顯著差異，從而判定變量是否服從正態(tài)分布。檢驗(yàn)結(jié)果顯示，值均小于0.05，可知X1～X12均不服從正態(tài)分布。由于樣本數(shù)據(jù)均不服從正態(tài)分布且根據(jù)毒性分類后每類樣品數(shù)據(jù)較少，故采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)的Kruskal-Wallis檢驗(yàn)進(jìn)行分析，結(jié)果表明單萜化合物、單萜氧化物、倍半萜氧化物、單萜與芳香族復(fù)合結(jié)構(gòu)的含量與揮發(fā)油的毒性強(qiáng)度具有關(guān)聯(lián)性，見表2。

表1 33種中藥揮發(fā)油的皮膚細(xì)胞毒性

中藥IC50/（μg/mL）毒性主要化學(xué)成分 荊芥304.27小單萜氧化物90.95%、單萜化合物3.74%、脂肪族及脂肪酸類成分3.36% 花椒333.69小單萜化合物30.44%、單萜氧化物51.18%、脂肪族及脂肪酸類成分15.98% 小茴香332.78小芳香族成分91.89%、單萜化合物5.34%、單萜氧化物1.55% 豆蔻123.10小單萜氧化物74%、單萜化合物18.85%、倍半萜化合物3.96% 細(xì)辛161.80小芳香族成分48.68%、單萜與芳香族復(fù)合結(jié)構(gòu)26.71%、單萜化合物17.02%、單萜氧化物7.73% 丁香192.25小芳香族成分97.67%、倍半萜化合物1.79% 藁本138.10小芳香族成分90.53%、單萜化合物4.61%、單萜氧化物3.16% 薄荷油97.01小單萜氧化物75.76%、單萜化合物4.61%、脂肪族及脂肪酸類成分0.3% 石菖蒲65.42中芳香族成分59.36%、倍半萜氧化物23.74%、倍半萜與芳香族復(fù)合結(jié)構(gòu)3.58% 陳皮49.74中單萜化合物96.78%、倍半萜化合物1.88% 草果68.75中單萜氧化物52.07%、脂肪族及脂肪酸類成分14.81%、芳香族成分11.36%、單萜化合物7.32% 蓽澄茄69.89中單萜化合物51.43%、單萜氧化物33.63、倍半萜氧化物4.07% 楓香脂39.77中單萜氧化物46.36%、倍半萜化合物23.47%、單萜化合物18.77% 香薷50.58中芳香族成分41.74%、單萜氧化物17.66%、倍半萜化合物15.46%、單萜氧化物與芳香族復(fù)合結(jié)構(gòu)13.93% 青皮37.74中單萜化合物62.38%、倍半萜化合物14.59%、單萜與芳香族化合結(jié)構(gòu)13.34% 莪術(shù)39.63中倍半萜氧化物71.34%、芳香族成分10.07%、倍半萜化合物6.65% 辛夷31.66中單萜氧化物34.04%、倍半萜化合物27.67%、單萜化合物22.29% 吳茱萸49.22中單萜化合物71.99%、單萜氧化物9.9%、倍半萜化合物7.28%、倍半萜氧化物4.88% 川芎30.21中苯酞類成分48.4%、芳香族成分13.79%、單萜氧化物11.99%、倍半萜化合物10.19%、單萜化合物7.57% 沒藥28.13中倍半萜化合物36.14%、單萜化合物15.25%、芳香族成分12.54%、倍半萜氧化物8.87% 當(dāng)歸34.44中苯酞類成分83.86%、單萜化合物7.55%、芳香族成分2.54%、倍半萜化合物1.45% 松節(jié)油32.55中單萜化合物58.37%、單萜氧化物36.46%、單萜與芳香族復(fù)合結(jié)構(gòu)3.81% 高良姜42.75中單萜氧化物60.88%、倍半萜化合物18.73%、單萜化合物9.63% 蛇床子29.92中單萜化合物84.45%、單萜氧化物9.86%、倍半萜化合物1.42% 烏藥22.29中芳香族成分45.9%、倍半萜化合物24.98%、倍半萜氧化物6.89%、單萜化合物6.68% 羌活24.64中單萜化合物85.03%、單萜與芳香族復(fù)合結(jié)構(gòu)6.45%、單萜氧化物4.37% 檀香16.57大倍半萜氧化物84.46%、芳香族成分4.02% 紫蘇葉23.26大芳香族成分86.54%、倍半萜化合物7.13%、倍半萜氧化物4.51% 廣藿香14.15大倍半萜氧化物55.84%、倍半萜化合物41.9% 干姜19.72大倍半萜化合物59.76%、倍半萜與芳香族復(fù)合結(jié)構(gòu)8.97%、單萜化合物14.07% 香附14.40大倍半萜氧化物50.59%、倍半萜化合物31.81%、芳香族成分7.53% 白芷11.32大脂肪族及脂肪酸類成分64.59%、倍半萜化合物23.96%、倍半萜氧化物5.12% 肉桂12.47大芳香族成分63.39%、倍半萜化合物33.75%

2.4 利用支持向量機(jī)進(jìn)行毒性強(qiáng)度預(yù)測(cè)

支持向量機(jī)（support vector machine，SVM）是一種針對(duì)小樣本問題而提出的機(jī)器學(xué)習(xí)方法，可以在樣本有限的情況下獲得最優(yōu)解。SVM利用非線性變換將原始變量映射到高維特征空間，在其中構(gòu)造線性分類函數(shù)，既保證了模型具有良好的泛化能力，又解決了“維數(shù)災(zāi)難”的問題，可用來解決分類、模式識(shí)別、回歸、擬合等問題。本研究采用Libsvm工具箱，調(diào)用相關(guān)的SVM模式識(shí)別與回歸機(jī)軟件包，進(jìn)行相應(yīng)的回歸與預(yù)測(cè)。根據(jù)非參數(shù)檢驗(yàn)得知，不同毒性的揮發(fā)油中X1、X2、X4、X8含量顯著不同。利用SVM算法，根據(jù)X1、X2、X4、X8含量對(duì)揮發(fā)油的毒性強(qiáng)度（大、中、?。┻M(jìn)行預(yù)測(cè)，建立中藥揮發(fā)油分類模型，并對(duì)性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。以隨機(jī)產(chǎn)生29個(gè)樣本為訓(xùn)練集，4個(gè)樣本為測(cè)試集，創(chuàng)建并訓(xùn)練SVM模型，采用RBF核函數(shù)。首先利用交叉驗(yàn)證方法尋找最佳的參數(shù)c（懲罰因子）和參數(shù)g（RBF核函數(shù)中的方差），然后利用最佳參數(shù)對(duì)模型進(jìn)行訓(xùn)練。MATLAB訓(xùn)練結(jié)果見圖1。

結(jié)果顯示測(cè)試集的準(zhǔn)確率為100%，表明可通過SVM算法，根據(jù)中藥揮發(fā)油的單萜化合物、單萜氧化物、倍半萜氧化物、單萜與芳香族化合結(jié)構(gòu)的含量，對(duì)揮發(fā)油的毒性類別（小、中、大）進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確程度良好，具有現(xiàn)實(shí)操作性。

表2 不同類型揮發(fā)油化學(xué)成分毒性Kruskal-Wallis檢驗(yàn)結(jié)果

變量化學(xué)成分類型毒性強(qiáng)度*秩平均值P值 X1單萜化合物118.75 219.610.026 3 8.29 X2單萜氧化物123.50 216.920.023 3 9.79 X3倍半萜化合物110.50 219.110.092 319.00 X4倍半萜氧化物1 7.38 218.940.003 323.00 X5二萜及其氧化物116.00 216.890.459 318.43 X6脂肪族及脂肪酸類成分116.25 215.920.509 320.64 X7芳香族成分116.06 216.690.837 318.86 X8單萜與芳香族復(fù)合結(jié)構(gòu)119.00 218.720.046 310.29 X9倍半萜與芳香族復(fù)合結(jié)構(gòu)113.50 217.280.160 320.29 X10單萜氧化物與芳香族復(fù)合結(jié)構(gòu)117.13 217.720.536 315.00 X11苯酞類成分117.13 217.720.651 315.00 X12其他115.00 216.830.247 319.71

注：*1、2、3分別表示揮發(fā)油毒性小、中、大

圖1 測(cè)試集SVM函數(shù)結(jié)果對(duì)比

2.5 利用支持向量回歸機(jī)進(jìn)行回歸預(yù)測(cè)

實(shí)際中需要對(duì)中藥揮發(fā)油的毒性進(jìn)行更加精確的預(yù)測(cè)，故采用支持向量回歸機(jī)方法對(duì)毒性的具體數(shù)值進(jìn)行預(yù)測(cè)。模型采用RBF核函數(shù)，然后利用交叉驗(yàn)證方法尋找最佳的參數(shù)c和參數(shù)g，并利用最佳參數(shù)訓(xùn)練模型。為避免偶然性，將33個(gè)樣本分為10組，其中7組樣本容量為3，另3組樣本容量為4，每組輪流做測(cè)試集，進(jìn)行10次測(cè)試，結(jié)果見表3。訓(xùn)練集R2平均值為0.715，MSE平均值為0.095，擬合程度良好。預(yù)測(cè)集R2平均值為0.727，MSE平均值為0.099，預(yù)測(cè)性能良好。因此，利用SVM算法對(duì)中藥揮發(fā)油的毒性進(jìn)行回歸預(yù)測(cè)是可行且效果優(yōu)秀的，模型仍有改進(jìn)空間，但總體模型與真實(shí)值已高度接近。

表3 支持向量回歸機(jī)測(cè)試結(jié)果

序號(hào)訓(xùn)練集 測(cè)試集 R2MSE R2MSE 10.7270.089 0.6030.201 20.6940.103 0.8750.102 30.6640.113 0.7400.095 40.6180.124 0.5740.105 50.6640.118 0.5820.113 60.6530.127 0.9080.014 70.6880.108 0.6720.071 80.6590.124 0.7120.177 90.9020.029 0.7320.084 100.9270.014 0.8730.032 平均值0.7150.095 0.7270.099

3 討論

對(duì)經(jīng)皮給藥而言，大部分藥物因不易透過皮膚而導(dǎo)致生物利用度過低甚至無法發(fā)揮藥效。應(yīng)用PE是目前解決這一問題的最主要手段，而中藥揮發(fā)油為常用PE。中藥揮發(fā)油總數(shù)約有300種，目前作為PE應(yīng)用的僅34種[5]。如何從中藥揮發(fā)油中遴選安全有效的PE是目前研究的難點(diǎn)。

除透皮吸收促進(jìn)效果外，安全性是決定PE應(yīng)用的另一主要因素，皮膚細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)是預(yù)測(cè)PE安全性的一個(gè)重要因素。中藥揮發(fā)油類成分以萜類成分為主，根據(jù)文獻(xiàn)[6]可分為12類。本研究在皮膚細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用數(shù)學(xué)模型，深入探討中藥揮發(fā)油皮膚細(xì)胞毒性與其物質(zhì)基礎(chǔ)即成分類型之間的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單萜化合物、單萜氧化物、倍半萜氧化物等成分類型與皮膚細(xì)胞毒性的相關(guān)性最高，初步闡明了中藥揮發(fā)油毒性作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)于開發(fā)高效低毒的中藥揮發(fā)油PE具有重要意義。

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Study on Correlation Between Chemical Components and Cytotoxicity of TCM Essential Oils Based on SVM

YANG Wenguo1, QIAO Zhaoying2, DAI Shuning2, ZHANG Qinjing2, ZHU Xuemin3, YAO Junhong3, CHEN Jun3,4

To explore the correlation between chemical components and skin cytotoxicity of TCM essential oils; To establish a skin prediction model.The cytotoxicity was evaluated by HaCaT cells located in the active epidermis. The chemical components of TCM essential oils was investigated by GC-MS analysis. The non-parametric statistics was used for feature selection and support vector machine (SVM) was used to establish the prediction model.Monoterpenes, oxygenated monoterpenes, oxygenated sesquiterpene and the combined structure of monoterpene and aromatic had significant correlation with the cytotoxicity (<0.05). Based on the above four chemical components for feature construction, the established skin cytotoxicity prediction model using SVM had good prediction performance. Conclusion SVM can be used to clarify the correlation between chemical components and cytotoxicity of TCM essential oils.

TCM essential oils; skin cytotoxicity; non-parametric statistics; support vector machine

R285.5；R2-05

A

1005-5304(2020)09-0121-05

10.3969/j.issn.1005-5304.201812016

江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心重點(diǎn)項(xiàng)目（ZDXMHT-1-15）；江蘇省中醫(yī)藥局科研專項(xiàng)（ZX2016D1）；江蘇省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（201810315027Z）；江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程（2014年）；南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)優(yōu)勢(shì)學(xué)科專項(xiàng)培育基金（2017年）

陳軍，E-mail：chenjun75@163.com

（2018-12-02）

（2019-01-28；編輯：陳靜）