HPLC同時測定紫丹參藥材中8種成分含量

管小軍，厲君，黃娜娜，浦滇，鄧雪琪，李鳳仙，李嘉新，李俊

HPLC同時測定紫丹參藥材中8種成分含量

管小軍1，厲君2，黃娜娜1，浦滇1，鄧雪琪1，3，李鳳仙1，李嘉新1，李俊1，3

1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；2.云南楚雄天利藥業(yè)有限公司，云南 楚雄 651208；3.云南省民族特色養(yǎng)生理論與健康產(chǎn)品工程實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500

建立同時測定紫丹參藥材中丹參素鈉、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA含量的方法，為紫丹參藥材的質(zhì)量評價提供參考。采用ACE Neptune-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長275 nm，柱溫25 ℃，同時測定10批紫丹參藥材中丹參素鈉，迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA的含量。丹參素鈉、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA進(jìn)樣量分別在0.041 2～0.412 0、0.030 8～0.308 0、0.056 8～0.568 0、1.010 0～10.100 0、0.015 9～0.159 0、0.035 2～0.352 0、0.016 4～0.164 0、0.042 0～0.420 0 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（2為0.999 4～0.999 8），平均加樣回收率為97.79%～102.33%（RSD＜3%）。本研究建立的方法靈敏、準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好，可用于紫丹參藥材的質(zhì)量評價。

紫丹參；多成分同時測定；含量測定；高效液相色譜法

紫丹參始載于《滇南本草》，為唇形科植物云南鼠尾草C. H. Wrigh的干燥根和根莖，又名滇丹參、云南鼠尾草、丹參、小丹參、山檳榔、小紅參、小紅黨參、小紅草烏、奔馬草等，彝族稱為呆乃色，為多年生草本植物，主要分布于云南、貴州、四川等地[1]，1974年起收載于《云南省藥品標(biāo)準(zhǔn)》。紫丹參具有活血化瘀、清熱解毒、鎮(zhèn)痛、安神之功，可擴(kuò)張血管，增加冠狀動脈血流量，臨床主要用于冠心病、高血壓、動脈粥樣硬化等心腦血管疾病[2]。目前對紫丹參的研究報(bào)道多集中于紫丹參化學(xué)成分研究，在采用現(xiàn)代分析技術(shù)進(jìn)行質(zhì)量控制研究方面比較欠缺。紫丹參的藥效活性成分主要為水溶性的丹酚酸類和脂溶性的丹參酮類[3]。文獻(xiàn)報(bào)道丹參質(zhì)量控制多采用HPLC測定水溶性或脂溶性成分，指標(biāo)成分多選用丹酚酸B、丹參酮ⅡA等，但方法較為繁瑣[4-7]。本研究在此基礎(chǔ)上采用HPLC同時測定紫丹參中4種水溶性成分丹參素鈉、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B及4種脂溶性成分二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA，更全面控制紫丹參藥材的質(zhì)量，以期為云南紫丹參藥材的整體質(zhì)量控制及優(yōu)選GAP種植基地提供參考。

1 儀器與試藥

HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金怡儀器科技有限公司），百分之一電子天平（XCC-2002，昆明金瑞克電子衡器有限公司），BSM120.4電子天平（萬分之一，上海卓精電子科技有限公司），AB265-S十萬分之一電子天平（METTLER TOLEDO），SKSSOOH超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司），超聲波清洗機(jī)（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司），LC-2030液相色譜儀、UV檢測器（日本SHIMADZU公司）。

丹參素鈉（批號110855-201604，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.80%）、迷迭香酸（批號111871-201706，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.80%）、丹酚酸B（批號111562-201716，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.80%）、隱丹參酮（批號110852-201807，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.80%）、丹參酮Ⅰ（批號110867-201607，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.80%）、丹參酮ⅡA（批號110766-201721，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.80%），中國食品藥品檢定研究院；紫草酸（批號19053003，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.87%）、二氫丹參酮Ⅰ（批號19040211，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.80%），森嵐科技有限公司。甲醇（分析純，批號20190601，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司），甲醇（色譜純，默克股份兩合公司，批號IO917307743），乙腈（色譜純，默克股份兩合公司，批號JA059730），自制超純水，娃哈哈純凈水。10批紫丹參藥材，均購自昆明螺螄灣藥材市場，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)陳紹田副研究員鑒定為唇形科植物云南鼠尾草C. H. Wrigh的干燥根和根莖，樣品來源信息見表1。

表1 紫丹參藥材樣品來源信息

批號來源產(chǎn)地 20180501云南楚雄云南 20190501云南楚雄云南 20190601云南玉溪云南 20190602云南瑞麗云南 20190603云南曲靖云南 20190604云南曲靖云南 20190605云南螺螄灣云南 20190606云南昭通云南 20190607云南螺螄灣云南 20190608云南螺螄灣云南

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品貯備液

取丹參素鈉、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA對照品適量，精密稱定，加甲醇配制成濃度分別為0.042 0、0.030 8、0.056 8、1.010 0、0.159 6、0.035 2、0.016 8、0.042 0 mg/mL的對照品貯備液。

2.1.2 混合對照品溶液

精密移取混合對照品貯備液適量，置于10 mL容量瓶中，加適量甲醇定容至刻度，得每1 mL含丹參素鈉16.48 μg、迷迭香酸12.32 μg、紫草酸22.72 μg、丹酚酸B 404.00 μg、二氫丹參酮Ⅰ 6.38 μg、隱丹參酮14.08 μg、丹參酮Ⅰ 6.66 μg、丹參酮ⅡA16.80 μg的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液

取紫丹參樣品（批號20180501）粉末（過3號篩）0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，置水浴鍋中加熱回流30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 陰性對照溶液

取適量甲醇，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱為ACE Neptune-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫（0～32 min，10%～38%乙腈；32～34min，38%～59%乙腈；34～40 min，59%乙腈；40～60 min，59%～90%乙腈；60～70 min，90%～10%乙腈），流速1.0 mL/min，檢測波長275 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL。理論塔板數(shù)按丹酚酸B峰計(jì)算不低于6000。

2.3 專屬性試驗(yàn)

精密量取“2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示檢測成分色譜峰與相鄰色譜峰的分離度良好，對稱因子為0.90～1.10，理論塔板數(shù)以丹酚酸B峰計(jì)均大于6000。供試品色譜圖中，在與對照品色譜圖丹參素鈉（峰1）、迷迭香酸（峰2）、紫草酸（峰3）、丹酚酸B（峰4）、二氫丹參酮Ⅰ（峰5）、隱丹參酮（峰6）、丹參酮Ⅰ（峰7）及丹參酮ⅡA（峰8）相應(yīng)位置上，均有相同保留時間的色譜峰，陰性對照溶液在相應(yīng)保留時間處未見色譜峰，不干擾測定，表明系統(tǒng)適用性良好，方法專屬性良好。色譜見圖1。

注：A.混合對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.丹參素鈉；2.迷迭香酸；3.紫草酸；4.丹酚酸B；5.二氫丹參酮Ⅰ；6.隱丹參酮；7.丹參酮Ⅰ；8.丹參酮ⅡA

2.4 線性關(guān)系考察

取“2.1.1”項(xiàng)下對照品貯備液0、1、2、4、6、8、10 mL，置于10 mL容量瓶中，加入適量甲醇，定容至刻度，搖勻。分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以對照品濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積積分值為縱坐標(biāo)，得到各待測成分的線性回歸方程和線性范圍，各成分2均大于0.999，表明線性關(guān)系良好。結(jié)果見表2。

表2 8種成分線性關(guān)系考察結(jié)果

成分回歸方程R2線性范圍/μg 丹參素鈉Y＝6640.4X－1417.70.999 80.041 2～0.412 0 迷迭香酸Y＝15 809X－2439.20.999 80.030 8～0.308 0 紫草酸Y＝12 800X－3089.90.999 80.056 8～0.568 0 丹酚酸BY＝9002.1X－26 2590.999 4 1.010 0～10.100 0 二氫丹參酮ⅠY＝32 752X－3088.60.999 80.015 9～0.159 0 隱丹參酮Y＝41 157X－30030.999 80.035 2～0.352 0 丹參酮ⅠY＝37 543X－1817.70.999 90.016 4～0.164 0 丹參酮ⅡAY＝55 733X－81870.999 80.042 0～0.420 0

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下混合對照品溶液10 μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，重復(fù)6次，計(jì)算丹參素鈉、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA峰面積RSD分別為0.69%、0.48%、0.36%、0.31%、0.31%、0.33%、0.27%、0.34%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液10 μL，分別于制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h注入液相色譜儀，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算丹參素鈉、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA峰面積RSD分別為1.90%、2.84%、2.72%、2.22%、2.77%、3.38%、1.87%、1.85%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取紫丹參樣品（批號20180501），精密稱定6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，測得丹參素鈉、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA的峰面積值，計(jì)算其含量RSD分別為0.92%、0.67%、2.84%、1.75%、3.97%、0.62%、0.29%、0.73%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量（丹參素鈉0.083%、迷迭香酸0.215%、紫草酸0.244%、丹酚酸B 4.908%、二氫丹參酮Ⅰ 0.133%、隱丹參酮0.264%、丹參酮Ⅰ 0.064%、丹參酮ⅡA0.296%）的紫丹參藥材粉末0.5 g，精密稱定，精密加入丹參素鈉、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA對照品適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法，平行制備6份，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以外標(biāo)法計(jì)算含量，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3～表10。

表3 丹參素鈉加樣回收率試驗(yàn)

取樣量 /g樣品中含量 /mg加入量 /mg測得量 /mg回收率 /%平均回收率 /%RSD /% 0.250 10.207 80.210 00.417 799.95598.321.36 0.250 20.207 90.210 00.410 096.220 0.249 80.207 60.210 00.415 198.816 0.250 00.207 80.210 00.412 397.419 0.250 10.207 80.210 00.413 097.681 0.250 00.207 80.210 00.417 399.801

表4 迷迭香酸加樣回收率試驗(yàn)

取樣量 /g樣品中含量 /mg加入量 /mg測得量 /mg回收率 /%平均回收率 /%RSD /% 0.250 10.537 70.543 01.092 0102.07999.851.19 0.250 20.537 90.543 01.082 1100.214 0.249 80.537 10.543 01.079 9 99.972 0.250 00.537 50.543 01.072 5 98.531 0.250 10.537 70.543 01.079 3 99.742 0.250 00.537 50.543 01.072 8 98.586

表5 紫草酸加樣回收率試驗(yàn)

取樣量 /g樣品中含量 /mg加入量 /mg測得量 /mg回收率 /%平均回收率 /%RSD /% 0.250 10.609 50.610 01.227 7101.350100.151.80 0.250 20.609 70.610 01.197 9 96.428 0.249 80.608 80.610 01.227 8101.477 0.250 00.609 30.610 01.216 6 99.564 0.250 10.609 50.610 01.229 0101.557 0.250 00.609 30.610 01.222 4100.522

表6 丹酚酸B加樣回收率試驗(yàn)

取樣量 /g樣品中含量 /mg加入量 /mg測得量 /mg回收率 /%平均回收率 /%RSD /% 0.250 112.275 712.330 024.846 2101.951101.352.25 0.250 212.280 612.330 025.251 1105.195 0.249 812.260 912.330 024.679 4100.717 0.250 012.270 812.330 024.714 2100.920 0.250 112.275 712.330 024.291 8 97.454 0.250 012.270 812.330 024.830 4101.863

表7 二氫丹參酮Ⅰ加樣回收率試驗(yàn)

取樣量 /g樣品中含量 /mg加入量 /mg測得量 /mg回收率 /%平均回收率 /%RSD /% 0.250 10.332 00.330 00.667 1101.514102.330.77 0.250 20.332 00.330 00.672 3103.116 0.249 80.332 00.330 00.667 1101.555 0.250 00.332 00.330 00.672 3103.116 0.250 10.332 00.330 00.667 1101.555 0.250 00.332 00.330 00.672 3103.116

表8 隱丹參酮加樣回收率試驗(yàn)

取樣量 /g樣品中含量 /mg加入量 /mg測得量 /mg回收率 /%平均回收率 /%RSD /% 0.250 10.660 80.660 01.351 7104.694101.571.52 0.250 20.661 00.660 01.325 0100.598 0.249 80.660 00.660 01.330 5101.594 0.250 00.660 50.660 01.319 7 99.883 0.250 10.660 80.660 01.326 0100.787 0.250 00.660 50.660 01.332 6101.840

表9 丹參酮Ⅰ加樣回收率試驗(yàn)

取樣量 /g樣品中含量 /mg加入量 /mg測得量 /mg回收率 /%平均回收率 /%RSD /% 0.250 10.160 80.160 00.318 898.71197.790.64 0.250 20.160 90.160 00.317 497.816 0.249 80.160 60.160 00.317 397.932 0.250 00.160 80.160 00.315 396.565 0.250 10.160 80.160 00.317 497.839 0.250 00.160 80.160 00.317 397.858

表10 丹參酮ⅡA加樣回收率試驗(yàn)

取樣量 /g樣品中含量 /mg加入量 /mg測得量 /mg回收率 /%平均回收率 /%RSD /% 0.250 10.739 50.740 01.485 7100.835100.080.88 0.250 20.739 80.740 01.480 5100.095 0.249 80.738 70.740 01.485 3100.903 0.250 00.739 30.740 01.468 9 98.600 0.250 10.739 50.740 01.473 8 99.217 0.250 00.739 30.740 01.485 2100.798

2.9 樣品含量測定

分別取不同批號的紫丹參樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法每批樣品同時制備3份供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，測定峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算樣品中丹參素鈉、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA的含量，結(jié)果見表11。

表11 紫丹參樣品中8種成分含量測定結(jié)果（mg/g，n＝3）

批號丹參 素鈉迷迭 香酸紫草酸丹酚 酸B二氫丹 參酮Ⅰ隱丹 參酮丹參 酮Ⅰ丹參 酮ⅡA 201805010.0840.2160.2354.7760.1410.2680.0640.299 201905010.0630.2570.0975.9540.0530.0960.0120.105 201906010.0490.1690.0874.2160.0330.0620.0200.150 201906020.0710.2290.1176.5780.1040.0620.0120.122 201906030.0710.2780.1206.3690.0730.2030.0570.351 201906040.0400.1000.0863.1070.1560.1800.0340.212 201906050.0581.9860.8094.6200.0530.4430.0880.451 201906060.0870.1450.1773.5950.0380.1280.0180.153 201906070.0170.0170.0360.6410.0170.2350.0130.254 201906080.0570.2150.0825.0730.1260.0370.0080.061

3 討論

本試驗(yàn)考察了流動相（甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-1%醋酸水溶液）、柱溫（20、25、30 ℃）、流速（0.8、1.0、1.2 mL/min），采用二極管陣列檢測器，在波長200～400 nm范圍對各成分進(jìn)行全波長掃描，綜合考慮，最后選擇275 nm為檢測波長，流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫，檢測波長275 nm，柱溫25 ℃，在該條件下所得色譜圖的分離效果、峰形、峰數(shù)等均較好。

以8種化合物的含量作為考察指標(biāo)，采用單因素法，考察提取方式（超聲法、水浴加熱回流法）、提取溶劑（50%、70%、80%甲醇水溶液及100%甲醇）、提取時間（10、20、30 min），最終確定紫丹參樣品提取方法為100%甲醇回流提取30 min，此條件下目標(biāo)成分提取較完全，提取效率高，干擾雜質(zhì)峰較少。

由含量測定結(jié)果可以看出，不同批次的紫丹參各成分含量差異較大。批號20190501、20190601、20190608紫丹參藥材的丹參酮類成分（二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ及丹參酮ⅡA）之和低于3.0 mg/g，與其他批次樣品有較大差距；批號20190607紫丹參藥材中丹參素鈉、迷迭香酸、紫草酸及丹酚酸B含量較其他批次藥材均有較大差異。

不同來源的紫丹參藥材各成分含量差異顯著，有必要嚴(yán)格控制紫丹參藥材產(chǎn)地或來源，以保證產(chǎn)品質(zhì)量和療效。本研究建立的方法可以同時測定紫丹參中的8種成分，包括以丹酚酸B為代表的水溶性成分和以丹參酮ⅡA為代表的脂溶性成分，且保留時間穩(wěn)定，分離度高，測定結(jié)果準(zhǔn)確，方法精密度高，可為紫丹參的質(zhì)量控制提供參考。

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Simultaneous Determination of 8 Components in Purple Salviae Miltiorrhizae et Rhizoma by HPLC

GUAN Xiaojun1, LI Jun2, HUANG Nana1, PU Dian1, DENG Xueqi1,3, LI Fengxian1, LI Jiaxin1, LI Jun1,3

To establish a method for the simultaneous determination of tanshinone sodium, rosemary acid, shikonic acid, salvianolic acid B, dihydrotanshinone Ⅰ, cryptotanshinone, tanshinone Ⅰ, tanshinone IIAin purple Salviae Miltiorrhizae et Rhizoma; To provide reference for its quality evaluation.An ACE Neptune- C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) was used. Gradient elution with acetonitrile-0.1% phosphoric acid aqueous solution was set as mobile phase. The flow rate was 1.0 mL/min. The detection wavelength was 275 nm. The column temperature was 25 ℃. Contents of tanshinol sodium, rosemary acid, shikonic acid, salvianolic acid B, dihydrotanshinone Ⅰ, cryptotanshinone, tanshinone Ⅰ and tanshinoneⅡAin 10 batches of purple Salviae Miltiorrhizae et Rhizoma were detected.The mass concentration of tanshinol sodium, rosemary acid, shikonic acid, salvianolic acid B, dihydrotanshinone Ⅰ, cryptotanshinone, tanshinone Ⅰ and tanshinone ⅡAwere 0.041 2?0.412 0, 0.030 8?0.308 0, 0.056 8?0.568 0, 1.010 0?10.100 0, 0.015 9?0.159 0, 0.035 2?0.352 0, 0.016 4?0.164 0, 0.042 0? 0.420 0 μg, respectively, which showed a good linear relationship with the peak area (2were 0.999 4?0.999 8), and the average sample recovery was among 97.79%?102.33% (RSD<3%).This method is sensitive, accurate, reliable and reproducible, which can be used for the quality evaluation of purple Salviae Miltiorrhizae et Rhizoma.

purple Salviae Miltiorrhizae et Rhizoma; multi-component simultaneous measurement; content determination; HPLC

R284.1

A

1005-5304(2020)09-0082-05

10.3969/j.issn.1005-5304.202002080

云南省重大科技專項(xiàng)（2018ZF001）

李俊，E-mail：411790624@qq.com

（2020-02-06）

（2020-03-06；編輯：陳靜）