混合探針?lè)ㄔu(píng)價(jià)天龍通心方對(duì)大鼠代謝酶活性的影響

苗蘭，林力，張穎，孫明謙，劉建勛，付建華

論著·實(shí)驗(yàn)研究

混合探針?lè)ㄔu(píng)價(jià)天龍通心方對(duì)大鼠代謝酶活性的影響

苗蘭，林力，張穎，孫明謙，劉建勛，付建華

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，中藥藥理北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091

為預(yù)防藥物相互作用導(dǎo)致的臨床合并用藥隱患，初步探討復(fù)方天龍通心方對(duì)大鼠體內(nèi)藥物代謝酶的影響。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組和天龍通心組，連續(xù)灌胃給藥14 d后再給予CYP1A2（咖啡因）、CYP2C6（氯沙坦）、CYP2C11（奧美拉唑）、CYP2D2（右美沙芬）和CYP3A1/2（咪達(dá)唑侖）混合探針?biāo)?，檢測(cè)給藥后不同時(shí)間點(diǎn)各探針?biāo)幖捌涮禺惔x底物的血藥濃度，通過(guò)比較各探針?biāo)幣c代謝物藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)及代謝率（metablite/probe）變化，評(píng)價(jià)連續(xù)給予天龍通心方對(duì)大鼠體內(nèi)CYP450代謝酶活性的影響。與空白對(duì)照組比較，連續(xù)給予大鼠天龍通心方后奧美拉唑峰濃度、體內(nèi)暴露量均顯著下降，代謝率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；探針?biāo)幙Х纫蜻_(dá)峰時(shí)間顯著推遲，代謝物和探針?biāo)幹龋╮atio）下降30%，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；咪噠唑侖及代謝產(chǎn)物1-羥基咪達(dá)唑侖達(dá)峰時(shí)間均延遲，而峰濃度、體內(nèi)暴露水平均顯著下降，原型藥咪噠唑侖清除率顯著升高。其他各組探針底物及其代謝產(chǎn)物主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)及代謝率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。重復(fù)給予復(fù)方天龍通心方對(duì)大鼠體內(nèi)CYP2C11（人體CYP2C19）可能存在一定的誘導(dǎo)作用，而對(duì)CYP1A2、CYP2C6、CYP2D2和CYP3A1/2無(wú)顯著影響，初步提示臨床應(yīng)用天龍通心方時(shí)應(yīng)避免與經(jīng)CYP2C19代謝的藥物合并使用。

天龍通心方；CYP450；探針底物；LC-MS/MS；代謝活性；大鼠

天龍通心方由紅景天、紅參、丹參、川芎、龍血竭、冰片6味中藥組成，主要針對(duì)胸痹（冠心?。馓撗霾C(jī)特點(diǎn)而設(shè)，旨在發(fā)揮益氣活血、通絡(luò)止痛之功，臨床治療胸痛胸悶、心悸氣短、倦怠乏力之癥。前期藥效學(xué)研究表明，該藥可明顯減輕心肌梗死程度，縮小梗死面積，減輕梗死區(qū)質(zhì)量，對(duì)心肌缺血所致心肌梗死有明確的保護(hù)作用，并具有抑制血小板聚集和血栓形成、降低血液黏度作用[1]。此外，針對(duì)天龍通心方還進(jìn)行了體內(nèi)外藥物化學(xué)成分的分析，體外定量18種主要成分，能完整描繪藥代曲線的入血成分有7種，分別是丹酚酸A、丹酚酸B、紫草酸、丹參素、紅景天苷、阿魏酸和迷迭香酸，為該藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供一定依據(jù)[2]。

細(xì)胞色素P450酶（CYP450s）為一類亞鐵血紅素-硫醇鹽蛋白的超家族，其中CYP1、CYP2和CYP3亞家族主要負(fù)責(zé)人類和動(dòng)物大量的內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的Ⅰ相代謝[3-4]，包括藥物氧化、羥基化、去甲基化和氧化脫氨基等[5-6]。幾乎90%藥物都經(jīng)體內(nèi)CYP450s的代謝[7]，其中CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4亞型是負(fù)責(zé)人體內(nèi)藥物代謝最重要的CYP亞家族，且各家族都具有高度的底物特異性，與人亞型相對(duì)應(yīng)的大鼠CYP450s亞型分別是CYP1A2、CYP2C6、CYP2C11、CYP2D1/2和CYP3A1/2[4，8]。當(dāng)體內(nèi)CYP450s被強(qiáng)烈抑制或誘導(dǎo)時(shí)，將發(fā)生藥物相互作用，導(dǎo)致藥物血藥濃度改變，輕者藥物療效下降，重者產(chǎn)生毒副反應(yīng)，甚至發(fā)生致命的相互作用。因此，明確治療藥物潛在的藥物相互作用具有重要的臨床和現(xiàn)實(shí)意義。本研究采用Cocktail探針?biāo)幬锓ǎ芯刻忑埻ㄐ奶崛∥飳?duì)大鼠體內(nèi)5種CYP450s酶亞型CYP1A2、CYP2C6、CYP2C11、CYP2D2和CYP3A1/2的影響，獲取其代謝信息，為天龍通心方臨床合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

雄性SD大鼠12只，體質(zhì)量（220±20）g，購(gòu)自斯貝福（北京）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2011-0004。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物房，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水，實(shí)驗(yàn)期間自由飲水，實(shí)驗(yàn)12 h后進(jìn)食。本實(shí)驗(yàn)均符合北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南的相關(guān)要求。

1.2 藥物與試劑

天龍通心提取物（每1 g浸膏粉相當(dāng)于3.31 g原藥材，涿州東樂(lè)制藥有限公司，批號(hào)TL20140612）；咖啡因（caffeine，Sigma-Aldrich公司，批號(hào)112C5143），1,7-二甲基黃嘌呤（paraxanthine，Sigma- Aldrich公司，批號(hào)117K4122），去甲右美沙芬（dextrorphan，Sigma-Aldrich公司，批號(hào)057k4619），葡萄糖醛酸水解酶（Sigma-Aldrich公司，批號(hào)SLBC4010V），氯沙坦（losartan，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100597-201102），奧美拉唑（omeprazole，批號(hào)100367-201003，中國(guó)食品藥品檢定研究院），右美沙芬（dextromethorphan，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100201-201003），非那西?。╬henacetin，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100095-198904），羰基氯沙坦（losartan carboxylic acid，TRC公司，批號(hào)1-BSR-34-8），5-羥基奧美拉唑（5-hydroxyomeprazole，TRC公司，批號(hào)1030-019A2），咪達(dá)唑侖（midazolam，IL公司，批號(hào)747335），1-羥基咪達(dá)唑侖（1-hydroxy midazolam，Cayman Chemical Company公司，批號(hào)0111），純度均大于98%。甲醇、乙腈均為色譜級(jí)（美國(guó)Fisher公司），甲酸為色譜級(jí)（J.T.Baker公司），水為蒸餾水（屈臣氏），其余試劑均為分析純。

1.3 儀器

API 4000 QTRAP質(zhì)譜系統(tǒng)（美國(guó)Applied Biosystem公司），Spark Holland Pico在線固相萃取系統(tǒng)，配有二元泵、溫控自動(dòng)進(jìn)樣器、SPE控制系統(tǒng)、溶劑傳輸單元和柱溫箱（荷蘭SPARK公司），Turbo Vap LV Evaporator樣品濃縮儀（美國(guó)Caliper Life Sciences公司），Shiseido MG Ⅲ（100 mm×2.0 mm，5 μm，日本Shiseido公司），0.2 μm過(guò)濾篩板（ESA公司），HySphere C18 HD Plate（10 mm×2 mm，7 μm，美國(guó)Waters公司），VX-02 Multi-Tube Vortex渦旋混合器（北京綠錦科技有限公司），MIKRO 22R低溫超速離心機(jī)（德國(guó)赫提馳Hettich公司），MSC-100 THERMO Shaker（Thermoelectric公司），AE240精密分析天平（美國(guó)Metter公司），HR-215S冰箱（青島海爾公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組和給藥

12只SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組和天龍通心方組，每組6只?？瞻讓?duì)照組予蒸餾水灌胃，天龍通心方組給予受試藥1 g/kg灌胃，給藥體積為10 mL/kg，連續(xù)14 d。實(shí)驗(yàn)第15日，給予受試藥0.5 h后，再給予混合探針?biāo)嶤YP1A2（咖啡因）8 mg/kg、CYP2C6（氯沙坦）5.2 mg/kg、CYP2C11（奧美拉唑）2 mg/kg、CYP2D2（右美沙芬）3 mg/kg和CYP3A1/2（咪達(dá)唑侖）0.7 mg/kg灌胃，給藥體積均為10 mL/kg。

2.2 血漿樣品采集

給予混合探針?biāo)幒?.167、0.5、1、1.5、2、4、6、8、10、12 h大鼠眼眶靜脈叢取血，每點(diǎn)取0.4 mL，4 ℃、3000 r/min離心10 min，吸取上清液，置于-80 ℃冰箱凍存待測(cè)。

2.3 血漿樣品前處理

所有血漿樣品經(jīng)β-葡萄糖醛酸水解酶處理后進(jìn)行分析，將該酶溶解在0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）中獲得2000 U/mL酶溶液。取血漿樣品放至室溫，分別精密吸取血漿樣品與酶溶液各100 μL混合，37 ℃振蕩孵育90 min，加400 μL含內(nèi)標(biāo)乙腈沉淀劑終止反應(yīng)。劇烈振蕩2 min，12 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移480 μL上清液，50 ℃氮?dú)獯蹈?。將殘余物?fù)溶于15%有機(jī)相溶劑（甲醇∶乙腈∶水＝7.5∶7.5∶85）240 μL，渦旋，超聲，離心，取上清液，待分析。

2.4 色譜方法

2.4.1 online-SPE方法

采用由Symbiosis系統(tǒng)控制全自動(dòng)固相萃取系統(tǒng)，使用HySphere-C18 HD（10 mm×2 mm，7 μm）SPE柱進(jìn)行樣品萃取，在線固相萃取的步驟分為SPE柱裝載、洗滌和洗脫。具體步驟：96孔板中自動(dòng)挑選所選SPE柱，將其置于左夾中，分別使用1 mL甲醇和0.01%甲酸水（V/V）進(jìn)行調(diào)節(jié)和平衡；然后使用0.01%甲酸水0.7 mL作為上樣溶劑將樣品傳遞到萃取柱上，再經(jīng)1.5 mL溶液洗滌；將柱子轉(zhuǎn)移到右?jiàn)A，轉(zhuǎn)接至分析管路，使色譜流動(dòng)相通過(guò)柱體，將分析物直接洗脫2 min到分析柱上。之后萃取柱經(jīng)1.5 mL 0.01%甲酸水和2 mL甲醇分別清洗。萃取流程中除上樣時(shí)流速為0.8 mL/min外，其他過(guò)程的流速均為5 mL/min。

2.4.2 色譜分離條件

分析色譜柱是Shiseido MG Ⅲ（2.0×100 mm，5 μm），預(yù)柱采用0.2 μm過(guò)濾篩板，自動(dòng)進(jìn)樣器8 ℃，進(jìn)樣量5 μL，柱溫40 ℃，運(yùn)行時(shí)間5 min。流動(dòng)相A為0.01%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為含0.01%甲酸的乙腈-甲醇混合液（1∶1，V/V），流速0.35 mL/min，洗脫程序：0→0.3 min，35%→72% B；0.3→2.3 min，72% B；2.3→2.5 min，72%→35% B。

2.5 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜離子源為ESI源，氣簾氣體20 psi，源內(nèi)溫度500 ℃，源內(nèi)氣體GS1為50 psi，源內(nèi)氣體GS2為40 psi，離子噴射電壓（IS）5000 V，碰撞氣（CAD）Medium，檢測(cè)方式正離子檢測(cè)，掃描方式選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）方式，用于定量分析的各離子對(duì)采用掃描時(shí)間為40 ms，EP為10 V，詳見(jiàn)表1。

表1 各成分離子對(duì)及質(zhì)譜參數(shù)

分析物縮寫(xiě)母離子（m/z）子離子（m/z）DP/VEP/VCE/VCXP/V CaffeineCAF195.2138.1761028.010.0 ParaxanthinePXT181.0124.0661029.08.0 OmeprazoleOMP346.3198.1481016.113.0 5-hydroxyomeprazoleHOMP362.0214.1531018.015.0 DextromethorphanDM272.3215.2501035.016.0 DextrorphanDP258.1157.11481056.010.6 MidazolamMDZ326.1291.2801038.520.0 1-hydroxymidazolamHMDZ342.1324.1771031.09.0 LosartanLK437.2207.2651032.015.0 Losartan carboxylic acidE3174423.2207.2601033.015.0 IS-PhenacetinPNT180.1110.0701030.57.0

3 數(shù)據(jù)處理及分析

研究中待測(cè)成分藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算采用非房室模型統(tǒng)計(jì)距法，應(yīng)用末端消除半衰期（1/2）、峰濃度（max）、達(dá)峰時(shí)間（max）、0到最后可觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)的曲線下面積（0-t），以生物利用度矯正的藥物消除相表觀分布容積（z/）、總清除率（CL/F）表征各探針?biāo)幍乃幋鷦?dòng)力學(xué)性質(zhì)，以max、max和0-t描述特異代謝產(chǎn)物的藥動(dòng)學(xué)行為，以代謝物與探針的0→t之比（ratio）來(lái)反映對(duì)應(yīng)代謝酶的代謝活性。采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較用非成對(duì)檢驗(yàn)。＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 底物探針及其代謝物的分析方法學(xué)

經(jīng)對(duì)樣本前處理方法、液相條件和質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，最終建立大鼠血漿中5種探針?biāo)幖捌浯x物在線SPE-LC-MS/MS分析方法，并對(duì)所建立的分析方法進(jìn)行特異性、線性、基質(zhì)效應(yīng)、精密度、準(zhǔn)確度及穩(wěn)定性的考察和驗(yàn)證，結(jié)果表明所建立分析方法符合生物分析方法學(xué)要求[9]。根據(jù)化合物質(zhì)譜特征和體內(nèi)濃度范圍，確定10個(gè)成分線性范圍，見(jiàn)表2。

4.2 天龍通心方對(duì)大鼠CYP1A2代謝酶的影響

CYP1A2主要表達(dá)于肝臟，約占肝CYP總含量15%[4]，在多種物種間表現(xiàn)出高度保守性，而咖啡因是人和大鼠CYP1A2特異性底物[10]。用藥前后探針?biāo)幙Х纫颍–AF）及其代謝物1,7-二甲基黃嘌呤（PXT）藥時(shí)曲線見(jiàn)圖1，藥代參數(shù)見(jiàn)表3、表4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，天龍通心方連續(xù)給藥14 d，與空白對(duì)照組比較，探針?biāo)嶤AF峰濃度有所下降，峰面積無(wú)顯著變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05），而達(dá)峰時(shí)間顯著推遲，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），代謝物PXT峰面積較空白對(duì)照組有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；作為代謝率指標(biāo)的代謝物和探針?biāo)幹龋╮atio）無(wú)顯著變化，表明天龍通心方對(duì)大鼠CYP1A2酶活性無(wú)顯著影響。

表2 探針?biāo)幖捌浯x物標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

分析物回歸方程相關(guān)系數(shù) 線性范圍/（ng/mL） CAFY＝0.004 31X＋0.1860.990 161.44～15 000 PXTY＝0.004 52X＋2.9×10-20.993 510.24～2500 LKY＝0.093 5X－8.66×10-30.996 3 4.10～1000 E3174Y＝0.043 9X＋7.5×10-20.995 0 8.19～2000 OMPY＝0.092X＋5.47×10-20.993 2 2.05～500 HOMPY＝0.026 7X＋2.12×10-30.999 95 1.23～300 DMY＝0.019X＋3.46×10-30.992 9 0.41～100 DPY＝0.006 99X＋6.54×10-30.992 0 4.10～1000 MDZY＝0.031 3X＋1.21×10-30.993 5 0.10～25 HMDZY＝0.039 3X－3.43×10-30.999 6 0.64～25

圖1 2組大鼠CAF及其代謝物PXT平均血漿藥時(shí)曲線比較（n＝6）

表3 2組大鼠探針底物CAF藥代動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較（±s，n＝6）

注：與空白對(duì)照組比較，*＜0.05，**＜0.01（下同）

表4 2組大鼠探針底物CAF代謝物PXT藥代動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較（±s，n＝6）

4.3 天龍通心方對(duì)大鼠CYP2C酶活性的影響

CYP2C亞家族是含量最為豐富的亞家族，占人類CYP肝藥酶總量的20%以上，其中CYP2C9和CYP2C19是2個(gè)最活躍的成員，負(fù)責(zé)大多數(shù)內(nèi)源性和外源性化合物的代謝[11]。大鼠CYP2C6和CYP2C11是人CYP2C9和CYP2C19的同源蛋白，具有一定的對(duì)應(yīng)性[12-14]。用藥前后探針?biāo)幝壬程梗↙K）及其代謝物E3174藥時(shí)曲線見(jiàn)圖2，藥代參數(shù)結(jié)果見(jiàn)表5、表6。連續(xù)給予大鼠天龍通心方后，探針?biāo)嶭K及其代謝物E3174的藥代參數(shù)與空白對(duì)照組比較均無(wú)顯著改變，且代謝率ratio也無(wú)變化，結(jié)果提示重復(fù)給予天龍通心方不會(huì)對(duì)大鼠CYP2C6的活性產(chǎn)生影響。用藥前后探針?biāo)帄W美拉唑（OMP）及其代謝物5-羥基奧美拉唑（HOMP）藥時(shí)曲線見(jiàn)圖3，藥代參數(shù)結(jié)果見(jiàn)表7、表8。與空白對(duì)照組比較，連續(xù)給藥后原型藥OMP峰濃度、體內(nèi)暴露量顯著下降（＜0.05），代謝物HOMP藥代參數(shù)無(wú)顯著改變，代謝率ratio明顯升高（＜0.05），表明連續(xù)予天龍通心方可能對(duì)大鼠CYP2C11有一定誘導(dǎo)作用。

圖2 2組大鼠LK及其代謝物E3174平均血漿藥時(shí)曲線比較（n＝6）

表5 2組大鼠探針底物L(fēng)K藥代動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較（±s，n＝6）

表6 2組大鼠探針底物L(fēng)K代謝物E3174藥代動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較（±s，n＝6）

圖3 2組大鼠OMP及其代謝物HOMP平均血漿藥時(shí)曲線比較（n＝6）

表7 2組大鼠探針底物OMP藥代動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較（±s，n＝6）

表8 2組大鼠探針底物OMP代謝物HOMP藥代動(dòng)力指標(biāo)比較（±s，n＝6）

4.4 天龍通心方對(duì)大鼠CYP2D2代謝酶的影響

CYP2D6在人肝臟中表達(dá)較低，但30%藥物的生物轉(zhuǎn)化都與該酶有關(guān)[15]。人體內(nèi)CYP2D6特異性介導(dǎo)右美沙芬（DM）代謝成去甲右美沙芬（DP）這一過(guò)程在大鼠體內(nèi)由肝臟CYP2D2介導(dǎo)[16]。探針?biāo)嶥M及其代謝物DP藥時(shí)曲線見(jiàn)圖4，藥代參數(shù)結(jié)果見(jiàn)表9、表10。與空白對(duì)照組比較，天龍通心方對(duì)DM及其代謝物藥代參數(shù)均無(wú)影響，盡管ratio明顯上升（39%），但由于個(gè)體差異較大并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明重復(fù)給予天龍通心方不會(huì)引起CYP2D2活性改變。

4.5 天龍通心方對(duì)大鼠CYP3A1/2代謝酶的影響

CYP3A亞家族參與50%以上治療藥物生物轉(zhuǎn)化[15]，其中CYP3A4是最豐富和最重要的亞型。咪噠唑侖（MDZ）是人CYP3A4特異性探針底物，雄性大鼠中MDZ代謝主要由CYP3A1/2介導(dǎo)[16]。探針?biāo)嶮DZ及其代謝物藥時(shí)曲線見(jiàn)圖5，藥代參數(shù)結(jié)果見(jiàn)表11、表12。與空白對(duì)照組比較，MDZ及代謝產(chǎn)物HMDZ峰濃度和體內(nèi)暴露水平均顯著下降，而代謝率無(wú)顯著變化，表明重復(fù)給藥后天龍通心方不會(huì)對(duì)MDZ代謝產(chǎn)生影響。體內(nèi)暴露水平的降低可能是由于天龍通心方影響MDZ的吸收所致。

圖4 2組大鼠DM及其代謝物DP平均血漿藥時(shí)曲線比較（n＝6）

表9 2組大鼠探針底物DM藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較（±s，n＝6）

表10 2組大鼠探針底物DM代謝物DP藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較（±s，n＝6）

圖5 2組大鼠MDZ及其代謝物HMDZ平均血漿藥時(shí)曲線比較（n＝6）

表11 2組大鼠探針底物MDZ藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較（±s，n＝6）

表12 2組大鼠探針底物MDZ代謝物HMDZ藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較（±s，n＝6）

5 討論

許多研究顯示，中藥對(duì)P450系統(tǒng)具有顯著影響。馬增春等[17]發(fā)現(xiàn)四物湯對(duì)大鼠CYP2B6酶活性具有抑制作用，對(duì)CYP1A2具有誘導(dǎo)作用。尚芳紅等[18]發(fā)現(xiàn)加味佛手散膠囊對(duì)大鼠和人肝微粒體CYP2D、CYP2E1、CYP3A酶活性可能有體外抑制作用。Zhang等[9，12]發(fā)現(xiàn)塞絡(luò)通單次給藥和連續(xù)給藥對(duì)大鼠代謝酶影響存在差異，表明藥物成分對(duì)肝藥酶影響具有累積效應(yīng)。還有報(bào)道顯示，丹紅注射液對(duì)人肝微粒體CYP2A6具有很強(qiáng)的抑制作用，對(duì)CYP1A2、CYP2B6、CYP2B8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1及CYP3A4具有中等強(qiáng)度抑制作用，同時(shí)顯示對(duì)大鼠及人原代肝細(xì)胞CYP3A4具有誘導(dǎo)作用[19-20]。Qiu等[21-22]發(fā)現(xiàn)，單劑量丹參提取物可抑制健康受試者腸道CYP3A，多劑量可誘導(dǎo)腸道和肝臟CYP3A。綜上，中藥復(fù)方對(duì)藥物代謝酶活性存在抑制或誘導(dǎo)，甚至雙向作用，在合并用藥時(shí)可能引起藥物間相互作用。

Cocktail探針?biāo)幬锓ㄊ荁reimer于1990年提出的[23]，該方法能在同一動(dòng)物上同時(shí)獲取多個(gè)CYP450同工酶表型信息，減小個(gè)體差異對(duì)數(shù)據(jù)波動(dòng)性影響，是進(jìn)行藥物研發(fā)的有效手段。本研究同時(shí)考察大鼠血漿中5種探針?biāo)幬锛捌浯x物濃度，通過(guò)特異性探針?biāo)幬锎x消除率判定藥物對(duì)酶活性的影響。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采樣周期12 h，盡管E3174和DP濃度較高，但此時(shí)血藥濃度已回落，前期研究這2個(gè)成分后續(xù)無(wú)再次達(dá)峰現(xiàn)象，并且天龍通心方并未對(duì)LK和DM的代謝物藥代參數(shù)有顯著影響。所以，雖然E3174和DP未獲得完整的藥時(shí)曲線，但不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，連續(xù)給予大鼠天龍通心提取物對(duì)大鼠肝藥酶CYP1A2、CYP2C6、CYP2D2和CYP3A1/2未表現(xiàn)出明顯抑制或誘導(dǎo)作用，但對(duì)CYP2C11（人體CYP2C19）存在一定誘導(dǎo)作用（＜0.05），提示臨床上與經(jīng)CYP2C19代謝的藥物聯(lián)用可能出現(xiàn)藥物相互作用。如與經(jīng)CYP2C19代謝的奧美拉唑合并用藥時(shí)，可能加快該藥代謝，降低血藥濃度，從而降低藥效。若與經(jīng)CYP2C19代謝產(chǎn)生活性代謝物而起治療作用的抗血小板藥氯吡格雷同時(shí)應(yīng)用，導(dǎo)致血中活性代謝物水平升高，從而可能增加藥物產(chǎn)生不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)[24]。

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Evaluation of Effects ofPrescription on Metabolic Enzymes by Mixed Probe in Rats

MIAO Lan, LIN Li, ZHANG Ying, SUN Mingqian, LIU Jianxun, FU Jianhua

To prevent potential clinical complications caused by medicine interaction through preliminarily investigating the effects ofPrescription on metabolic enzymes in rats.The experiment rats was randomly divided into blank group andg roup. After pretreatment for 14 days withPrescription, these rats were given mixed probe drugs of CYP1A2 (caffeine), CYP2C11 (omeprazole), CYP2C6 (losartan), CYP2D2 (dextromethorphan) and CYP3A1/2 (midazolam). The blood concentration of each probe drug and its specific metabolic substrate at different time points after administration were detected. The effects ofPrescription on CYP450 metabolic enzyme activity in rats were evaluated by comparing the plasma pharmacokinetic parameters and metabolic rate (metablite/probe) changes of each probe drug and metabolite.Compared with blank group, the peak concentration and systematic exposure of omeprazole decreased significantly and the metabolic rate increased significantly after continuous administration ofPrescription, with statistical significance (<0.05). At the same time, the peak time of probe drug caffeine was significantly delayed, and theratioof metabolites and probe drug decreased by 30%, without statistical significance (>0.05). However, the peak time of midazolam and the metabolite 1-hydroxymidazolam were delayed, while the peak concentration and exposure levels in the body decreased significantly, and the clearance rate of the prototype drug midazolam increased significantly. The main pharmacokinetic parameters and metabolic rates of probe substrates and their metabolites in other groups were not significantly different.Repeated administration ofPrescription may induce CYP2C11 in rats (CYP2C19 in human), but has no significant effect on CYP1A2,CYP2C6, CYP2D2 and CYP3A1/2. It is preliminarily suggested that the combination with drugs metabolized by CYP2C19 should be avoided in clinical application ofPrescription.

Prescription; CYP450 enzymes; substrates of probe; LC-MS/MS; metabolites; rats

R285.5

A

1005-5304(2020)09-0051-07

10.3969/j.issn.1005-5304.202003217

國(guó)家自然科學(xué)基金（81774145、81803770）；國(guó)家科技重大專項(xiàng)－重大新藥創(chuàng)制（2012ZX09103201-049）

付建華，E-mail：jianhuaffcn@263. net

（2020-03-09）

（2020-03-23；編輯：華強(qiáng)）