低能量激光療法對重度牙周炎患者齦溝液中細(xì)胞因子的影響

李宏斌 李榮華 趙燕娟

天津市第一中心醫(yī)院口腔科 300192

0 引 言

牙周炎是牙周組織在菌斑微生物影響下發(fā)生的炎癥，牙周袋內(nèi)的微生物可進(jìn)入血液循環(huán)，激活機(jī)體免疫反應(yīng)，使炎癥細(xì)胞因子大量產(chǎn)生與活化[1]。齦溝液中的白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是機(jī)體內(nèi)重要的細(xì)胞因子，可有效激活破骨細(xì)胞的活性，加速牙槽骨吸收，損傷牙周軟組織[2]?？扇苄约?xì)胞間黏附分子-1（soluble intercellular adhesion molecule-1，sICAM-1）在牙周炎的發(fā)生過程中參與炎癥部位的白細(xì)胞聚集，促進(jìn)炎性介質(zhì)的釋放，加重對牙周組織的破壞[3]?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解的重要分子，其中MMP-8可降解彈性蛋白、膠原蛋白、層黏連蛋白活性，通過誘導(dǎo)牙槽骨中的Ⅰ型膠原的降解加重牙周炎患者牙槽骨的吸收[4-5]。轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β） 是免疫調(diào)節(jié)劑因子[6]，可抑制IL-1β的表達(dá)，同時拮抗IL-1β引起的炎癥反應(yīng)。低濃度的TGF-β可促進(jìn)牙周膜細(xì)胞生長及胞外基質(zhì)的合成，有助于炎癥的早期愈合[7]。骨膜蛋白是黏附蛋白，在牙周炎的發(fā)生、發(fā)展中具有參與組織修復(fù)、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡等作用[8-9]。低能量激光療法（low-level laser therapy，LLLT)對牙周炎主要起到消炎、抗感染的作用，其可深入手動機(jī)械難以到達(dá)的牙齒部位如根分叉區(qū)，從而激發(fā)組織的生長潛力，促進(jìn)牙周膜細(xì)胞的增殖和組織再附著。在牙周炎進(jìn)展過程中，牙周袋內(nèi)的細(xì)菌會激活宿主抗炎癥系統(tǒng)釋放蛋白酶、細(xì)胞因子等炎性因子，間接損傷牙周組織。近年來，研究者常以齦溝液中細(xì)胞因子的水平來評估牙周炎對牙周組織的破壞程度，其也可作為評價牙周炎治療效果的指標(biāo)。本研究中，應(yīng)用LLLT治療重度牙周炎，檢測治療前、后齦溝液中上述細(xì)胞因子的變化，評價LLLT對重度牙周炎的治療效果，包括對牙周炎癥的控制及牙周組織恢復(fù)的影響，為臨床應(yīng)用激光治療重度牙周炎提供支撐。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2018年6月至2019年5月天津市第一中心醫(yī)院口腔科收治的重度牙周炎患者18例，年齡范圍 35～65 歲，年齡（51.7±8.4）歲，其中男性 10例，女性8例[10]。重度牙周炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：牙周探診深度（probing depth，PD）≥6 mm；臨床附著水平（clinical attachment level，CAL）≥5 mm；影像學(xué)資料顯示牙槽骨吸收達(dá)牙根長的1/2～2/3；磨牙有根分叉病變；患牙多松動；牙周炎癥較明顯或發(fā)生牙周膿腫[11-12]。納入標(biāo)準(zhǔn)為：患重度牙周炎且有2顆及以上患牙需要拔除；半年內(nèi)未進(jìn)行任何牙周治療；1個月內(nèi)未使用過抗生素、非甾體類抗炎藥物或免疫抑制劑；無吸煙史或戒煙半年以上者；無糖尿病、冠心病、高血壓等系統(tǒng)性疾??；依從性好，意愿接受本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)為：年齡≤18歲或≥70歲的患者；患系統(tǒng)性疾?。ㄈ绺哐獕骸⑻悄虿?、自身免疫性疾病、惡性腫瘤）；牙周治療前或治療期間服用抗生素者；治療前3個月內(nèi)服用抗癲癇、抗炎藥物者；妊娠期或哺乳期婦女；吸煙者（超過10支/d）；半年內(nèi)接受過齦下刮治、根面平整等牙周非手術(shù)治療。本研究已通過天津市第一中心醫(yī)院倫理委員會審查（批號：2018NO77KY），所有入組患者均簽署知情同意書。

1.2 主要材料與儀器

細(xì)胞因子檢測試劑盒（武漢基因美生物公司），酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、Ⅱ型膠原酶（MMP-8）ELISA 試劑盒（美國R&D systems公司），考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量測試盒（南京建成生物工程研究所），人骨膜蛋白ELISA試劑盒（武漢貝茵萊生物科技有限公司）。

濾紙條（英國Whatman公司），P5多功能超聲波牙科治療儀（法國賽特力公司），Ga-Al-As半導(dǎo)體激光儀器（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所），全自動生化分析儀（日本希森美康公司），牙周檢查探針、Gracey刮治器（上海豪孚迪醫(yī)療器械），Power wave XS2全波長酶標(biāo)儀（美國Biotek公司）。

1.3 方法

1.3.1 牙周基礎(chǔ)治療和低能量激光照射

將18例入組患者依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組和實驗組，對照組患者9例（共20顆患牙），實驗組患者9例（共23顆患牙）。對照組和實驗組均進(jìn)行相同的牙周基礎(chǔ)治療，包括口腔衛(wèi)生宣教、齦上潔治、齦下刮治和根面平整術(shù)。實驗組在牙周基礎(chǔ)治療的基礎(chǔ)上，于治療后的第1、2、7天接受低能量激光照射治療，波長為808 nm，輸出功率為80 mW，能量密度為4 J/cm2，光斑面積為0.28 cm2。治療中，將激光光纖探頭緩緩插入患牙的牙周袋袋底，覆蓋袋底及袋內(nèi)壁，呈“之”字形進(jìn)行上下提拉照射，每個牙周袋內(nèi)照射時間為15 s，照射時用潤濕的消毒棉卷進(jìn)行局部阻隔，以防止對鄰近口腔組織造成損傷[10]。

1.3.2 齦溝液中細(xì)胞因子水平檢測

分別于治療前、治療后1、4周收集兩組患者的齦溝液。收集前，用消毒棉卷對患牙進(jìn)行局部隔濕；使用三用槍吹干牙面，選取患牙的牙周袋最深的位點，將Whatman濾紙條輕輕插入至袋底，有輕微阻力時停留30 s后取出；將濾紙條放入1.5 ml離心管后置于-80℃保存[10]。

進(jìn)行細(xì)胞因子檢測前，將冷凍的濾紙條在室溫下復(fù)融；在4℃、3 000 r/min下，離心處理15 min；離心后吸取上清液 50 μl，置入滅菌 EP 管中（0.5 ml），置于-80℃低溫冰箱凍存。細(xì)胞因子檢測時，取出樣品并在室溫下解凍20 min，根據(jù)各試劑盒的說明書分別進(jìn)行相關(guān)蛋白的檢測，使用酶標(biāo)儀檢測各樣品在405 nm處的吸光度值，計算細(xì)胞因子水平。整個檢測過程均由一人獨立完成。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料比較

所有18例患者均完成了所有研究過程，期間未出現(xiàn)患牙脫落的現(xiàn)象。兩組患者治療前的一般臨床資料比較見表1。結(jié)果表明，對照組與實驗組患者的年齡、PD、CAL和齦溝出血指數(shù)（sulcus bleeding index，SBI）的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＞0.05）。

表1 兩組重度牙周炎患者治療前的一般資料（Mean±SD）

對照組（20顆患牙）與實驗組（23顆患牙）齦溝液在治療前的各細(xì)胞因子水平見表2。結(jié)果表明，兩組齦溝液中 IL-1β、TNF-α、TGF-β、MMP-8、sICAM-1和骨膜蛋白水平的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.2 LLLT對齦溝液中細(xì)胞因子的影響

結(jié)果表明，低能量激光治療后1周，實驗組齦溝液中IL-1β、TNF-α水平低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；但兩組齦溝液中TGF-β、MMP-8、sICAM-1和骨膜蛋白水平的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。低能量激光治療后4周，與對照組相比，實驗組齦溝液中IL-1β、TNF-α水平的降低更為明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；實驗組齦溝液中MMP-8、sICAM-1水平明顯降低，TGF-β和骨膜蛋白水平明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.05）。（表 3）

3 討論

3.1 齦溝液中促炎因子水平變化

齦溝液是牙齦組織的滲出液，其量的多少與牙周炎癥程度正相關(guān)，是反映牙周組織被破壞程度的重要指標(biāo)。在牙周炎發(fā)生、發(fā)展過程中，致病菌可激活機(jī)體炎性細(xì)胞因子的釋放，加重對牙周組織的破壞。齦溝液中炎癥細(xì)胞因子的水平既可反映牙周炎對牙周組織的破壞程度，又可作為牙周炎治療效果的評價指標(biāo)。

IL-1β是破骨細(xì)胞激活因子的重要成分，可加重牙周組織破壞。IL-1β是具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，不僅能夠直接介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的激活，還能促進(jìn)多種黏附分子和趨化因子分泌，加重炎癥反應(yīng)，促進(jìn)牙周組織的破壞[2]。本文結(jié)果表明，實驗組和對照組分別在牙周基礎(chǔ)治療和牙周基礎(chǔ)治療聯(lián)合LLLT治療后，TNF-α、IL-1β的水平顯著降低，且實驗組在治療后1周、4周，兩種因子水平低于對照組。該結(jié)果說明，牙周基礎(chǔ)治療可清除牙菌斑，一定程度上減輕牙周炎癥反應(yīng)，但牙周基礎(chǔ)治療聯(lián)合LLLT治療可更有效地抑制炎癥反應(yīng)，減輕重度牙周炎牙槽骨的持續(xù)吸收，延緩牙齒脫落。此外，實驗組和對照組TNF-α水平的降低，說明牙周基礎(chǔ)治療和LLLT治療均能有效降低炎癥因子水平，且基礎(chǔ)治療

表2 兩組重度牙周炎患者治療前齦溝液細(xì)胞因子水平（Mean±SD）

表3 治療后不同時間重度牙周炎患者齦溝液中細(xì)胞因子水平（Mean±SD）

聯(lián)合LLLT治療對炎癥的控制效果更佳，可有效減少牙周組織的繼發(fā)性損傷，該結(jié)果與蘇樹霞等[13]和Ustun等[14]的研究結(jié)果一致。

MMP-8對牙周組織也有重要的破壞作用。Mancini等[15-16]在重度牙周炎患者的齦溝液中檢測到MMP-8，且與穩(wěn)定期牙周炎患者相比，其表現(xiàn)出更高的活性。本研究的結(jié)果表明，牙周基礎(chǔ)治療聯(lián)合LLLT治療可降低齦溝液中的MMP-8水平。

在正常及病變牙周組織齦溝液中均可檢測到sICAM-1，但其在結(jié)合上皮表層中的表達(dá)最強(qiáng)[17]。本研究中發(fā)現(xiàn)，LLLT治療后4周實驗組的sICAM-1水平明顯降低。其主要原因可能是在LLLT治療中，激光通過細(xì)菌菌液氣化、胞壁崩解、蛋白凝固、變性、壞死，起到殺菌作用，降低了細(xì)菌的sICAM-l表達(dá)。但在LLLT治療后1周，這種差異還不明顯。筆者前期的研究結(jié)果表明，LLLT治療后，患者的PD及 SBI均有明顯改善（P＜0.05）[10]，分析可能是 LLLT治療降低了牙周袋內(nèi)細(xì)菌數(shù)量，降低了齦溝液中sICAM-1水平，從而減輕了牙周局部過度的炎癥和免疫反應(yīng)。

3.2 齦溝液中生長因子水平變化

TGF-β在炎癥性修復(fù)中發(fā)揮重要作用。本研究中發(fā)現(xiàn)，實驗組和對照組的TGF-β水平在治療后均有所升高，雖然在治療后1周兩組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但在治療后 4周，實驗組 TGF-β 水平明顯高于對照組（P＜0.05）。該結(jié)果說明，LLLT治療有促進(jìn)TGF-β分泌的作用，但短時間內(nèi)效果不明顯。因此，在今后的研究中需要進(jìn)行更長時段的檢測，以確定LLLT對TGF-β的促進(jìn)作用。程群等[18]研究了Er∶YAG激光對人牙周膜細(xì)胞增殖的影響，也發(fā)現(xiàn)Er∶YAG激光可促進(jìn)細(xì)胞分泌TGF-β。Lubart等[19]的體外實驗研究結(jié)果表明，LLLT治療后，TNF-α、IL-Iβ水平降低，TGF-β水平升高。該結(jié)果與本研究結(jié)果一致，說明LLLT可抑制炎性細(xì)胞向牙周組織的聚集和破骨細(xì)胞的形成，減輕對牙槽骨的破壞。

骨膜蛋白也參與牙周炎癥的產(chǎn)生和進(jìn)展。牙周炎患者齦溝液中骨膜蛋白的水平隨牙周炎癥程度加深而降低。在牙周術(shù)后愈合過程中，骨膜蛋白的表達(dá)會出現(xiàn)短暫的增強(qiáng)，提示骨膜蛋白可能在牙周組織愈合、維持組織的完整性方面發(fā)揮重要作用[20]。本研究中，在進(jìn)行LLLT治療后，齦溝液中的骨膜蛋白水平逐漸上升，4周后實驗組與對照組的骨膜蛋白水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。說明與口腔基礎(chǔ)治療相比，LLLT治療對重度牙周炎有更好的炎癥控制作用。此外，重度牙周炎患者也會出現(xiàn)由創(chuàng)傷性咬合力導(dǎo)致的損傷，因此需要進(jìn)行更合理、更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒炘O(shè)計，對炎癥和咬合力因素與骨膜蛋白表達(dá)的關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

LLLT治療可在短期內(nèi)有效降低重度牙周炎患者齦溝液中的 IL-1β、TNF-α、MMP-8 的水平，有利于控制牙周炎癥，有效減少齦溝液中sICAM-1的表達(dá)，且對于牙齦出血癥狀效果明顯。同時，LLLT治療能有效促進(jìn)TGF-β分泌，提升骨膜蛋白水平，減緩牙周組織破壞，對于牙周組織的恢復(fù)有一定作用。但由于本研究的病例數(shù)較少且觀察期相對較短，對于LLLT治療是否利于重度牙周炎患者拔牙后牙槽骨的保存和再生，有待進(jìn)一步的研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突