低強(qiáng)度脈沖超聲對高糖誘導(dǎo)人牙周膜干細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究

蘇春艷 童乘皓 林仰東 彭誠

1天津市職業(yè)病防治院口腔科300011；2天津市口腔醫(yī)院急診科300041；3天津市第一中心醫(yī)院口腔科300192；4天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔科300211

0 引言

牙周炎是一種炎癥性疾病，會導(dǎo)致牙槽骨、牙周韌帶和根牙骨質(zhì)等牙齒支持組織的病理改變。牙周炎與多種全身性疾病密切相關(guān)，如視網(wǎng)膜疾病、心血管疾病等，尤其是糖尿病。目前我國糖尿病患者人數(shù)近1.3億，已成為威脅我國人民健康的主要疾病[1-2]。糖尿病會加重牙周炎的病情，反之亦然。在牙周炎患者中，同時伴有糖尿病的患者其發(fā)病率高、進(jìn)程快、病變嚴(yán)重且較難治愈[3-4]。研究結(jié)果表明，糖尿病與牙周炎的多項(xiàng)指標(biāo)存在高度相關(guān)性，這可能是由于高糖環(huán)境抑制了人牙周膜干細(xì)胞（human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs）的增殖并促進(jìn)其凋亡。hPDLSCs在受損牙周組織的重建和功能恢復(fù)進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用[5]。其被認(rèn)為是牙周細(xì)胞治療特別是骨缺損重建的最佳候選細(xì)胞。然而，研究人員發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境可能會極大降低hPDLSCs的增殖能力、自我更新和分化能力[6]。因此，如何挽救高糖環(huán)境下hPDLSCs的增殖和成骨分化紊亂仍是一個亟需解決的醫(yī)療問題。國內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果表明，低強(qiáng)度脈沖超聲對高糖誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用，且對骨髓來源細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用[7-9]。然而，關(guān)于低強(qiáng)度脈沖超聲對高糖誘導(dǎo)hPDLSCs損傷的保護(hù)作用研究尚未見報道。本研究旨在探討低強(qiáng)度脈沖超聲對高糖誘導(dǎo)hPDLSCs損傷的保護(hù)作用及機(jī)制，為糖尿病性牙周炎的治療提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

hPDLSCs（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞庫），胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（美國 HyClone公司），TRIzol試劑盒（美國Invitrogen公司），總蛋白定量測定試劑盒（二喹啉甲酸法）、蛋白上樣緩沖液（5×）、噻唑藍(lán)細(xì)胞增殖檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體、兔抗人 Wnt1、Wnt10b、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）多克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG多克隆抗體[艾康生物技術(shù)（杭州）有限公司]。

F50酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司），BD Accuri C6 Plus流式細(xì)胞儀（美國BD公司），S100梯度PCR儀（美國Bio-Rad公司），970CRT熒光分光光度計（上海精密儀器儀表有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 hPDLSCs的復(fù)蘇與培養(yǎng)

將凍存的hPDLSCs置于37℃的恒溫水浴箱中60 s快速復(fù)蘇；待細(xì)胞懸液完全融化后迅速移入離心管內(nèi)，加入RPMI-1640培養(yǎng)基，重復(fù)小心吹打使細(xì)胞均勻分布；離心，棄上清；用RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/ml，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞分組與處理

取對數(shù)生長期的hPDLSCs分為5組：正常對照組、高糖模型組和低強(qiáng)度脈沖超聲30、60、90 mW/cm2組。高糖模型組和低強(qiáng)度脈沖超聲組細(xì)胞采用高糖培養(yǎng)基（葡萄糖濃度為40 mmol/L）處理48 h，建立高糖模型；正常對照組細(xì)胞采用正常培養(yǎng)基（葡萄糖濃度為11 mmol/L）處理。低強(qiáng)度脈沖超聲組細(xì)胞造模后每天分別給予30、60、90 mW/cm2低頻脈沖處理20 min，連續(xù)處理7 d。

1.2.3 噻唑藍(lán)法檢測細(xì)胞增殖活性

低強(qiáng)度脈沖超聲7 d后，收集各組hPDLSCs，采用各自對應(yīng)的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以5×104個細(xì)胞/孔接種于96孔板中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；每孔加入質(zhì)量濃度為5 mg/ml的噻唑藍(lán)溶液10 μl，孵育4 h，棄上清；每孔加入100 μl二甲基亞砜，繼續(xù)孵育30 min，采用酶標(biāo)儀測定各孔于490 nm處的吸光度值。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期分布

低強(qiáng)度脈沖超聲7 d后，收集各組細(xì)胞懸液于離心管中，340×g離心5 min，棄上清；加入預(yù)冷的PBS 重懸細(xì)胞，每管加入 500 μl結(jié)合緩沖液、5 μl異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V染液及5 μl碘化丙啶染液，室溫避光染色20 min，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

低強(qiáng)度脈沖超聲7 d后，收集各組hPDLSCs，加入預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇1 ml，-20℃條件下固定過夜；4℃、340×g離心 5 min，棄上清；加入預(yù)冷的PBS 1 ml重懸細(xì)胞，4℃、340×g離心5 min，棄上清；加入500 μl碘化丙啶染液，室溫避光染色20 min，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布。

1.2.5 熒光比色法檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-3、Caspase-6和 Caspase-9活性

低強(qiáng)度脈沖超聲7 d后，收集各組hPDLSCs，重懸于50 ml冷裂解緩沖液中，置于冰上10 min；以400×g離心10 min，收集上清，測定上清液中的蛋白濃度；每組加入50 ml特異性的熒光報告底物，采用熒光分光光度計測定各組hPDLSCs中Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9的活性。

1.2.6 反轉(zhuǎn)錄PCR檢測Wnt1、Wnt10b和β-catenin的mRNA表達(dá)

低強(qiáng)度脈沖超聲7 d后，收集各組hPDLSCs，迅速加入TRIzol試劑裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成相應(yīng)的cDNA并進(jìn)行擴(kuò)增，Wnt1正向引物為5'-GAAACCGCCGCTGAACT-3'，反向引物為 5'-CCCTGCCTCGTTATTGTGAAG-3'；Wnt10b正向引物為5'-TGGAAGAATGCGGCTCTAG-3'，反向引物為5'-CTCTCCAAAGTCCATGTCATGG-3'；β-catenin正向引物為5'-GATTAACTATCAGGATGACGCG-3'，反向引物為5'-TCCATCCCTTCCTGCTTAGTC-3'；內(nèi)參GAPDH正向引物為5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，反向引物為5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性1 min，94℃變性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，測定各組 PDLSCs中 Wnt1、Wnt10b及 β-catenin的 mRNA相對表達(dá)水平。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測Wnt1、Wnt10b以及 βcatenin的蛋白表達(dá)

低強(qiáng)度脈沖超聲7 d后，收集各組hPDLSCs，加入細(xì)胞裂解液，提取總蛋白，并采用總蛋白定量測定試劑盒（二喹啉甲酸法）測定細(xì)胞總蛋白濃度；配制5%的濃縮膠和10%的分離膠，電泳后以90 V恒壓濕轉(zhuǎn)70 min將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上；加入含質(zhì)量濃度為50 g/L脫脂奶粉的三羥甲基氨基甲烷吐溫緩沖液，室溫封閉90 min；分別加入Wnt1、Wnt10b、β-catenin（均 1∶1 000）及 GAPDH（1∶2 000）一抗，4℃孵育過夜，三羥甲基氨基甲烷吐溫緩沖液洗膜6次，每次5 min；加入對應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶2 000），室溫孵育 90 min，三羥甲基氨基甲烷吐溫緩沖液洗膜6次，每次5min；采用ECL顯色，曝光后掃描圖像，使用Image J圖像分析軟件對各組條帶進(jìn)行灰度值分析，以GAPDH為內(nèi)參，計算各組hPDLSCs中Wnt1、Wnt10b及β-catenin的蛋白相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hPDLSCs增殖活性

噻唑藍(lán)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低強(qiáng)度脈沖超聲7 d后，正常對照組、高糖模型組以及低強(qiáng)度脈沖超聲30、60、90 mW/cm2組 hPDLSCs的增殖活性（A490）分別為0.735±0.114、0.206±0.032、0.357±0.048、0.482±0.063 和0.619±0.072。與正常對照組相比，高糖模型組hPDLSCs的增殖活性明顯降低（P＜0.05）；經(jīng)不同強(qiáng)度（30、60、90 mW/cm2）的低強(qiáng)度脈沖超聲處理后，hPDLSCs增殖活性較高糖模型組明顯升高（均P＜0.05），且90 mW/cm2組的細(xì)胞增殖活性最高（均P＜0.05）。

2.2 hPDLSCs細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期分布

由表1可知，與正常對照組相比，高糖模型組hPDLSCs的凋亡率明顯升高（P＜0.05）；而經(jīng)不同強(qiáng)度（30、60、90 mW/cm2）的低強(qiáng)度脈沖超聲處理后，hPDLSCs凋亡率較高糖模型組明顯降低（均P＜0.05），且90 mW/cm2組的細(xì)胞凋亡率最低（均P＜0.05）。與正常對照組相比，高糖模型組和低強(qiáng)度脈沖超聲30、60、90 mW/cm2組 hPDLSCs的 G0/G1、S 和 G2/M期細(xì)胞比例差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.3 hPDLSCs中 Caspase-3、Caspase-6和 Caspase-9活性

由表2可知，與正常對照組相比，高糖模型組hPDLSCs中的 Caspase-3、Caspase-6和 Caspase-9活性均明顯升高（均P＜0.05）；經(jīng)低強(qiáng)度脈沖超聲處理后高糖模型hPDLSCs中的Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9活性明顯降低（均P＜0.05），且90 mW/cm2組的Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9活性最低（均P＜0.05）。

2.4 hPDLSCs中Wnt1、Wnt10b及β-catenin的mRNA表達(dá)水平

由圖1可知，與正常對照組相比，高糖模型組hPDLSCs中 Wnt1、Wnt10b及 β-catenin的 mRNA 相對表達(dá)水平均明顯降低（均P<0.05）；經(jīng)低強(qiáng)度脈沖超聲處理后，hPDLSCs中Wnt1、Wnt10b及β-catenin的mRNA相對表達(dá)水平較高糖模型組明顯升高（均P<0.05），且超聲強(qiáng)度為90 mW/cm2時效果最為明顯（均 P<0.05）。

2.5 hPDLSCs中 Wnt1、Wnt10b及 β-catenin的蛋白表達(dá)水平

如圖2所示，與正常對照組相比，高糖模型組hPDLSCs中Wnt1、Wnt10b及β-catenin的蛋白相對表達(dá)水平均明顯降低（均P<0.05）；而低強(qiáng)度脈沖超聲處理可明顯升高高糖模型hPDLSCs中Wnt1、Wnt10b及β-catenin的蛋白相對表達(dá)水平（均P<0.05），且超聲強(qiáng)度為90 mW/cm2時效果最為明顯（均 P<0.05）。

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組hPDLSCs的細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期分布情況（%，Mean±SD，n=3）

表2 熒光比色法檢測各組hPDLSCs中的Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9活性（%，Mean±SD，n=3）

圖1 反轉(zhuǎn)錄PCR檢測各組人牙周膜干細(xì)胞中Wnt1、Wnt10b及β-catenin的mRNA表達(dá)

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組人牙周膜干細(xì)胞中Wnt1、Wnt10b及β-catenin的蛋白表達(dá)

3 討論與結(jié)論

低強(qiáng)度脈沖超聲可抑制炎癥反應(yīng)，緩解糖尿病引起的病理反應(yīng)[10-12]。但目前尚缺乏關(guān)于低強(qiáng)度脈沖超聲對高糖誘導(dǎo)hPDLSCs損傷的作用研究，本研究對此進(jìn)行了探討并對其機(jī)制進(jìn)行了分析，以期為糖尿病性牙周炎的治療提供借鑒。本研究中與正常對照組相比，高糖模型組hPDLSCs的增殖活性降低、細(xì)胞凋亡率升高，表明高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型建模成功；而經(jīng)低強(qiáng)度脈沖超聲處理后，高糖誘導(dǎo)的hPDLSCs增殖活性升高、細(xì)胞凋亡率降低，表明低強(qiáng)度脈沖超聲處理可明顯緩解高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。同時，流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)刺激對hPDLSCs的細(xì)胞周期分布無明顯影響。

在調(diào)控細(xì)胞代謝中，Bax蛋白可激活線粒體通透性轉(zhuǎn)化孔的開放，導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)和功能紊亂，而Caspase可激活蛋白外流，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13-14]。本研究中經(jīng)高糖誘導(dǎo)后hPDLSCs中的Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9活性明顯升高；再經(jīng)低強(qiáng)度脈沖超聲干預(yù)后，細(xì)胞中的Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9活性明顯降低，表明低強(qiáng)度脈沖超聲處理可減少細(xì)胞凋亡。Wnt信號通路主要由3條分支通路構(gòu)成，即Wnt/平面細(xì)胞極性（PCP）信號通路、Wnt/Ca2+信號通路和經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路。其中經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路是近年來細(xì)胞生物學(xué)研究的一大熱點(diǎn)，其在調(diào)控細(xì)胞增殖分化、功能活化及細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果顯示，高糖刺激可明顯降低Wnt1、Wnt10b及β-catenin的mRNA和蛋白表達(dá)水平，由此推斷高糖可能通過降低Wnt1、Wnt10b及β-catenin的表達(dá)水平抑制細(xì)胞的增殖活性；而低強(qiáng)度脈沖超聲可提高細(xì)胞增殖活性，其可能是通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路實(shí)現(xiàn)的，且超聲強(qiáng)度為90 mW/cm2時對細(xì)胞生物學(xué)特性的影響最為明顯。

高糖條件可促進(jìn)hPDLSCs凋亡并可抑制細(xì)胞的增殖活性，對細(xì)胞周期分布無明顯影響；而低強(qiáng)度脈沖超聲可明顯改善高糖誘導(dǎo)的hPDLSCs損傷，且超聲強(qiáng)度為90 mW/cm2時效果最為理想，其可能是通過降低 Caspase-3、Caspase-6、Caspase-9活性和上調(diào)Wnt1、Wnt10b及β-catenin的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的，這為低強(qiáng)度脈沖超聲用于臨床治療糖尿病性牙周炎提供了借鑒和依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突