NO供體型咖啡酸酯類衍生物的合成及其抗腫瘤活性研究

陳維珍

黃山職業(yè)技術學院醫(yī)學系，安徽黃山,245000

咖啡酸，又名3，4-二羥基肉桂酸，是廣泛分布于植物中的一種酚性芳香酸類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗神經損傷、抑菌抗病毒、改善糖尿病、抗肝纖維化等多種生理活性[1-3]，一些天然的咖啡酸類化合物能抑制多種腫瘤細胞生長、分化、增殖，促腫瘤細胞凋亡，降低抗癌藥物不良反應，防止和逆轉化學物致癌作用[4-6]，如蜂膠中的咖啡酸苯乙酯(CAPE)、迷迭香酸、丹參素、阿魏酸、丹酚酸B[7-9]等；楊葉等[10]發(fā)現咖啡酸可通過影響microRNA調控網絡以起到抗癌的作用，另一方面， 咖啡酸又能通過上調腫瘤細胞內線粒體活性氧水平，誘導腫瘤細胞凋亡。在抗腫瘤方面，咖啡酸不僅自身作用極大，還可與其他藥物產生協同作用?？Х人岫拘缘?，安全性高，但由于其水溶性強，親脂性差，對其代謝動力學產生不良影響，這在一定程度上限制了它的開發(fā)和利用?？Х人岱肿咏Y構獨特而簡單，易于進行結構修飾并能方便地引入各種功能基團，為研發(fā)高效、低毒、具有靶向性的咖啡酸類抗腫瘤藥物提供了良好的結構基礎。因此，運用現代藥物開發(fā)的一些理念和手段將咖啡酸作為先導化合物進行進一步的研究、開發(fā)是必要且可行的。

研究發(fā)現，咖啡酸經過羧基酯化后脂溶性提高，穿透生物膜的能力增強，抗腫瘤活性將增強，一些具有高生物活性或具有臨床治療作用的咖啡?；Y構修飾及改造物已見報道[11-13](見圖1)。

圖1 咖啡酸結構修飾和改造物

NO是體內重要的信使分子，參與許多重要的生理過程。高濃度的NO可誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤的擴散和轉移[14]。呋咱氮氧化物是重要的NO供體之一，在體內可釋放高濃度NO，抑制腫瘤生長[15]。研究表明，將具有一定抗腫瘤活性的化合物與呋咱氮氧化物偶聯，得到的偶聯物可發(fā)揮協同效應，增強抗腫瘤活性[16-17]。為此，本文擬以咖啡酸為先導化合物，將其用不同的連接臂與呋咱氮氧化物相結合，設計、合成NO供體型咖啡酸酯類衍生物，并采用MTT法對其抗腫瘤活性進行研究。

1 儀器與試劑

Nicolet Avatar 370DTGS 型紅外光譜儀，Bruker AVNCE-400 MHz 超導核磁共振儀，Agilent 1100 series LC-MSD 液質聯用儀。薄層硅膠G板(合肥森瑞有限公司)，柱色譜用硅膠(青島海洋化工有限公司)，咖啡酸(含量>98%，成都德思特生物技術有限公司)；苯硫酚、二氯甲烷(CH2Cl2)、氯乙酸、發(fā)煙硝酸、30%雙氧水(H2O2),冰醋酸、三乙胺(Et3N)、氯化亞砜(SOCl2)、二氧六環(huán)乙二醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、1，5-戊二醇、1,6-己二醇等均為分析純，由中國醫(yī)藥集團提供；噻唑藍(MTT)試劑(阿拉丁試劑)、胰蛋白酶消化液(上海雅心生物技術有限公司)、10%胎牛血清(滁州仕諾達生物科技有限公司)； 人結腸癌SW620和人乳腺癌MDA-MB-231細胞株來自安徽科技學院藥理課題組。

2 方 法

2.1 合成路線的設計

NO供體型咖啡酸酯類衍生物的合成參照文獻[18]，先合成苯磺酰呋咱氮氧化物4，再將其與不同的二醇化合物進行反應合成不同碳鏈的呋咱二醇化合物5a～5e。將咖啡酸羧基進行酰氯化，提高其?；钚?，在三乙胺為縛酸劑的作用下，將其與不同連接臂的呋咱氮氧化物5a～5e進行酯化，合成目標化合物7a～7e，見圖2。

圖2 目標化合物的合成路線

2.2 實驗步驟

2.2.1 苯硫乙酸(2)的合成

取22.0 g(0.20 mol)硫酚和8.0 g(0.20 mol)氫氧化鈉溶于100 mL 95 %乙醇中 ,加入到18.9 g(0.20 mol)氯乙酸和 12.7 g(0.12 mol)碳酸鈉配成的200 mL水溶液中,室溫攪拌3 h后,再回流 1 h,冷卻至室溫后,減壓除去乙醇,用6 mol/ L鹽酸調pH至2,有白色沉淀生成，過濾，干燥得白色晶體25.9 g,收率77%。

2.2.2 3,4-二苯磺?；辉?4)的合成

取16.8 g(0.10 mol)化合物1溶于裝有80 mL冰醋酸的圓底燒瓶中,緩慢滴加20 mL 30%H2O2,室溫攪拌3 h后緩慢滴加 40 mL發(fā)煙硝酸,控制內溫不超過40 ℃。滴畢升溫至100 ℃反應 。反應4 h后冷卻至室溫,析出白色針狀結晶。過濾,干燥得14.6 g,收率80%。

2.2.3 二醇苯磺?；辉刍衔?5a～5e)的合成

將1 g(2.7mmol)化合物3溶于10 mL四氫呋喃中 ,攪拌下加入不同二醇化合物(10.0 mmol),滴加0.5 mL(3 mmol)25%氫氧化鈉水溶液,室溫下攪拌反應2 h,TLC檢測進程，原料反應完全后，將反應液傾入20 mL水中,乙酸乙酯萃取(20 mL ×3),合并有機相后加飽和食鹽水洗滌,無水硫酸鈉干燥。過濾后濾液濃縮。硅膠柱色譜分離∶V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=1∶4 ,得白色固體,產率55%～78%。

2.2.4 咖啡酰氯(6)的合成

嚴格控制好無水條件操作。準確稱取1.8 g咖啡酸(10.0 mmol) 裝于100 mL圓底燒瓶，加入二氧六環(huán)20 mL使之溶解，5～7滴DMF,室溫下緩慢加入SOCl2約4 mL，安裝好氯化鈣干燥裝置和尾氣吸收裝置，回流反應約2 h后，常溫減壓回收溶劑及未反應的SOCl2得白色結晶1.7 g，收率85.8%。

2.2.5 目標化合物NO供體型咖啡酸酯類衍生物(7a～7e)的合成通法

取前步制得的化合物(6)1.0 g(約5.0 mmol)溶于二氯甲烷中，冰浴條件下滴加到二醇呋咱(5a～5e)和三乙胺的二氯甲烷溶液中，滴加完畢，升至室溫攪拌反應，TLC跟蹤反應進程。反應結束后，將反應液倒入100 mL水中，二氯甲烷萃取(50×3)，合并有機相，無水硫酸鈉干燥。過濾，濾液減壓濃縮，柱層析(流動相為 EA∶PE=1∶4，V∶V)得目標化合物7a～7d。

2.2.6 細胞毒活性測試

以阿霉素為陽性對照，咖啡酸為原型藥對照組，以人結腸癌細胞SW620、人乳腺癌細胞MDA-MB-231為受試細胞株，用MTT比色法對合成的化合物7a～7e進行體外細胞增殖活性實驗。方法：取對數生長期的細胞，用胰酶消化細胞，離心后用含10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基將其制成單細胞懸液，以8×104個/mL 的密度接種于96 孔板，每孔100 μL，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h換液。按濃度梯度(2.5 μg/mL,5 μg/mL,10 μg/mL,20 μg/mL,40 μg/mL)加入待測藥物，各濃度設3個復孔，每孔100 μL,置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)48 h。細胞離心，吸去孔內培養(yǎng)上清液，每孔各加入新鮮的細胞培養(yǎng)基100 μL和MTT(5 mg/mL)20 μL，恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。離心10 min 后吸去孔內培養(yǎng)上清液，每孔加150 μL DMSO，搖床振搖7～8 min。之后，用酶標儀在波長為490 nm 處測出各孔的吸光度值(OD值)。按如下公式計算對細胞生長的影響：細胞生長抑制率(%)=[(OD試驗-OD空白)/(OD對照-OD空白)]×100。并通過計算軟件算出不同藥物對不同腫瘤細胞株的半數抑制濃度(IC50)。

3 結果與討論

3.1 目標化合物的實驗數據

化合物咖啡酸乙二醇呋咱酯(7a)：淡黃色粉末1.16 g， 收率52 %，H-NMR(500MHz,DMSO)δ:4.45(t，2H ，-OCH2-)，5.22(t，2H，-OCH2-)，6.30(d，1H，J=16 Hz ，-CH=CH-)，6.76(d，J=8.33 Hz，1H，Ar-H)，7.02 (dd，J=8.24，1.85 Hz，1H，Ar-H)，7.06(d，J=1.85 Hz，1H，Ar-H)，7.55(d，1H，J=16 Hz，-CH=CH-)，7.50～ 7.88(m，5H ，ArH)，8.90(s，1H，OH)，9.57(s，1H，OH)。ESI-MS,m/z(%):449.21[M+H]，其質譜圖如圖3。

圖3 目標化物7a的MS圖譜

化合物咖啡酸丙二醇呋咱酯(7b)：淡黃色粉末1.29 g， 收率56%，H-NMR(500 MHz,DMSO)δ:2.25(m，2H，CH2)4.43(t，2H，-OCH2-)，5.20(t，2H，-OCH2-)，6.30(d，1H，J=16 Hz，-CH=CH-)，6.75(d，J=8.33 Hz，1H，Ar-H)，7.01(dd，J=8.24，1.85 Hz，1H，Ar-H)，7.07(d，J=1.85 Hz，1H，Ar-H)，7.55(d ，1H，J=16 Hz ，-CH=CH-)，7.48～7.86(m，5H ，Ar-H)，8.90(s，1H，OH)，9.54(s，1H，OH)。ESI-MS,m/z(%):463.09[M+H]

化合物咖啡酸丁二醇呋咱酯(7c)：淡黃色粉末1.62 g， 收率68 %，H-NMR(500 MHz,DMSO)δ:1.77(m，2H，CH2)，2.10(m，2H，CH2)，4.45(t，2H，-OCH2-)，5.22(t，2H，-OCH2-)，6.30(d ，1H，J=16 Hz，-CH=CH-)，6.75(d，J=8.33 Hz，1H，Ar-H)，7.02(dd，J=8.24，1.85 Hz，1H，Ar-H)，7.07(d，J=1.85 Hz，1H，Ar-H)，7.54(d ，1H，J=16 Hz，-CH=CH-)，7.48～7.92(m，5H，Ar-H)，8.91(s，1H，OH)，9.55(s，1H，OH)。ESI-MS,m/z(%):476.89[M+H]

化合物咖啡酸戊二醇呋咱酯(7d)：淡黃色粉末1.42 g，收率58%，H-NMR(500 MHz,DMSO)δ:1.59(m，2H，CH2)，1.77(m，2H，CH2)，2.10(m，2H，CH2)，4.45(t，2H，-OCH2-)，4.51(t，2H，-OCH2-)，5.22(t，2H，-OCH2-)，5.28(m，1H，-OCH -)，6.32(d，1H，J=16 Hz，-CH=CH-)，6.76(d，J=8.33 Hz，1H，Ar-H)，7.06(d，J=1.85 Hz，1H，Ar-H)，7.02(dd，J=8.24，1.85 Hz，1H，Ar-H)，7.55(d，1H，J=16 Hz ，-CH=CH-)，7.45～7.80(m，5H，ArH)，8.88(s，1H，OH)，9.56(s，1H，OH)。ESI-MS,m/z(%):491.30[M+H]

化合物咖啡酸己二醇呋咱酯(7e)：淡黃色粉末1.33 g，收率53%，H-NMR(500 MHz,DMSO)δ:1.39(m，2H，CH2)，1.58(m，2H，CH2)，1.77(m，2H，CH2)，2.15(m，2H，CH2)，4.44(t，2H，-OCH2-)，4.53(t，2H，-OCH2-)，5.25(t，2H，-OCH2-)，5.32(m，1H，-OCH-)，6.30(d ，1H，J=16 Hz，-CH=CH-)，6.76(d，J=8.33 Hz，1H，Ar-H)，7.06(dd，J=8.24，1.85 Hz，1H，Ar-H)，7.14(d，J=1.85 Hz，1H，Ar-H)，7.45(d，1H，J=16 Hz，-CH=CH-)，7.56～ 7.92(m，5H，ArH)，8.99(s，1H，OH)，9.67(s，1H，OH)。ESI-MS,m/z(%):504.99[M+H]

3.2 細胞毒活性結果

采用MTT 法，以人結腸癌細胞SW620、人乳腺癌細胞MDA-MB-231為模型，以阿霉素和咖啡酸為對照藥，測定5 個NO供體型咖啡酸衍生物體外對腫瘤細胞生長抑制作用，實驗結果見表1。

表1 目標化合物對腫瘤細胞的生長抑制情況

從表1可知，目標化合物7a～7e均有較強的抗腫瘤活性。其對人結腸癌細胞SW620、人乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞株的IC50值均達較低水平，強于對照藥咖啡酸。部分化合物活性強于陽性對照藥阿霉素。其中化合物7b對結腸癌SW620細胞株增殖抑制活性最強,化合物7c對乳腺癌MDA-MB-231細胞株增殖抑制活性最強。

4 結 論

研究表明，將咖啡酸與NO供體呋咱氮氧化物通過不同連接臂偶聯制成酯衍生物，可使兩者發(fā)揮協同作用，提高抗腫瘤能力。當連接臂為2個碳時，對結腸癌SW620增殖活性抑制最強，當連接臂為3個碳時，對乳腺癌MDA-MB-231的增殖活性最佳。7b和7c為未見文獻報道的新化合物，有進一步深入研究的價值。