熒光染色聯(lián)合1,3-β-D葡聚糖檢測對慢性阻塞性肺疾病并發(fā)真菌感染的診斷價值

吳競 許巖 方詠梅 張晶晶 章燕 鐘峰

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)患者往往免疫力低下，并且醫(yī)原性侵入治療及抗菌藥物的不合理使用會導(dǎo)致發(fā)生多種臨床并發(fā)癥，加重患者疾病的嚴(yán)重程度[1]。研究顯示，COPD 患者中約80%并發(fā)侵襲性肺部真菌感染(invasive pulmonary fugal infection，IPFI)，且病死率較高(72%～95%)[2-3]。目前，臨床常用于檢測IPFI的方法主要包括血清學(xué)的1,3-β-D葡聚糖檢測(G試驗(yàn))和半乳糖甘露醇聚糖抗原檢測(GM試驗(yàn))，形態(tài)學(xué)的氫氧化鉀(KOH)涂片檢測。但是，以上方法均存在一定的不足。本研究中，筆者采用熒光染色、G試驗(yàn)及降鈣素原(PCT)檢測COPD并發(fā)IPFI患者，以探討各指標(biāo)單獨(dú)檢測及聯(lián)合檢測對COPD并發(fā) IPFI的早期診斷價值。

資料和方法

1.研究對象：搜集2019年1—12月皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院診斷為COPD，且經(jīng)廣譜抗生素規(guī)范治療5 d后臨床相關(guān)癥狀未能緩解，體溫38 ℃未能下降或下降后復(fù)升的174例患者作為研究對象。其中，男148例(85.06%)，女26例(14.94%)；年齡范圍54～92歲，平均年齡為(69.41±8.54)歲，病程范圍為6～14年，平均病程為(10.62±3.63)年。研究對象于入院后完善高分辨率胸部CT掃描，確定病灶部位和病變程度，結(jié)合其癥狀體征、影像學(xué)、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果和抗真菌藥物治療效果等，將患者分為臨床確診IPFI 組、非 IPFI 組和擬診 IPFI 組，其中確診組及擬診組作為觀察組(81例)，非IPFI組作為對照組(93例)。觀察組及對照組年齡及其他基礎(chǔ)性疾病患病差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，臨床醫(yī)原性因素分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

2.納入排除標(biāo)準(zhǔn)：COPD診斷參考《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)》[4]。肺真菌病診斷參照《肺真菌病診斷和治療專家共識》[5]。排除病例資料不完全者、1周內(nèi)食用菌菇類食品者、靜脈滴注白蛋白或免疫球蛋白者、服用抗腫瘤藥品及干擾試驗(yàn)結(jié)果的抗生素者，以及血液透析者。

3.標(biāo)本采集：于研究對象發(fā)熱當(dāng)日抽取外周靜脈血(4 ml)送檢，進(jìn)行G試驗(yàn)和PCT檢測；同時根據(jù)患者的實(shí)際情況，留取痰標(biāo)本或肺泡灌洗液進(jìn)行熒光染色檢查。標(biāo)本采集過程中嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作的原則，避免污染。

4.熒光染色：將留取的痰標(biāo)本或肺泡灌洗液采用離心半徑10 cm，4000 r/min離心5 min后，直接置于載玻片上，滴加1滴熒光染液后覆上蓋玻片，輕壓蓋玻片靜待 2 min，待染液與標(biāo)本充分混勻后，在熒光顯微鏡下觀察，查見熒光標(biāo)記的菌絲或孢子即為陽性。熒光染色液購于珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

5.G試驗(yàn)：采用動態(tài)濁度法測定血液標(biāo)本中1,3-β-D葡聚糖含量，試劑盒購于湛江博康海洋生物有限公司，所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。參考值為0～170 ng/L，同一標(biāo)本連續(xù)檢測3次并記錄均值。

6.血清PCT檢測：采用化學(xué)發(fā)光法檢測血漿中的PCT水平，儀器為A2000 Plus全自動化學(xué)發(fā)光儀(購自鄭州安圖生物工程股份有限公司)，參考值為0～0.05 μg/L。

表1 各臨床資料在觀察組與對照組間的比較

結(jié) 果

1.檢測結(jié)果：觀察組熒光染色陽性率，G試驗(yàn)及PCT檢測值均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，具體見表2。

2.檢測效能：以臨床診斷為參照標(biāo)準(zhǔn)，熒光染色法檢測的敏感度及特異度最高。熒光染色及G試驗(yàn)聯(lián)合檢測的敏感度和特異度分別為96.2%和76.3%，陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為83.1%和88.7%，曲線下面積(AUC)為0.894，明顯優(yōu)于所有單個檢測項(xiàng)目結(jié)果(表3，圖1)。

討 論

COPD在呼吸系統(tǒng)疾病中較為常見，且發(fā)病率呈上升趨勢，其高患病率及病死率給患者的生存質(zhì)量及臨床診療帶來了極大的困擾；由于患者病情加重的主要原因多為長時間使用糖皮質(zhì)激素治療及侵入性操作，進(jìn)而導(dǎo)致患者并發(fā)IPFI，且IPFI的臨床表現(xiàn)不明顯，治療轉(zhuǎn)歸情況較差[6-7]。因此，盡早及時診斷COPD并發(fā)IPFI，對制定相應(yīng)臨床治療方案極為重要。

圖1 不同檢測方法檢測COPD并發(fā)IPFI的ROC曲線

目前，臨床常用檢測IPFI的方法主要有KOH涂片法、G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)，血液檢測主要是針對真菌代謝產(chǎn)物、細(xì)胞壁抗原等物質(zhì)，由于大多數(shù)真菌細(xì)胞壁上廣泛含有1,3-β-D葡聚糖，檢測血漿中特異性的真菌感染物質(zhì)有助于盡早確診[8]。但這些檢測方法也存在一定的不足，例如，使用纖維素膜進(jìn)行血

表2 觀察組與對照組熒光染色、G試驗(yàn)及PCT檢測結(jié)果的比較

表3 采用ROC曲線以臨床診斷為參照標(biāo)準(zhǔn)評價不同檢測方法對COPD并發(fā)IPFI的檢測效能

液透析、靜脈輸注免疫球蛋白或多糖類抗癌藥物均會導(dǎo)致假陽性的結(jié)果。本次研究中，筆者采用的熒光染色法是通過熒光素標(biāo)記的幾丁質(zhì)酶，與真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)特異性結(jié)合形成復(fù)合物，并在激發(fā)光下(波長340～380 nm)發(fā)出藍(lán)色熒光。在所有單獨(dú)使用的檢測方法中，熒光染色法的敏感度及特異度最高。相比較傳統(tǒng)的檢測方法，熒光染色法在診斷COPD并發(fā)IPFI中具有快速、早期、效能高、檢測費(fèi)用低等優(yōu)勢。既往研究表明，熒光染色法在真菌性角膜炎及其他淺部真菌感染診斷中的敏感度及特異度均較高，適用于篩查患者是否存在真菌性感染[9-10]。ROC曲線分析顯示，熒光染色及血清G試驗(yàn)聯(lián)合檢測可提高檢測的敏感度， AUC為0.894，優(yōu)于所有單個檢測項(xiàng)目結(jié)果，且高于既往文獻(xiàn)利用G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)及血清炎癥因子水平聯(lián)合檢測的結(jié)果(AUC為0.862)[11]。