GeneXpert MTB/RIF技術(shù)對結(jié)核病及對利福平耐藥性檢測的價值

唐桂華 孫倩 王瀟凡 咸海濱 張倩 楊小薇 王莉

有效遏制耐藥結(jié)核病在我國的蔓延是全面實現(xiàn)2035年終止結(jié)核病戰(zhàn)略的重要組成部分[1]。耐藥監(jiān)測是全面了解不同地區(qū)耐藥結(jié)核病流行狀況的重要策略，然而傳統(tǒng)藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)操作繁瑣，對生物安全硬件的需求較高，限制了其在基層耐藥監(jiān)測的應(yīng)用[2]。2015年伴隨著全自動化GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert”)技術(shù)的出現(xiàn)，世界衛(wèi)生組織推薦其用于利福平耐藥的監(jiān)測[3]。本研究收集北京市昌平區(qū)2019年收治的全部疑似肺結(jié)核患者，分析GeneXpert在基層利福平耐藥監(jiān)測中的可行性。

資料和方法

一、資料收集

1.研究對象：回顧性分析2019年1月1日至12月31日就診于北京市昌平區(qū)結(jié)核病防治所的全部肺結(jié)核可疑癥狀者，共1719例。均為北京市昌平區(qū)綜合醫(yī)療機構(gòu)及基層醫(yī)療機構(gòu)發(fā)現(xiàn)的肺結(jié)核可疑癥狀者，全部轉(zhuǎn)診到北京市昌平區(qū)結(jié)核病防治所。依據(jù)2018年正式實施的肺結(jié)核診斷標準[4]，排除587例(34.1%)其他疾病患者，550例(32.0%)非活動性肺結(jié)核患者，共確診582例(33.9%)活動性肺結(jié)核患者。

582例活動性肺結(jié)核患者中，237例(40.7%)患者有實驗室病原學(xué)依據(jù)(同一例患者同一份痰標本經(jīng)過培養(yǎng)后采用結(jié)核分枝桿菌MPB64抗原進行菌種鑒定，以及采用GeneXpert檢測系統(tǒng)進行檢測)，診斷為病原學(xué)陽性患者，其余345例(59.3%)患者為臨床診斷患者。

2.數(shù)據(jù)收集：所有疑似患者的社會學(xué)信息均來自于《結(jié)核病信息管理系統(tǒng)》，包括患者的性別、年齡等。

3.研究對象基本情況：237例患者18～76歲，中位年齡35歲；男171例，女66例?；颊咭粤鲃尤丝跒橹鳎?8.4%；最主要職業(yè)類型為無業(yè)，占27.8%；初治患者占90.7%。見表1。

表1 237例納入耐藥性分析患者的基本情況

二、研究方法

1.主要儀器和試劑：GeneXpert MTB/RIF系統(tǒng)(美國Cepheid公司)、涂片(南通海倫生物醫(yī)學(xué)器材制造有限公司)、抗酸染色液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)、顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司)、培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、中性羅氏培養(yǎng)基和利福平耐藥性固體比例法藥敏培養(yǎng)基(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。

2.實驗室檢查方法：依據(jù)《中國結(jié)核病防治規(guī)劃：痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》，留取3份患者的痰標本。采用痰直接涂片萋尼染色檢查法，選取兩份痰標本開展羅氏固體培養(yǎng)，在完成固體培養(yǎng)后，對培養(yǎng)陽性物采用結(jié)核分枝桿菌MPB64抗原進行菌種鑒定，再采用羅氏固體比例法進行利福平耐藥性檢測，并以此結(jié)果作為利福平耐藥性分析的參考標準[5]。一份性狀較好的標本開展GeneXpert檢測，取約1.0 ml痰標本，使用2倍體積的前處理液消化，劇烈振蕩20 s后，靜置15 min，取2.0 ml消化液加入GeneXpert試劑盒中，并將試劑盒裝于GeneXpert檢測設(shè)備，約2 h后，設(shè)備自動報告標本中是否含有結(jié)核分枝桿菌及其對利福平的敏感性。

三、相關(guān)定義

利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌(rifampicin-resistant tuberculosis，RR-TB)是指結(jié)核病患者感染的結(jié)核分枝桿菌菌株經(jīng)體外固體比例法藥敏試驗證實對利福平耐藥，其在rpoB基因81-bp的利福平耐藥決定區(qū)發(fā)生基因突變，被GeneXpert檢測并報告為耐利福平結(jié)核分枝桿菌。初治患者定義為從未使用過抗結(jié)核藥品進行治療，或使用抗結(jié)核藥品治療時間≤1個月者；復(fù)治患者定義為曾經(jīng)接受過抗結(jié)核藥品治療至少1個月者，包括復(fù)發(fā)、初治失敗和返回的患者[6]。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料采用“率(%)”或“構(gòu)成比(%)”表示，采用χ2檢驗進行比較。當理論頻數(shù)小于5時，采用Fisher精確概率法進行比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、3種檢測方法之間的比較

237例患者均開展了痰涂片、羅氏固體培養(yǎng)及GeneXpert檢測，3種方法的陽性檢出率分別為25.3%(60/237)、79.7%(189/237)和96.2%(228/237)，GeneXpert的陽性檢出率明顯高于羅氏固體培養(yǎng)(χ2=249.742，P<0.001)和痰涂片檢查(χ2=30.332，P<0.001)。

二、3種檢測方法的檢測效能比較

以臨床診斷結(jié)果作為參考標準，對3種檢測方法的診斷效能進行比較。1719例患者痰涂片檢查的敏感度為10.3%(60/582)，特異度為100.0%(1137/1137)，一致率為69.6%(1197/1719)；固體培養(yǎng)方法的敏感度為32.5%(189/582)，特異度為100.0%(1137/1137)，一致率為77.1%(1326/1719)；GeneXpert技術(shù)的敏感度為39.2%(228/582)，特異度為99.9%(1136/1137)，一致率為79.3%(1364/1719)。見表2。

表2 以臨床診斷為參考標準對3種檢測方法檢測效能的評價

表3 以羅氏固體比例法藥敏試驗為參考標準評價GeneXpert技術(shù)對利福平耐藥性的診斷效能

三、GeneXpert技術(shù)對利福平耐藥性的檢測效能

以羅氏固體比例法利福平耐藥性檢測結(jié)果為參考標準，評價GeneXpert技術(shù)對利福平耐藥的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、一致率。見表3。

四、不同患者耐藥率比較

在237例患者中，兩種檢測技術(shù)共發(fā)現(xiàn)15例RR-TB患者，提示北京市昌平區(qū)利福平耐藥率為6.3%。其中215例初治患者中，RR-TB患者為11例，原發(fā)耐藥率為5.1%；22例復(fù)治患者中，RR-TB 患者為4例，獲得性耐藥率為18.2%，復(fù)治患者利福平耐藥率明顯高于初治患者(Fisher確切概率法，P=0.039)。

討 論

耐藥監(jiān)測是科學(xué)制訂耐藥防治策略的重要依據(jù)。本研究分析了GeneXpert用于基層結(jié)核病防治所利福平耐藥監(jiān)測的可行性，在北京市昌平區(qū)納入的患者中，利福平耐藥率為6.3%，其水平與上海(7.0%)[7]和天津(7.8%)[8]等直轄市水平接近，低于山西(13.3%)[9]、云南(8.7%)[10]和遼寧(18.9%)[11]等地的數(shù)據(jù)，表明我國不同地區(qū)的利福平耐藥水平呈現(xiàn)出明顯的地域差異。一項北京地區(qū)21世紀初期開展的監(jiān)測數(shù)據(jù)表明，北京地區(qū)對利福平的耐藥率為5.5%[12]，略低于本研究的結(jié)果，提示在過去的10余年時間，利福平的暴露可能引起了本地區(qū)結(jié)核分枝桿菌對利福平耐藥率的上升。

本研究中，昌平區(qū)的582例活動性肺結(jié)核患者中，僅40.7%的患者為病原學(xué)診斷患者。盡管這個比例高于我國的平均水平，但是略低于我國在“十三五”規(guī)劃中提出的50%的目標[13]。不可否認，近60%的患者僅通過影像學(xué)及臨床癥狀進行診斷，可能存在較大的非特異性，造成診斷偏差，因此提示需要綜合使用多種標本類型及新型診斷技術(shù)，以提高對基層患者的診斷[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，GeneXpert陽性檢出率(39.2%)高于固體培養(yǎng)(32.5%)，筆者推測這種差異的原因可與以下2個方面有關(guān)。(1)結(jié)核病定點醫(yī)療機構(gòu)患者留取的痰標本中，有60%左右的痰液為唾液痰，導(dǎo)致固體培養(yǎng)陽性率低[15]。黏稠痰液和經(jīng)消化處理后剩余的痰液殘渣，可增加痰液處理后離心時分枝桿菌菌體浮力密度，獲取數(shù)量更多的結(jié)核分枝桿菌，而唾液痰中黏稠部分少，結(jié)核分枝桿菌數(shù)量少。(2)臨床樣本使用固體培養(yǎng)法較BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)陽性率低，本研究培養(yǎng)采用固體培養(yǎng)法，也可能是培養(yǎng)陽性率低于GeneXpert檢出率的原因之一[16]。

在最初納入的1719例疑似肺結(jié)核患者中，有587例為其他疾病患者，在這些患者的檢查中，無涂片陽性和培養(yǎng)陽性的患者，只有1例GeneXpert結(jié)果為陽性。這種差異可認為是患者先前用藥導(dǎo)致體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌被殺死或活性下降導(dǎo)致培養(yǎng)率降低，該例患者有結(jié)核病治療史，曾服用過抗結(jié)核藥品，此次就診是因為其他疾病，已排除結(jié)核病，但是GeneXpert是基于PCR原理，無法區(qū)分死菌和活菌，其可以檢測到因服用抗結(jié)核藥品后死亡的結(jié)核分枝桿菌的DNA，但培養(yǎng)法只針對有活性的結(jié)核分枝桿菌，因此造成了分子檢測假陽性的發(fā)生。盡管這種假陽性在臨床中發(fā)生的概率極低，但是對于有過往治療史的結(jié)核病患者在出現(xiàn)GeneXpert陽性結(jié)果時需要慎重考慮假陽性的發(fā)生[17]。

相比于傳統(tǒng)的表型藥敏開展的耐藥監(jiān)測，使用GeneXpert技術(shù)具有一定的優(yōu)勢。首先，GeneXpert的操作高度自動化，避免使用高級別的生物安全實驗室及繁瑣的操作，特別適用于硬件條件不具備的基層開展；其次，基于基因型的GeneXpert檢測的結(jié)果更穩(wěn)定，表型藥敏受實驗室人員熟練程度、培養(yǎng)基質(zhì)量、藥品質(zhì)量、菌株生長狀態(tài)等多種因素的影響，因此在檢測的穩(wěn)定性方面GeneXpert對基層開展更具優(yōu)勢；再次，本研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)陽性的標本僅為GeneXpert陽性患者的82.9%(189/228)，意味著采用GeneXpert可以檢測出更多的陽性樣本，以減少漏診；最后，在全球基金的資助下，全國超過1/3 的基層實驗室配備了GeneXpert設(shè)備[18]。因此，將已有的設(shè)備和診斷流程整合入耐藥監(jiān)測方案，對于常規(guī)開展耐藥監(jiān)測具有重要的實用價值。