組蛋白乙?；贗gA 腎病發(fā)病中的作用

戴 芹，王偉銘

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院徐匯醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 200031；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 200025

IgA 腎?。↖gA nephropathy，IgAN）是全世界最常見(jiàn)的腎小球疾病，也是引起腎衰竭的重要病因[1]，IgAN 更是導(dǎo)致年輕人終末期腎病的最常見(jiàn)原因[2]。半乳糖缺乏的IgA1（galactose deficient IgA1，Gd-IgA1）是導(dǎo)致IgAN 最關(guān)鍵的致病因素，血漿Gd-IgA1 被認(rèn)為是能夠預(yù)測(cè)IgAN預(yù)后的重要指標(biāo)，是IgAN 重要的早期診斷和臨床預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物[3]。但是，Gd-IgA1 產(chǎn)生的機(jī)制目前仍不清楚。表觀遺傳學(xué)在疾病發(fā)病中的作用受到日益關(guān)注，賴氨酸殘基的翻譯后乙?；殉蔀樗姓婧松镏械年P(guān)鍵調(diào)節(jié)機(jī)制[4]。為此，本研究從組蛋白乙?；嵌忍剿鱅gAN 的發(fā)病機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

納入2014 年1 月—2018 年12 月于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院腎內(nèi)科住院的IgAN 患者30 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①新確診的原發(fā)性IgAN 患者。②之前從未用過(guò)激素、免疫抑制劑等治療。③年齡15 ～65 歲。④ 慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）1 ～4 期的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)： ① 因腫瘤、高血壓、代謝性疾病（如糖尿病）、乙肝、自身免疫性疾病（如紅斑狼瘡、甲亢等）、遺傳性腎病、系統(tǒng)性血管炎等繼發(fā)性因素引起者。② 肝功能指標(biāo)異常者。③ 妊娠或哺乳期婦女。④有感染或應(yīng)激情況存在者。⑤ 嚴(yán)重心血管疾病如心功能不全、惡性高血壓、心律失常者。⑥ CKD5 期及已經(jīng)腎替代治療者。研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)為No.2013-29），所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 材料、試劑與儀器

1.2.1 材料 IgAN 組血液樣本來(lái)源于醫(yī)院住院患者，對(duì)照組的血液樣本來(lái)自瑞金醫(yī)院體檢中心的健康者。收集IgAN 患者（30 例）及對(duì)照組（血樣本16 例）外周血各15 mL 至肝素抗凝管。常溫1 500×g 離心15 min 后的沉淀物用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）1:1 稀釋后充分混勻，用Ficoll 法[5]分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，將單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）約4×106/管，分裝至500μL EP 管中。

IgAN 組腎組織來(lái)自于醫(yī)院腎內(nèi)科的患者經(jīng)皮腎穿刺標(biāo)本，對(duì)照組腎組織樣本來(lái)源于泌尿外科腎癌患者（3例）經(jīng)手術(shù)切除后留取的癌旁正常腎組織。

1.2.2 主要試劑 RNA（Trizol）提取液（美國(guó)Invitrogen），qRT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Invitrogen），人外周血淋巴細(xì)胞分離液（上海普飛），AxyPrep PCR 純化試劑盒（美國(guó)Axygen），染色質(zhì)免疫共沉淀試劑盒（美國(guó)Millipore），組蛋白H3 乙?；綑z測(cè)試劑盒 （美國(guó)EPIGENTEK），組蛋白H4 乙?；綑z測(cè)試劑盒 （美國(guó)EPIGENTEK），cy3-山羊抗兔（英國(guó)Abcam），488-Alex-山羊抗小鼠（英國(guó)Abcam），抗HDAC1 抗體（CHIP 級(jí)，英國(guó)Abcam），抗H3Ac 抗體（ChIP 級(jí)，英國(guó)Abcam），抗H4Ac 抗體（CHIP 級(jí)，英國(guó)Abcam），EpiQuik ? 總的組蛋白提取試劑盒（美國(guó)Epigentek），蛋白酶K（上海生工），RNase A（上海生工），蛋白酶抑制劑復(fù)合物（上海生工），PCR 引物均由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成，其他試劑均為分析純產(chǎn)品。

1.2.3 儀器 低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf），臺(tái)式微量高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf），純水機(jī)（美國(guó)Millipore），酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad），倒置相差顯微鏡及計(jì)算機(jī)成像系統(tǒng)（日本尼康），梯度PCR 儀（美國(guó) MJ-research），Opticon 2 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 儀（美國(guó) Bio-Rad），石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica），微量核酸蛋白定量?jī)x NanoDrop ND-1000（美國(guó) NanoDrop）。

1.3 方法

1.3.1 提取組蛋白 從-80 ℃冰箱中取出1 管“1.2.1”制備的PBMC，冰上熔化；預(yù)裂解液裂解10 min 后低溫離心1 min，棄去上清；用100 μL 的裂解液重懸細(xì)胞，冰孵30 min；超聲破碎儀10 Hz 超聲10 s；低溫離心1 min，收集上清（含有酸溶解的蛋白）至1 支新的EP 管內(nèi)；立即加30 μL 的DTT 平衡液至上清中，將提取的組蛋白分裝后于-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 ELISA 法檢測(cè) 將“1.3.1”提取的組蛋白按照試劑盒的說(shuō)明書步驟調(diào)節(jié)濃度，設(shè)立空白對(duì)照孔、陽(yáng)性對(duì)照孔及樣品檢測(cè)孔，依次加入一抗、二抗，最后顯色，觀察到樣本孔及標(biāo)準(zhǔn)品孔變藍(lán)，每孔加入50μL 終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)處讀各孔的OD 值。

表1 Real-time PCR 引物序列Tab 1 Primer sequence for real-time PCR

1.3.4 染色質(zhì)免疫共沉淀 染色質(zhì)免疫共沉淀法（chromatin immunocoprecipitation，ChIP）用于檢測(cè)各種組蛋白修飾相關(guān)的基因組的特定位點(diǎn)，提示組蛋白修飾的對(duì)象。甲醛交聯(lián)活細(xì)胞的蛋白質(zhì)和相關(guān)的染色質(zhì)后裂解，染色質(zhì)-蛋白復(fù)合體經(jīng)超聲打斷或酶切為約500bp 的DNA 片段，分別用抗H3Ac 抗體和H4Ac 抗體將目的蛋白-染色質(zhì)復(fù)合體從細(xì)胞碎片中分離出來(lái)，純化、分離出DNA 片段，測(cè)定其序列，獲得蛋白質(zhì)與DNA 相互作用的信息。

1.3.5 ChIP-qPCR 檢測(cè) ChIP-qPCR 檢測(cè)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（core 1β1，3-galactosyltransferase，C1GALT1）和唾液酸轉(zhuǎn)移酶（α-N-acetylgala-ctosaminide α-2，6-sialyltransferase 2，ST6GALNAC2）啟動(dòng)子區(qū)H3 和H4 乙?；剑菏褂没騿?dòng)子區(qū)特異的引物擴(kuò)增C1GALT1 和ST6GALNAC2啟動(dòng)子區(qū)域，以10μL 體系進(jìn)行real time-PCR 擴(kuò)增，以對(duì)應(yīng)的input 為對(duì)照。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3 次。啟動(dòng)子區(qū)引物序列見(jiàn)表2。

表2 C1GALT1 和ST6GALNAC2 啟動(dòng)子區(qū)域引物序列Tab 2 Primer sequence of promoter region of C1GALT1 and ST6GALNAC2

1.3.6 組織免疫熒光檢測(cè) IgAN 組和對(duì)照組腎組織樣本的石蠟切片脫蠟至水后抗原修復(fù)，分別加一抗（抗HDAC1 抗體、抗H3Ac 抗體），切片平放于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過(guò)夜；加二抗，避光室溫孵育60 min，將玻片置于PBS中在搖床上洗3 次，5 min/次；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）復(fù)染細(xì)胞核，避光室溫孵育10min 后洗3 次，5min/次。切片稍干后用抗熒光淬滅封片劑封片。切片于倒置相差顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，采用GraphPad Prism5.0 軟件作圖。符合正態(tài)分布的定量資料用x—±s 表示，非正態(tài)分布的定量資料用M（Q1，Q3）表示，定性資料用n（%）表示。采用t 檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的基本特征

研究納入IgAN 組及對(duì)照組。IgAN 組為醫(yī)院收治的IgAN 患者30 例；血液樣本的對(duì)照組為16 例體檢健康者，腎組織樣本的對(duì)照組為3 例腎癌患者手術(shù)切除的癌旁正常腎組織。研究對(duì)象的基本特征見(jiàn)表3。

表3 研究對(duì)象的基本特征比較 Table 3 Comparison of basic characteristics of the experimental groups

2.2 組蛋白乙?；揎棻容^

2 組PBMC 中組蛋白乙?；揎椀谋容^結(jié)果見(jiàn)表4。與對(duì)照組相比，IgAN 組組蛋白H3 乙酰化水平明顯升高（P=0.035），H4 乙?；矫黠@升高（P=0.012）。

表4 IgAN 組與對(duì)照組的PBMC 組蛋白乙?；揎桾ab 4 Level of acetylation of histone in PBMC of IgAN group and control group

2.3 HAT、HDAC 及糖基化酶mRNA 比較

圖1 2 組乙?；嚓P(guān)酶及糖基化酶mRNA 表達(dá)Fig 1 mRNA expression of acetylation related enzyme and glycosylation enzyme in two groups

2 組研究對(duì)象的組蛋白乙?；嚓P(guān)酶HAT、HDAC 及糖基化酶mRNA 比較結(jié)果見(jiàn)圖1，real-time PCR 結(jié)果顯示：IgAN 組組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶P300、CREBBP mRNA的表達(dá)分別是對(duì)照組的（2.81±0.39）倍（P=0.002），（2.44±0.27）倍（P=0.001），見(jiàn)圖1A；組蛋白去乙?；窰DAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC7 和HDAC8 mRNA的表達(dá)分別是對(duì)照組的（2.20±0.18）倍（P=0.001），（0.44±0.08）倍（P=0.035），（0.98±0.18）倍（P=0.690），（1.02±0.21）倍（P=0.924），（1.47±0.25）倍（P=0.045），見(jiàn)圖1B；IgAN 組C1GALT1 mRNA 的表達(dá)是對(duì)照組的（0.28±0.06）倍（P=0.008），ST6GALNAC2 的mRNA 表達(dá)是對(duì)照組的（2.88±0.60）倍（P=0.012），見(jiàn)圖1C。

2.4 C1GALT1 和ST6GALNAC2 啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3 和H4 乙?；?/h3>

用ChIP 法檢測(cè)基因啟動(dòng)子區(qū)乙酰化水平，結(jié)果見(jiàn)圖2。 對(duì)“1.3.4”方法獲得的DNA 樣本及各自的Input 使用引物擴(kuò)增C1GALT1 和ST6GALNAC2 啟動(dòng)子區(qū)域，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，IgAN 組C1GALT1 基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3 和H4 乙?；潭冉档停謩e為[ （0.43±0.12）vs（1.00±0.16），P=0.043] 和[ （0.62±0.06）vs（1.07±0.05），P=0.005]； ST6GALNAC2 基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3 和H4 乙酰化程度均顯著升高，分別為[（3.42±0.76）vs（1.00±0.21），P=0.038]和[（2.07±0.17）vs（1.10±0.20），P=0.021]。

圖 2 C1GALT1 和ST6GALNAC2 啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3 和H4 乙酰化水平Fig 2 H3/H4 acetylation at the C1GALT1 and ST6GALNAC 2 gene promotor region

2.5 腎組織HDAC1 和H3Ac 蛋白表達(dá)情況

IgAN 患者腎組織與對(duì)照組的正常腎組織比較結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，正常腎組織腎小管以及腎小球間質(zhì)中HDAC1 表達(dá)都很少，而H3Ac 蛋白在腎小管和腎小球表達(dá)都較多。與癌旁正常腎組織相比，IgAN 組腎小球及腎小管中HDAC1 表達(dá)明顯增多，而H3Ac 蛋白表達(dá)顯著減少，腎組織呈低乙?；癄顟B(tài)。

圖3 IgAN 組與正常腎組織中HDAC1 和H3Ac 蛋白表達(dá)情況（免疫熒光染色）Fig 3 Expression of HDAC1and H3Ac protein in renal tissue (IF)

3 討論

IgAN 是最常見(jiàn)的腎臟疾病，以腎小球區(qū)IgA 沉積為特征[6]。研究[7]發(fā)現(xiàn)在IgAN 患者冷凍腎組織中均含有Gd-IgA1 特異性IgG 自身抗體，這一發(fā)現(xiàn)提示了Gd-IgA1在IgAN 發(fā)病機(jī)制中的重要性，但I(xiàn)gAN 發(fā)病機(jī)制至今尚未清晰。組蛋白乙?；揎検潜碛^遺傳學(xué)的重要作用機(jī)制之一，組蛋白乙酰化和去乙?；揎椩谀I臟的發(fā)育和腎臟疾病的發(fā)生過(guò)程中也起著多重作用[8-10]。本研究檢測(cè)了IgAN 患者及健康對(duì)照者PBMC 中組蛋白乙酰化水平變化，以及組蛋白乙?；揎椕竚RNA 表達(dá)變化。研究發(fā)現(xiàn)IgAN 患者組蛋白H3 和H4 乙?；捷^健康對(duì)照組均顯著升高，提示組蛋白乙?；瘏⑴c了IgAN 的發(fā)病過(guò)程。組蛋白乙酰化和去乙?；芙M蛋白乙酰化相關(guān)酶HAT和HDAC 調(diào)控。HAT 的主要作用是“打開(kāi)”染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。HDAC 是一類通過(guò)去除組蛋白（和非組蛋白的蛋白）賴氨酸ε-氨基上的乙?；鶊F(tuán)，引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)凝聚從而抑制基因表達(dá)的蛋白[11-12]。染色質(zhì)通過(guò)其相對(duì)“打開(kāi)”和“關(guān)閉”的形式調(diào)控著基因的表達(dá)[13]。

本研究應(yīng)用real-time PCR 法檢測(cè)了2 組研究對(duì)象PBMC 中HAT 和HDAC 的mRNA 表達(dá)水平。結(jié)果顯示IgAN 組HAT 均出現(xiàn)了顯著上調(diào)，組蛋白去乙?；窰DAC1 和HDAC8 mRNA 的表達(dá)顯著上調(diào)，HDAC2 mRNA 的表達(dá)顯著下調(diào)。由此可見(jiàn)，IgAN 患者PBMC 中 H3 和H4 乙?；缴呤荋AT 和HDAC 共同調(diào)控的結(jié)果。為了明確IgAN 腎組織乙?；揎椙闆r，我們應(yīng)用組織免疫熒光技術(shù)檢測(cè)了腎小球中HDAC1 和H3Ac 的蛋白表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)正常腎組織中腎小球中HDAC1 表達(dá)很少，而H3Ac 蛋白表達(dá)較多。與正常腎組織相比，IgAN患者的腎小球中HDAC1 明顯上調(diào)，而H3Ac 蛋白顯著減少，呈低乙?；癄顟B(tài)。由此可見(jiàn)，組蛋白乙?；揎梾⑴c了IgAN 的發(fā)病過(guò)程。我們?cè)谇捌谘芯恐袘?yīng)用IgA 腎病患者來(lái)源的聚合IgA1（P-aIgA1）干預(yù)人系膜細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)P-aIgA1 能夠顯著促進(jìn)系膜細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)，上調(diào)纖溶酶原激活物抑制劑（PAI-1）的表達(dá)，而且系膜細(xì)胞中HDAC1、HDAC2、HDAC8 均顯著升高；應(yīng)用HDAC 抑制劑丙戊酸鈉干預(yù)后可以顯著下調(diào)HDAC1 的表達(dá)，上調(diào)H3Ac 的表達(dá)，提高系膜細(xì)胞乙?；?，顯著減輕了細(xì)胞外基質(zhì)的合成[14]。上述研究進(jìn)一步表明組蛋白乙?；粌H參與了IgA 腎病的發(fā)病過(guò)程，而且可以被逆轉(zhuǎn)。

IgA1 糖基化異常是IgAN 發(fā)病過(guò)程中重要環(huán)節(jié)[3]。本研究結(jié)果顯示IgAN 組C1GALT1 mRNA 的表達(dá)顯著減少，ST6GALNAC2 的mRNA 表達(dá)顯著增多，與Suzuki 等[1]研究結(jié)果一致，但導(dǎo)致這2 個(gè)糖基化酶基因表達(dá)異常的機(jī)制尚未清晰。為了進(jìn)一步明確C1GALT1 和ST6GALNAC2的mRNA 表達(dá)水平發(fā)生變化的機(jī)制，我們應(yīng)用ChIP 的方法檢測(cè)了上述2 個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)的H3 和H4 乙?；健＝Y(jié)果顯示IgAN 組C1GALT1 基因啟動(dòng)子區(qū)H3 和H4乙?；^健康對(duì)照組均顯著下降；ST6GALNAC2 基因啟動(dòng)子區(qū)的H3 和H4 乙?；捷^健康對(duì)照組均顯著升高。C1GALT1 基因啟動(dòng)子區(qū)的H3 和H4 乙?；较陆岛髮?dǎo)致染色質(zhì)呈相對(duì)“關(guān)閉”狀態(tài)，從而抑制了C1GALT1 基因的表達(dá)。ST6GALNAC2 基因啟動(dòng)子區(qū)的H3 和H4 乙酰化水平較正常人升高，導(dǎo)致染色質(zhì)呈相對(duì)“開(kāi)放”狀態(tài)，從而促進(jìn)了ST6GALNAC2 基因的表達(dá)，2 個(gè)基因的異常導(dǎo)致了IgA1 的糖基化異常。

綜上所述，我們觀察IgAN 患者PBMC 和腎組織中組蛋白乙酰化修飾水平，發(fā)現(xiàn)IgAN 都存在乙?；揎棶惓！１狙芯窟€發(fā)現(xiàn)組蛋白乙?；瘏⑴c調(diào)控糖基化酶的基因表達(dá)，并從表觀遺傳學(xué)角度對(duì)IgAN 發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了探討。組蛋白乙酰化的可逆性提示其在疾病的干預(yù)治療方面有重要前景，為IgAN 的治療提供了新的思路。

參·考·文·獻(xiàn)

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