基于蛋白芯片技術(shù)的多囊卵巢綜合征患者卵泡液差異蛋白的研究

蔣毅弘，廖 宇，岳 江，黃 融，劉 偉

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，上海200127

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一種復(fù)雜的內(nèi)分泌代謝性疾病，在育齡期女性中的患病率為4%～10%[1]。PCOS 的主要臨床表現(xiàn)為稀發(fā)排卵或不排卵、高雄激素血癥和卵巢多囊樣變[2-3]。PCOS 女性患者除了生育能力降低，還通常合并肥胖、胰島素抵抗、糖脂代謝異常和心血管疾病[3-4]。

卵泡液由顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞和卵母細(xì)胞的分泌物以及血漿蛋白通過卵泡膜毛細(xì)血管基膜擴(kuò)散組成，主要成分為蛋白質(zhì)、類固醇激素、多糖和代謝物等[5]。卵泡液為卵母細(xì)胞的發(fā)育提供了微環(huán)境，并對(duì)卵泡發(fā)育過程中卵子和卵泡細(xì)胞的通訊起到媒介作用。卵泡液蛋白質(zhì)成分的改變可以反映出病理狀態(tài)下卵泡細(xì)胞分泌過程和血漿組分的變化[6]。

近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)的興起對(duì)PCOS 的發(fā)病機(jī)制、生物標(biāo)志物、藥物治療靶點(diǎn)和預(yù)防遠(yuǎn)期并發(fā)癥提供了新的見解。與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)如雙向凝膠電泳和質(zhì)譜分析相比，蛋白抗體芯片技術(shù)具有高通量、快捷、高靈敏度等特點(diǎn)[7-8]。目前，關(guān)于PCOS 患者卵泡液的蛋白質(zhì)組學(xué)研究甚少。本研究采用AAH-BLG-507 蛋白芯片，對(duì)PCOS 患者和非PCOS 患者卵泡液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，篩選差異表達(dá)蛋白，并對(duì)差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期為PCOS 的診斷以及發(fā)病機(jī)制和遠(yuǎn)期并發(fā)癥的研究提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

PCOS 組納入于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院生殖中心就診的擬行體外受精/卵胞質(zhì)內(nèi)單精子顯微注射-胚胎移植助孕的6 例正常體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）PCOS 患者，平均年齡（30.67±3.67）歲，BMI（23.12±2.77）kg/m2，胰島素抵抗指數(shù)（HOMAIR）為1.84±0.38；以6 例年齡、BMI 匹配的非PCOS 女性患者為對(duì)照組，平均年齡（30.00±2.83）歲，BMI（21.84±2.15）kg/m2，HOMA-IR 為1.27±0.37。

PCOS 組患者診斷采用2003 年鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)（以下3項(xiàng)中滿足2 項(xiàng)及以上即診斷為PCOS）[2]：①月經(jīng)稀發(fā)或無排卵。②有高雄激素的臨床表現(xiàn)和/或高雄激素血癥。③B 超檢查見一側(cè)或雙側(cè)卵巢直徑2 ～9 mm 的卵泡≥12個(gè)和/或一側(cè)卵巢體積≥10 cm3。同時(shí)，排除先天性腎上腺皮質(zhì)增生、分泌雄激素的腫瘤、庫欣綜合征、甲狀腺功能異常、高泌乳素血癥、2 型糖尿病等其他疾病。

對(duì)照組納入年齡、BMI 匹配的女性患者，因輸卵管原因或男方原因?qū)е虏辉校懦渌麅?nèi)分泌疾?。谞钕俟δ墚惓！⒏呙谌樗匮Y等），且近6 個(gè)月內(nèi)未使用免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞毒性、細(xì)胞因子及激素類藥物。

本研究得到醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 蛋白芯片和儀器

Raybiotech 試劑盒（RayBio Biotin Label-based Human Array 1，AAH-BLG-507 芯片；Raybiotech 公司，美國），由上海華盈生物醫(yī)藥科技有限公司協(xié)助完成操作；芯片掃描儀（GenePix 4000B，Axon 公司，美國）；GenePix Pro 6.0 軟件（Axon 公司，美國）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 卵泡液收集 采用標(biāo)準(zhǔn)促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）拮抗劑促排卵方案：月經(jīng)周期第3 天起予以重組人促卵泡素，當(dāng)至少有1 個(gè)卵泡的直徑≥12 mm 時(shí)予以皮下注射GnRH 拮抗劑250 μg/d 直至卵泡發(fā)育成熟。當(dāng)至少有1 個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑≥18 mm時(shí)予以肌內(nèi)注射人絨毛膜促性腺激素4 000 ～8 000 IU，36 h 后經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下穿刺取卵。收集未被血液污染的優(yōu)勢(shì)卵泡液，室溫400×g 離心5 min，收集上清液并于-80 ℃冰箱凍存。

1.3.2 蛋白芯片檢測(cè)方法 所有實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照Raybiotech 試劑盒說明書的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行。每例卵泡液樣本取20 μL，5 倍稀釋（20 μL 卵泡液+80 μL 濃度磷酸緩沖液，總體積100 μL）后加入透析管中，置于500 mL 濃度磷酸緩沖液 （磷酸緩沖液，pH 值8.0）的透析液中4 ℃過夜透析。透析后，每個(gè)樣本取35 μL，加入標(biāo)記緩沖液至終體積190 μL，再加入22 g/L 使用濃度磷酸緩沖液（pH 值8.0）稀釋的標(biāo)記試劑進(jìn)行生物素標(biāo)記。室溫震蕩30 min，在上述反應(yīng)液中加入3 μL 終止液，進(jìn)行第二次透析。蛋白芯片的每塊板（Block）加入800 μL 濃度封閉緩沖液，室溫封閉30 min。移除封閉緩沖液，每塊板加入400 μL 生物素標(biāo)記過的卵泡液樣本（用封閉液20 倍稀釋后）。移除樣品，先后加入濃度洗液I 和濃度洗液Ⅱ洗滌。再加入熒光標(biāo)記鏈霉親和素，室溫孵育2 h。移除熒光標(biāo)記鏈霉親和素，再次洗滌。最后將蛋白芯片放入GenePix 4000B 芯片掃描儀進(jìn)行掃描，使用GenePix Pro 6.0 軟件讀取數(shù)據(jù)。

1.3.3 蛋白芯片數(shù)據(jù)處理和差異表達(dá)蛋白的篩選 12 例樣本經(jīng)GenePix Pro 6.0 軟件解讀，獲得的熒光信號(hào)值包括熒光信號(hào)和背景等。去除背景的熒光信號(hào)后獲得507 個(gè)細(xì)胞因子的熒光信號(hào)值，數(shù)據(jù)經(jīng)過歸一化處理后進(jìn)行分析。以PCOS 組熒光信號(hào)均值/對(duì)照組均值計(jì)算差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C），以1.5 倍調(diào)變?yōu)殚撝担‵C>1.5 或FC<0.67）篩選差異表達(dá)蛋白。

1.3.4 差異蛋白的生物信息學(xué)分析 使用人類蛋白質(zhì)參考數(shù)據(jù)庫（Human Protein Reference Database，HPRD；http://www.hprd.org/）對(duì)差異蛋白的亞細(xì)胞定位、分子功能和生物過程進(jìn)行注釋[9]。運(yùn)用DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov）和KEGG 數(shù)據(jù)庫（http://www.kegg.jp）進(jìn)行KEGG 通路分析[10-11]。使用STRING 數(shù)據(jù)庫（http://string-db.org/）進(jìn)行差異蛋白的蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析[12]，并利用Cytoscape 軟件（https://cytoscape.org/）進(jìn)行可視化。進(jìn)一步使用cytoHubba 插件根據(jù)每個(gè)蛋白節(jié)點(diǎn)的度（degree）值排序，蛋白的度值越高表明該蛋白與越多的其他蛋白存在互作；將度值最高的前10 個(gè)蛋白視為PPI 網(wǎng)絡(luò)中重要的蛋白，即核心蛋白。

2 結(jié)果

2.1 蛋白芯片檢測(cè)和差異表達(dá)蛋白譜的建立

2 組卵泡液樣本采用AAH-BLG-507 蛋白芯片檢測(cè)獲得熒光信號(hào)結(jié)果。去除背景后的熒光信號(hào)值經(jīng)歸一化處理后計(jì)算FC 值。以1.5 倍調(diào)變?yōu)殚撝担‵C>1.5 或FC<0.67），篩選獲得對(duì)照組和PCOS 組卵泡液差異表達(dá)蛋白74 個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)25 個(gè)，表達(dá)下調(diào)49 個(gè)（表1）。表達(dá)上調(diào)最顯著的蛋白為CC 趨化因子配體24（C-C motif chemokine ligand 24，CCL24）、CXC 趨化因子受體3（C-X-C chemokine receptor 3，CXCR3）和CC 趨化因子配體28（CCL28），三者均屬于趨化因子/受體家族，在機(jī)體的免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。表達(dá)下調(diào)最顯著的蛋白為白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）和Wnt 信號(hào)通路抑制因子（Dickkopf-1，DKK1），兩者參與細(xì)胞增殖、組織修復(fù)和胚胎發(fā)育等生理過程。

表1 PCOS 患者卵泡液的差異表達(dá)蛋白Tab 1 Differential expressed proteins identified from follicular fluid of women with PCOS

2.2 差異蛋白的功能注釋分析

圖1 卵泡液中差異蛋白的分類Fig 1 Categorization of differential proteins in follicular fluid

將篩選出的74 個(gè)差異表達(dá)蛋白根據(jù)HPRD 網(wǎng)站進(jìn)行功能注釋。根據(jù)亞細(xì)胞定位，大多數(shù)蛋白（52%）位于胞外區(qū)，其次為質(zhì)膜區(qū)（35%），見圖1A。根據(jù)分子功能，19%和14%的蛋白分別與細(xì)胞因子活性和趨化因子活性相關(guān)，其余主要的蛋白功能為受體活性（11%）、生長(zhǎng)因子活性（10%）和G 蛋白偶聯(lián)受體活性（7%），見圖1B。根據(jù)參與的生物學(xué)過程，大多數(shù)蛋白（57%）參與細(xì)胞通訊和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其次為免疫應(yīng)答（20%）和蛋白質(zhì)代謝（12%），見圖1C。

2.3 差異蛋白的KEGG 分析

對(duì)74 個(gè)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行KEGG 通路分析，結(jié)果顯示，富集到的蛋白數(shù)最多的3 條通路為細(xì)胞因子間受體相互作用通路（P=5.48×10-37）、趨化因子信號(hào)通路（P=1.27×10-12）和JAK-STAT 信號(hào)通路（P=2.79×10-7）。圖2 展示了分別富集到36 個(gè)蛋白（48.65%）和17 個(gè)蛋白（22.97%）的細(xì)胞因子間受體相互作用通路和趨化因子信號(hào)通路。

圖2 差異蛋白富集所得的KEGG 通路Fig 2 KEGG pathway enriched by differential proteins

2.4 差異蛋白的PPI 網(wǎng)絡(luò)分析

運(yùn)用STRING 軟件進(jìn)行差異蛋白的PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，并將結(jié)果在Cytoscape 軟件中進(jìn)行可視化（圖3）。使用cytoHubba 插件對(duì)蛋白節(jié)點(diǎn)的度值進(jìn)行排序，度值前10 的核心蛋白從高到低分別為CCR7、CXCR3、CCR1、CXCR2、CXCR1、IL10、KNG1、IL4、CXCL11、CX3CL1（圖4），其中CCR7、CCR1、CXCR2、CXCR1、IL10、KNG1、IL4、CXCL11 在PCOS 患者卵泡液中表達(dá)下調(diào)，CXCR3 和CX3CL1 表達(dá)上調(diào)（圖3）。

圖3 差異蛋白的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 PPI network of differential proteins

圖4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的核心蛋白Fig 4 Hub proteins of PPI network

3 討論

PCOS 是一種復(fù)雜的臨床異質(zhì)性疾病，PCOS 女性罹患2 型糖尿病和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)更高。越來越多的研究表明慢性低度炎癥不僅與PCOS 發(fā)病機(jī)制相關(guān)，還與胰島素抵抗、遠(yuǎn)期代謝性疾病及心血管并發(fā)癥相關(guān)[13]。近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的興起為疾病的基礎(chǔ)研究提供了高效的技術(shù)平臺(tái)。與傳統(tǒng)的靶向技術(shù)相比，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)更適合PCOS 這種異質(zhì)性疾病，因其能得到更加完整和全面的代謝及代謝譜改變信息[14]。

既往關(guān)于PCOS 患者卵泡液的蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要采用質(zhì)譜分析、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜等技術(shù)，鮮有使用蛋白芯片技術(shù)篩選PCOS 患者卵泡液中的差異表達(dá)蛋白。研究表明，PCOS患者卵泡液中的差異蛋白及其涉及的通路與胰島素功能調(diào)節(jié)、脂代謝、炎癥反應(yīng)和卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)[15-17]。Ambekar 等[15]選取的PCOS 患者平均BMI 水平處于超重范圍；尚無關(guān)于非超重/肥胖的PCOS 患者卵泡液差異蛋白的研究。故本研究選取正常BMI 水平的PCOS 患者為研究對(duì)象，采用AAH-BLG-507 蛋白芯片技術(shù)，觀察其與BMI 匹配的非PCOS 患者卵泡液中細(xì)胞因子的表達(dá)變化。

通過比較6 例PCOS 患者和6 例非PCOS 患者卵泡液中507 種細(xì)胞因子的表達(dá)水平，篩選出74 個(gè)差異蛋白，其中表達(dá)上調(diào)25 個(gè)，表達(dá)下調(diào)49 個(gè)。功能注釋分析結(jié)果顯示，差異蛋白主要的分子功能為細(xì)胞因子活性和趨化因子，參與的生物學(xué)過程為細(xì)胞通訊、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫應(yīng)答。KEGG 通路分析指出，富集到的通路主要涉及細(xì)胞因子間受體相互作用和趨化因子信號(hào)通路。進(jìn)一步的PPI 網(wǎng)絡(luò)分析和核心蛋白篩選的結(jié)果顯示，核心蛋白的類型主要為趨化因子及其受體。

趨化因子是一類具有細(xì)胞因子活性的小蛋白家族，能將免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞募集到感染或組織損傷部位，并在免疫應(yīng)答的不同階段調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的激活狀態(tài)。既往研究顯示，部分趨化因子家族成員與PCOS 相關(guān)：非超重PCOS女性血清中單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1/CCL2）水平較正常女性升高[18]；PCOS患者血清趨化因子CX3C 配體1（chemokine CX3C motif ligand 1，CX3CL1）水平升高，升高的CX3CL1 水平與胰島素抵抗、慢性炎癥和雄激素水平相關(guān)[19]；此外，PCOS患者血清 趨化因子CXC 配體11（CXCL11）、趨化因子CXC 配體4（CXCL4）、單核細(xì)胞趨化蛋白-4（MCP-4/CCL13）等趨化因子水平還與性激素水平存在相關(guān)性[20]。

PCOS 女性不僅生育能力受損，發(fā)生肥胖、胰島素抵抗、2 型糖尿病、脂代謝紊亂和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)也進(jìn)一步增加[1,3-4]。胰島素抵抗是PCOS 的核心發(fā)病機(jī)制之一。與BMI 匹配的對(duì)照組相比，肥胖和非肥胖PCOS 組患者的胰島素抵抗都更為嚴(yán)重[21-22]。目前，已有越來越多的證據(jù)顯示趨化因子及其受體與肥胖、胰島素抵抗和慢性炎癥相關(guān)。CC 趨化因子受體7（C-C chemokine receptor type 7，CCR7）主要在免疫細(xì)胞上表達(dá)，CCR7 及其配體通過在T 細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞間的相互作用是天然免疫和獲得性免疫間的橋梁[23]。研究[24]顯示，CCR7-/-小鼠的糖耐量和胰島素敏感性顯著降低，肝臟脂肪變性更嚴(yán)重。CC 趨化因子受體1（CCR1）在人單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T 細(xì)胞上表達(dá)，CCR1 通過防止過多的T 細(xì)胞和單核細(xì)胞流入動(dòng)脈粥樣硬化的血管壁，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[25]。CXC 趨化因子受體1（CXCR1）和CXC 趨化因子受體2（CXCR2）是白介素8 的受體，使用兩者的阻斷劑能改善db/db 小鼠的糖耐量、胰島素抵抗和肝臟脂肪沉積，且CXCR2-/-小鼠能夠免受肥胖誘導(dǎo)所致的胰島素抵抗[26-27]。CXCL11 水平在肥胖患者中顯著升高，通過抑制內(nèi)臟脂肪的血管生成在肥胖患者中促進(jìn)了脂肪沉積[28]。CXCR3通路在內(nèi)臟脂肪組織的炎癥反應(yīng)中起著重要作用。與高脂喂養(yǎng)（high fat diet，HFD）的野生型小鼠相比，HFDCXCR3-/-小鼠的空腹血糖水平更低，糖耐量更高，單核細(xì)胞內(nèi)臟脂肪浸潤(rùn)和巨噬細(xì)胞炎癥程度較輕[29]。CX3CL1是CX3C 趨化因子家族中的唯一成員，能調(diào)節(jié)單核細(xì)胞對(duì)脂肪細(xì)胞的黏附，與肥胖、胰島素抵抗和2 型糖尿病相關(guān)[30]?？梢?，上述趨化因子/受體在糖脂代謝、炎癥和胰島素抵抗中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。卵泡液中CCR7、CCR1、CXCR3 和CX3CL1 的表達(dá)變化也可能參與PCOS患者卵巢局部的代謝和慢性炎癥的調(diào)節(jié)。肥胖小鼠或人體中CXCR1、CXCR2 和CXCL11 的表達(dá)變化趨勢(shì)與PCOS患者卵泡液中相反，可能與卵泡液和血清樣本的不同有關(guān)（卵泡液主要反映卵巢局部細(xì)胞因子合成和分泌的變化），也可能與本研究納入的是非肥胖患者有關(guān)。PCOS 患者卵泡液中趨化因子/受體及其相關(guān)信號(hào)通路表達(dá)的變化可能導(dǎo)致卵泡液局部的慢性低度炎癥和胰島素抵抗，促進(jìn)卵泡膜細(xì)胞分泌更多的雄激素和影響顆粒細(xì)胞功能，最終導(dǎo)致卵泡發(fā)育異常。

除趨化因子家族外，本研究發(fā)現(xiàn)2 種抗炎細(xì)胞因子白介素10（interleukin，IL-10）和白介素4（IL-4）在PCOS女性的卵泡液中表達(dá)下調(diào)。IL-10 通過Th1 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞下調(diào)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。既往研究也顯示，PCOS 女性卵泡液中的IL-10 水平較正常女性降低，促炎和抗炎細(xì)胞因子的不平衡會(huì)導(dǎo)致類固醇激素生成改變，卵泡成熟延遲和卵巢功能障礙[31]。IL-4 參與調(diào)控糖脂代謝，IL-4 在改善胰島素敏感性和糖耐量的同時(shí)能抑制脂質(zhì)的堆積[28]。

綜上，運(yùn)用蛋白芯片技術(shù)能夠建立PCOS 卵泡液差異表達(dá)蛋白譜，篩選所得的差異蛋白涉及細(xì)胞因子間受體相互作用和趨化因子信號(hào)通路，可能與卵泡液局部的胰島素抵抗和慢性低度炎癥相關(guān)，進(jìn)而影響卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)PCOS 的早期診斷、發(fā)病機(jī)制和并發(fā)癥的研究具有一定的提示作用。本研究是一個(gè)小樣本量的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，篩選所得的差異表達(dá)蛋白有待于進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量并定量測(cè)定來驗(yàn)證，在更深入地理解PCOS 的發(fā)病機(jī)制、預(yù)防心血管代謝并發(fā)癥，以及尋找新的診療方面具有潛在的應(yīng)用 價(jià)值。

參·考·文·獻(xiàn)

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