• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    卵胎生許氏平鲉Sox9基因的克隆、啟動(dòng)子分析、表達(dá)及其細(xì)胞定位研究

    2020-10-13 07:13:14馬麗曼張全啟齊潔盧夢(mèng)萱王文基
    關(guān)鍵詞:許氏精巢性腺

    馬麗曼,張全啟,齊潔,盧夢(mèng)萱,王文基

    (1.臺(tái)州學(xué)院 醫(yī)學(xué)院,浙江 臺(tái)州 318000; 2.中國(guó)海洋大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 青島 266003; 3.臺(tái)州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,浙江 臺(tái)州 318000)

    Sox(Sry-related high mobility group box)基因家族是能夠編碼哺乳動(dòng)物雄性決定基因Sry樣HMG box(兩者具有60% 以上氨基酸序列相似性)的一系列基因[1],之后這些基因在非哺乳動(dòng)物中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。研究表明,Sox基因在性腺分化和早期胚胎發(fā)育中具有重要作用,目前,Sox9基因已被許多學(xué)者作為研究脊椎動(dòng)物性別決定與性腺發(fā)育過(guò)程的關(guān)鍵基因。在哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類中,Sox9基因在性腺分化中的兩性差異表達(dá)模式表明了Sox9基因在其性別決定和性腺發(fā)育過(guò)程中的重要功能。與哺乳動(dòng)物不同,魚(yú)類的性別決定機(jī)制比較復(fù)雜,如在黃鱔Monopterusalbus[2]、斑馬魚(yú)Daniorerio[3]、青鳉Oryziaslatipes[4-5]、鯉Cyprinuscarpio[6]和黃顙魚(yú)Pelteobagrusfulvidraco[7]等一些硬骨魚(yú)類中發(fā)現(xiàn)有兩種Sox9基因,且它們?cè)谛韵僦械谋磉_(dá)模式有所不同。而在斜帶石斑魚(yú)Epinepheluscoioides[8]、尼羅羅非魚(yú)Oreochromisniloticus[9]、牙鲆Paralichthysolivaceus[10]、金錢(qián)魚(yú)Scatophagusargus[11]和圓斑星蝶Veraspervariegatus[12]中僅發(fā)現(xiàn)了一種Sox9基因,且其兩性差異表達(dá)模式均為精巢強(qiáng)于卵巢。這些研究結(jié)果表明,Sox9基因在魚(yú)類性別決定和性腺發(fā)育中可能發(fā)揮著重要的作用。

    許氏平鲉Sebastesschlegeli是中國(guó)北方重要的養(yǎng)殖魚(yú)類,具有個(gè)體大、生長(zhǎng)速度快、抗病力強(qiáng)、卵胎生、味質(zhì)鮮美等優(yōu)點(diǎn)。目前,許氏平鲉苗種主要來(lái)源于海捕野生苗,人工苗種供給率低,且長(zhǎng)期過(guò)度捕撈對(duì)其資源和遺傳多樣性也會(huì)造成一定程度的破壞。因此,大量人工繁育速生、抗病能力強(qiáng)的許氏平鲉苗種已成為保護(hù)許氏平鲉資源及養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必要手段[13]。目前,國(guó)內(nèi)外關(guān)于許氏平鲉的研究主要集中在人工育苗、胚胎發(fā)育及早期形態(tài)發(fā)育等方面[14-17]。而對(duì)于許氏平鲉性腺發(fā)育及性別決定等分子機(jī)制研究甚少。許氏平鲉是卵胎生魚(yú)類,其繁殖習(xí)性與卵生魚(yú)類有所差異,因此,對(duì)許氏平鲉Sox9性別相關(guān)基因的研究,將有利于豐富魚(yú)類性別決定及性腺發(fā)育的生物學(xué)知識(shí),也有利于許氏平鲉繁殖和育種工作的開(kāi)展。本研究中,通過(guò)同源克隆、RACE技術(shù)、實(shí)時(shí)定量 PCR、啟動(dòng)子序列生物信息學(xué)分析及其細(xì)胞定位等技術(shù)對(duì)許氏平鲉Sox9基因進(jìn)行了分析,旨在為魚(yú)類性別分化和分子調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    試驗(yàn)用成體許氏平鲉雌、雄魚(yú)各3尾,體長(zhǎng)為(27±2) cm,體質(zhì)量為(758±15)g,購(gòu)自山東省青島市南山水產(chǎn)市場(chǎng)。不同發(fā)育時(shí)期的仔魚(yú)各5尾,取自煙臺(tái)泰華海珍品有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 組織樣品的制備 成體許氏平鲉取樣當(dāng)天麻醉后立即解剖,取每尾魚(yú)(雌雄魚(yú)各3尾)的肌肉、 肝、全腦、 腎、 鰓、 脾、 腸、 心、 精巢、 卵巢組織,用于成體各組織定量表達(dá)分析。 Omoto 等[18]研究表明,許氏平鲉仔魚(yú)在25日齡時(shí)性腺開(kāi)始分化。本試驗(yàn)中根據(jù)性腺分化的關(guān)鍵時(shí)期(25 日齡) 選取出生后1、 5、 10、 15、 25、 35日齡的仔魚(yú)各5尾,取每尾魚(yú)的軀干部用于仔魚(yú)發(fā)育時(shí)期定量表達(dá)分析。各樣品用液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    用于Sox9基因細(xì)胞定位的材料取自上述成體許氏平鲉的精巢和卵巢,并將其放在1×PBS中漂洗3次,切成1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm的組織塊,放于4% PFA-1×PBS中4 ℃下固定過(guò)夜,固定后保存在100%甲醇中備用。

    1.2.2 總RNA和基因組DNA的提取 用Trizol法提取不同發(fā)育時(shí)期仔魚(yú)和成體各組織的總RNA,操作方法根據(jù)Trizol Reagent 使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取的總RNA樣品經(jīng)DNaseI(TaKaRa)處理后,利用跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)的β-actin引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,檢測(cè) DNA 是否去除干凈。用苯酚-氯仿法從肌肉組織中提取基因組DNA,并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)測(cè)定總RNA和基因組DNA的質(zhì)量和數(shù)量。隨后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒M-MLV(TaKaRa)對(duì)許氏平鲉成體組織和仔魚(yú)發(fā)育時(shí)期樣品的總 RNA進(jìn)行cDNA合成。

    1.2.3 許氏平鲉Sox9基因克隆 運(yùn)用同源克隆方法,根據(jù)已發(fā)表的魚(yú)類Sox9基因保守區(qū)序列,設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物Sox9-CP-FW/RV(表1),并以許氏平鲉精巢和卵巢組織的混合cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃下預(yù)變性5 min;95 ℃下變性30 s,65 ℃下退火30 s,72 ℃下延伸30 s,以后每個(gè)循環(huán)退火溫度降低1 ℃,共進(jìn)行10個(gè)循環(huán)(退火溫度從65 ℃降到55 ℃);隨后95 ℃下變性30 s,55 ℃下退火30 s,72 ℃下延伸30 s,共進(jìn)行25個(gè)循環(huán);最后再在72 ℃下延伸10 min。

    表1 試驗(yàn)所用引物Tab.1 Primers used in this study

    根據(jù)所獲得的核心cDNA片段序列,各設(shè)計(jì)一條特異引物和一條巢式引物用于5′RACE和3′RACE(表1)。用BD SMARTTMRACE cDNA Amplification kit (Clonetech) 進(jìn)行RACE反應(yīng),具體步驟可參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。根據(jù)許氏平鲉Sox9 基因全長(zhǎng)cDNA序列,設(shè)計(jì)跨越5′UTR和3′UTR的一對(duì)特異引物Sox9-gn-FW/RV用于內(nèi)含子序列擴(kuò)增(表1)。以許氏平鲉肌肉組織DNA為模板, 運(yùn)用LA Taq酶(TaKaRa)進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件同“1.2.3”節(jié),只是中間兩次延伸溫度由72 ℃變?yōu)?8 ℃,其他條件和程序不變。

    利用已克隆得到的許氏平鲉Sox9基因全長(zhǎng),在靠近基因的5′側(cè)翼區(qū)設(shè)計(jì)3個(gè)反向嵌套特異引物SP1、SP2、SP3 用于Sox9基因啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增。并運(yùn)用染色體步移試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行3次巢式PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件具體參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。以上反應(yīng)所得的PCR產(chǎn)物,均用15 g/L 的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè),并根據(jù)目的條帶大小,用DNA凝膠回收試劑盒(Zymo Research, Irvine CA, USA) 對(duì)目的DNA進(jìn)行回收純化。將回收產(chǎn)物連接到pMD18-T (TaKaRa)載體上,并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Trans5α (TransGenBiotech) 感受態(tài)細(xì)胞中,采用載體特異引物M13-47/48進(jìn)行菌落PCR陽(yáng)性檢測(cè), 挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序。

    1.2.4 許氏平鲉Sox9 cDNA序列及啟動(dòng)子序列分析 利用NCBI Blast工具(http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast),將得到的核心片段與GenBank中已有的核酸序列進(jìn)行相似性分析,進(jìn)一步確定所得的Sox9基因。運(yùn)用DNASTAR Lasergene及DNAMAN 7.0軟件分析Sox9基因cDNA序列,預(yù)測(cè)ORF。通過(guò)比對(duì)Sox9 DNA與cDNA序列,并結(jié)合其他硬骨魚(yú)類內(nèi)含子情況,確定許氏平鲉Sox9基因的內(nèi)含子位置及數(shù)目。同時(shí)采用ClustalX 1.81軟件比對(duì)不同物種間Sox9蛋白的氨基酸序列。運(yùn)用MEGA 5.0 軟件,采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

    運(yùn)用生物信息學(xué)軟件NNPP(Neural Network Promoter Prediction, http://www. fruitfly.org/seq_ tools/promoter.html)對(duì)所獲得的Sox9基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析,確定基因的轉(zhuǎn)錄起始結(jié)合位點(diǎn)(TSS)。并利用TFSEARCH (http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH. html)、Alibaba 2.1 program(http://www.generegulation.com/pub/programs/alibaba2/index. html)、Match Program(http://www. gene-regulation.com/pub/programs.html#match)、TESS(http://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess)等軟件對(duì)該基因的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

    1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR) 取許氏平鲉成體各組織和仔魚(yú)發(fā)育時(shí)期樣品各1 μg RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,取1 μL cDNA (10 ng/μL)產(chǎn)物進(jìn)行qPCR反應(yīng)。根據(jù)全長(zhǎng)Sox9 cDNA序列設(shè)計(jì)特異引物Sox9-RT-FW/RV(表1),并選用本實(shí)驗(yàn)室篩選出的比較穩(wěn)定的Rpl17為內(nèi)參基因[19]。qPCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系(20 μL)包括:cDNA模板(10 ng) 1 μL, 2×SYBR?Premix Ex TaqTM II (TaKaRa) 10 μL,正、反向引物(10 μmol/L)各0.4 μL, ROX Reference Dye II 0.4 μL,無(wú)菌水7.8 μL。qPCR反應(yīng)程序(兩步法)為:95 ℃下預(yù)變性30 s;95 ℃下變性15 s,60 ℃下退火/延伸45 s,共進(jìn)行40個(gè)循環(huán),并運(yùn)行熔解曲線確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。每一試驗(yàn)樣品重復(fù)擴(kuò)增3次?;蛳鄬?duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCT方法計(jì)算[21]。

    1.2.6 許氏平鲉Sox9基因在性腺組織中的細(xì)胞定位分析 采用原位雜交方法檢測(cè)許氏平鲉Sox9基因在成體性腺組織中的細(xì)胞定位情況。避開(kāi)Sox9基因保守區(qū),設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物Sox9-SP6-FW/Sox9-T7-RV(表1),并以含有目的基因的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,并使用凝膠回收試劑盒ZymocleanTM回收目的片段作為合成探針用的模板。探針的體外轉(zhuǎn)錄采用T7/SP6 RNA Polymerase(TaKaRa)試劑盒,詳細(xì)步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。合成的探針用NucAway Spin Columns進(jìn)行純化。經(jīng)10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,置于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

    取保存于甲醇中的性腺組織塊,用無(wú)水乙醇充分脫水,二甲苯梯度透明,并置于55 ℃蠟浴中透蠟。將經(jīng)過(guò)透蠟的組織進(jìn)行蠟塊包埋,用切片機(jī)制成厚度為7 μm的切片。將切片用乙醇梯度復(fù)水,蛋白酶K處理。用1×PBST洗去消化液,用4% PFA-1×PBS固定30 min,再用1×PBST浸洗3次。將切片置于60 ℃雜交爐中預(yù)雜交3 h,然后加入Sox9 RNA探針于60 ℃雜交爐中雜交過(guò)夜。雜交后第2天移走RNA探針雜交液,并用SSCT梯度清洗切片,加入按1∶2000比例稀釋的anti-Dig-AP抗體,4 ℃下孵育12~16 h。雜交后第3天用1×PBST洗去多余抗體,加入NBT-BCIP顯色液避光顯色。每隔10 min 觀測(cè)顯色情況。染色結(jié)束后,用1×PBST洗凈染液,用1%中性紅復(fù)染。使用顯微鏡(Nikon Eclipse Ti-U)觀察并記錄結(jié)果。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)及Duncan多重比較,顯著性水平設(shè)為0.05。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 許氏平鲉Sox9基因序列分析

    利用DNASTAR軟件將同源克隆得到的核心片段與RACE技術(shù)獲得的兩端側(cè)翼序列進(jìn)行全長(zhǎng)cDNA拼接,得到了許氏平鲉Sox9完整的cDNA序列(GenBank:KJ624404)。從圖1可見(jiàn):許氏平鲉Sox9 cDNA全長(zhǎng)2039 bp,包括5′非翻譯區(qū)(5′UTR)336 bp, 3′非翻譯區(qū)(3′UTR)242 bp,開(kāi)放閱讀框(ORF)1461 bp;在3′UTR中含有多聚腺苷酸加尾信號(hào)(aataaa)和PolyA尾。經(jīng)分析,許氏平鲉Sox9基因的ORF可編碼486個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量為53 090。通過(guò)Sox9全長(zhǎng)cDNA序列與其對(duì)應(yīng)基因組DNA序列比對(duì)分析可知,許氏平鲉Sox9基因含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子,內(nèi)含子大小分別為503 bp和265 bp,且內(nèi)含子和外顯子的邊界都符合“GT-AG”原則。

    2.2 氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

    通過(guò)與人類Homosapiens、小鼠Musmusculus、非洲爪蟾Xenopuslaevis及其他硬骨魚(yú)類的Sox9蛋白序列比對(duì),可以看出在許氏平鲉Sox9蛋白第107~178氨基酸位置有一個(gè)高度保守的HMG結(jié)構(gòu)域(圖2)。在該HMG盒內(nèi)存在一個(gè)特征性基序AQAARRKL,兩個(gè)核定位信號(hào)NLS1(KRPMNAFMVWAQAARRK)和NLS2(RRRK),同時(shí)還含有一個(gè)富含亮氨酸的核輸出信號(hào)NES(LSKTLGKLWRLL)。進(jìn)一步分析顯示,許氏平鲉Sox9氨基酸序列與哺乳動(dòng)物Sox9氨基酸序列的相似性較低,其中與人類的一致性為78.0%,與小鼠的一致性為78.2%,與硬骨魚(yú)類斑馬魚(yú)的Sox9b一致性最低,為73.2%,與其他硬骨魚(yú)類的Sox9氨基酸序列則具有較高的相似性,其中與牙鲆和斜帶石斑魚(yú)的一致性最高,分別為 93.9% 和94.1%。

    根據(jù)已發(fā)表的各個(gè)物種的Sox9氨基酸序列構(gòu)建NJ分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),結(jié)果顯示,哺乳類(如人類,小鼠)、鳥(niǎo)類(如雞)和兩棲類(如非洲爪蟾)的Sox9蛋白聚在一起,硬骨魚(yú)類的斑馬魚(yú)Sox9b則分出了較獨(dú)立的一支,而許氏平鲉、三棘刺魚(yú)等其他硬骨魚(yú)類的Sox9蛋白聚為一支(圖3)。

    2.3 Sox9基因啟動(dòng)子序列的生物信息學(xué)分析

    從圖4-A可見(jiàn):用染色體步移法得到了許氏平鲉Sox9基因的啟動(dòng)子序列(GenBank:KJ624401),長(zhǎng)度為2252 bp。運(yùn)用NNPP軟件對(duì)5′UTR序列及染色體步移得到的序列進(jìn)行分析,確定了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)TSS。在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游未檢測(cè)到典型的TATA box及GC box。

    從圖4-B可見(jiàn):利用TFSEARCH、Match Program、Alibaba 2.1和TESS等在線生物學(xué)軟件對(duì)Sox9基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(cè),預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,在得到的Sox9基因啟動(dòng)子中,存在特化蛋白Sp1、轉(zhuǎn)錄激活蛋白AP-1、八聚體結(jié)合蛋白Oct-1、叉頭框蛋白FOXD3、肝核因子HNF3β、雌激素受體ER、環(huán)磷酸腺苷應(yīng)答元件結(jié)合蛋白CREB、 GATA-2、GATA-3、VBP和核因子NF-κB等蛋白結(jié)合位點(diǎn)。此外,在Sox9基因啟動(dòng)子中還預(yù)測(cè)到了性別相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子SRY、Sox5和Sox9結(jié)合位點(diǎn)。

    2.4 Sox9基因在仔魚(yú)發(fā)育時(shí)期及成魚(yú)組織的表達(dá)

    從圖5-A可見(jiàn):許氏平鲉Sox9 mRNA在仔魚(yú)發(fā)育階段(出生后1、5、10、15、25、35日齡)均有不同程度的表達(dá);在出生后5日齡和10日齡時(shí)表達(dá)量有降低的趨勢(shì),15日齡和25日齡時(shí)表達(dá)量逐漸上升,隨后在35日齡時(shí)表達(dá)量又有所下降。

    從圖5-B可見(jiàn):許氏平鲉Sox9基因在成體肝、心、腦、腎、脾、鰓、肌肉、腸、精巢、卵巢等組織中均有不同程度的表達(dá),在腦、鰓和精巢組織中表達(dá)量較高,且顯著高于其他組織(P<0.05),在肌肉、心、腎和脾中表達(dá)量較低;許氏平鲉Sox9基因在成魚(yú)性腺中表現(xiàn)出性別兩相性差異,即在精巢中的表達(dá)水平要顯著高于卵巢(P<0.05)。

    2.5 Sox9基因在成魚(yú)性腺中的細(xì)胞定位分析

    采用組織切片原位雜交技術(shù)觀察許氏平鲉Sox9基因在成魚(yú)性腺細(xì)胞中的定位表達(dá)情況。圖6-A和圖6-D是性腺組織切片的H.E染色,可以看出,此階段性腺發(fā)育各時(shí)期細(xì)胞比較完全,適用于細(xì)胞定位分析。原位雜交結(jié)果顯示:許氏平鲉Sox9基因在精巢的生殖細(xì)胞(精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和精細(xì)胞)和Sertoli細(xì)胞中均有表達(dá)(圖6-C),且在生殖細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)于Sertoli細(xì)胞;在卵巢的卵母細(xì)胞中同樣檢測(cè)到了Sox9基因轉(zhuǎn)錄本,且在早期發(fā)育的卵母細(xì)胞中表達(dá)信號(hào)較強(qiáng),同時(shí)Sox9基因在卵巢濾泡細(xì)胞中有微弱表達(dá)(圖6-F)。

    3 討論

    3.1 Sox9基因的保守性

    本研究中從許氏平鲉性腺中克隆得到了Sox9基因全長(zhǎng)cDNA及基因組DNA序列。Sox9 mRNA全長(zhǎng)2039 bp,編碼486個(gè)氨基酸,在107~178氨基酸位置有一個(gè)保守的 HMG 盒。該HMG 盒與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中大多數(shù)物種Sox9氨基酸序列是一致的,均含有一個(gè)特征性基序AQAARRKL,兩個(gè)獨(dú)立的核定位信號(hào)NLS1和NLS2,以及一段富含亮氨酸的核輸出信號(hào)NES。許氏平鲉Sox9基因DNA序列包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子,這與哺乳類、鳥(niǎo)類、兩棲類及其他硬骨魚(yú)類的Sox9基因結(jié)構(gòu)相似。分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示,許氏平鲉Sox9與其他硬骨魚(yú)類的Sox9蛋白聚在一起,這說(shuō)明Sox9蛋白結(jié)構(gòu)在魚(yú)類中比較保守。

    3.2 許氏平鲉Sox9基因的命名

    Sox9基因在不同的物種中存在不同數(shù)目的亞型,在人類、小鼠和雞等高等脊椎動(dòng)物中僅找到了一種,而在硬骨魚(yú)如斑馬魚(yú)、青鳉等低等脊椎動(dòng)物中則找到了兩種Sox9基因,命名為Sox9a或Sox9b[3-5]。Volff[20]指出,在硬骨魚(yú)類中存在兩種類型的Sox9基因,也許是由魚(yú)類特有的基因組復(fù)制導(dǎo)致的。目前,Sox9基因亞型的命名無(wú)公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn),a或b僅用于區(qū)分同一物種內(nèi)的不同亞型,而無(wú)法用于鑒定真正的直系同源基因,因此,系統(tǒng)發(fā)生分析的結(jié)果往往比較混亂。本研究中對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn),許氏平鲉Sox9與三棘刺魚(yú)、石斑魚(yú)、牙鲆的Sox9和半滑舌鰨Sox9a在一簇上,同一簇上出現(xiàn)不同的分型,使得進(jìn)化樹(shù)看起來(lái)比較混亂。這與尼羅羅非魚(yú)[8]、斜帶石斑魚(yú)[9]、牙鲆[10]、金錢(qián)魚(yú)[11]和圓斑星蝶[12]情況相似,本研究在許氏平鲉中目前只發(fā)現(xiàn)了一種Sox9基因,系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示,與三棘刺魚(yú)Sox9b聚為一支,考慮到在許氏平鲉中有可能存在另外一種亞型,而此亞型的出現(xiàn)可能導(dǎo)致進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建時(shí)聚類發(fā)生改變,所以暫時(shí)命名為Sox9基因。

    3.3 許氏平鲉Sox9基因的啟動(dòng)子分析

    對(duì)啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)和功能的研究是基因調(diào)控機(jī)制的研究熱點(diǎn)之一。目前,魚(yú)類性別決定和分化相關(guān)的基因調(diào)控機(jī)制尚不明確。研究Sox9性別相關(guān)基因的啟動(dòng)子將有助于本試驗(yàn)中更好地理解相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在性腺發(fā)育中的作用機(jī)制。通過(guò)染色體步移法得到許氏平鲉Sox9基因啟動(dòng)子序列,綜合多個(gè)生物信息學(xué)軟件最終確定了多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。其中,與已發(fā)表的許氏平鲉Sox3基因啟動(dòng)子[21]有共同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),如AP-1、GATA-3、Oct-1、FOXD3及性別相關(guān)蛋白SRY、Sox5、Sox9等結(jié)合位點(diǎn)。這些轉(zhuǎn)錄因子有可能共同調(diào)控著Sox3和Sox9基因的表達(dá),從而影響性腺的發(fā)育。在人類中,SRY基因與Sox9、Sox3基因共同作用決定睪丸的形成[22]。 Kanai等[23]發(fā)現(xiàn),哺乳動(dòng)物SRY性別決定基因能夠直接調(diào)控Sox9基因的表達(dá)。比較有趣的是,本試驗(yàn)中不僅在許氏平鲉Sox3啟動(dòng)子中預(yù)測(cè)到了Sox9蛋白結(jié)合位點(diǎn)[21],而且發(fā)現(xiàn)該蛋白結(jié)合位點(diǎn)也存在于許氏平鲉Sox9基因自身啟動(dòng)子中。預(yù)測(cè)結(jié)果提示,Sox9基因在性別調(diào)控機(jī)制中也許作為Sox3基因的上游基因,對(duì)Sox3基因表達(dá)起調(diào)控作用的同時(shí),對(duì)自身也有一定的反饋調(diào)節(jié)作用。

    另外,在許氏平鲉Sox9基因啟動(dòng)子區(qū)還預(yù)測(cè)到了Sp1、CREB、NF-kB、ER等結(jié)合位點(diǎn)。有研究報(bào)道,人類Sox9基因近端啟動(dòng)子受Sp1和CREB結(jié)合蛋白的調(diào)控[24]。核因子NF-kB廣泛存在于各種細(xì)胞,在免疫應(yīng)答、炎癥、細(xì)胞增殖、分化及凋亡等許多生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮作用。Ushita等[25]發(fā)現(xiàn),NF-kB能夠強(qiáng)烈激活Sox9基因啟動(dòng)子。雌激素只有與雌激素受體ER結(jié)合才能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。Cheng等[26]發(fā)現(xiàn),小鼠ERβ能夠調(diào)控雄激素受體和排卵相關(guān)因子的表達(dá)。Lassiter等[27]發(fā)現(xiàn),ER在硬骨魚(yú)早期胚胎發(fā)育和性腺分化中起重要作用。因此,本試驗(yàn)中推測(cè)這些轉(zhuǎn)錄因子也許能夠直接作用于許氏平鲉Sox9基因的啟動(dòng)子,從而影響性腺的發(fā)育。本研究中完成的許氏平鲉Sox9基因的啟動(dòng)子序列的生物信息學(xué)分析結(jié)果,為今后進(jìn)一步研究Sox9基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

    3.4 Sox9基因的表達(dá)

    組織學(xué)觀察顯示,許氏平鲉在出生后大約25日齡(全長(zhǎng)約20 mm)左右性腺開(kāi)始分化[18]。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)顯示,許氏平鲉Sox9基因在仔魚(yú)發(fā)育時(shí)期各階段均有不同程度的表達(dá),在出生后5日齡和10日齡時(shí)表達(dá)量有降低趨勢(shì),15日齡和25日齡(性腺分化關(guān)鍵時(shí)期)時(shí)表達(dá)量逐漸上升。這與圓斑星鰈的表達(dá)模式相似,即圓斑星鰈Sox9基因在仔魚(yú)20~50日齡時(shí)表達(dá)量逐漸下降,在60日齡 (性腺分化時(shí)期) 時(shí)表達(dá)量上升[12]。因此,本試驗(yàn)中推測(cè)許氏平鲉Sox9基因在出生后25日齡(性腺分化時(shí)期)時(shí)的表達(dá)量達(dá)到較高的水平可能與仔魚(yú)性腺分化有關(guān)。

    目前,有關(guān)Sox9基因在各脊椎動(dòng)物中的組織差異表達(dá)模式已有研究報(bào)道。在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn),Sox9基因與雄性性別的決定和性腺發(fā)育相關(guān),有可能是SRY基因最靠近的下游基因[24]。在硬骨魚(yú)中,Sox9不同類型的基因在性腺中的表達(dá)模式有所不同,如斑馬魚(yú)有Sox9a和Sox9b兩個(gè)Sox9基因,Sox9a在腦、精巢等多種組織中表達(dá),在卵巢中不表達(dá),而Sox9b僅在卵巢中表達(dá)[3]。 Zhou等[2]在黃鱔中克隆得到Sox9a1和Sox9a2兩個(gè)Sox9a基因,它們?cè)诰病⒙殉埠烷g性性腺(精卵巢)中均有表達(dá)。在青鳉中先后發(fā)現(xiàn)了Sox9a基因(只在卵巢中表達(dá))和Sox9a2基因(精巢中表達(dá))[4-5]。俞菊華等[7]在黃顙魚(yú)中克隆得到了Sox9a1和Sox9a2兩個(gè)基因,Sox9a1基因在腦、精巢和卵巢中均有表達(dá),Sox9a2基因只在卵巢中表達(dá),Sox9a2可能參與了雌性性別決定和卵巢發(fā)育過(guò)程。另外,在尼羅羅非魚(yú)[9]、斜帶石斑魚(yú)[8]、牙鲆[10]和金錢(qián)魚(yú)[11]中目前僅找到一種Sox9基因,且主要在精巢中顯著表達(dá)。以上研究結(jié)果表明,不同類型Sox9基因在魚(yú)類中并未呈現(xiàn)出統(tǒng)一的性別差異表達(dá)模式。但通過(guò)已報(bào)道的研究可知,斑馬魚(yú)Sox9a、青鳉Sox9a2,以及斜帶石斑魚(yú)、尼羅羅非魚(yú)、牙鲆和金錢(qián)魚(yú)的Sox9基因的表達(dá)模式與哺乳類Sox9基因還是一致的,均在精巢中有較高水平的表達(dá),表明Sox9基因可能參與了精巢的分化和發(fā)育過(guò)程。本研究中在許氏平鲉中克隆得到了一種Sox9基因,該基因在精巢中的表達(dá)顯著高于卵巢,表現(xiàn)了性別兩相性差異,這與對(duì)尼羅羅非魚(yú)、斜帶石斑魚(yú)、牙鲆、金錢(qián)魚(yú)和圓斑星鰈等Sox9基因的研究結(jié)果是一致的。另外,在許氏平鲉的腦和鰓組織中檢測(cè)到了較高水平的Sox9轉(zhuǎn)錄本,這種現(xiàn)象在其他硬骨魚(yú)中也有報(bào)道,如金錢(qián)魚(yú)[11]和圓斑星鰈[12]。有關(guān)許氏平鲉Sox9基因是否在腦或鰓發(fā)育中起重要作用還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

    目前,Sox9基因在其他硬骨魚(yú)中的細(xì)胞定位研究已有相關(guān)報(bào)道。尼羅羅非魚(yú)Sox9基因在未分化性腺的生殖細(xì)胞周圍細(xì)胞中表達(dá),而性腺分化后僅在精巢的生殖細(xì)胞周圍細(xì)胞中表達(dá)[9]。斜帶石斑魚(yú)Sox9基因僅存在于精巢的Sertoli中[8]。斑馬魚(yú)Sox9a基因在精巢組織的Sertoli細(xì)胞中表達(dá),而Sox9b基因則在卵巢的卵母細(xì)胞中表達(dá)[3]。Yokoi等[4]發(fā)現(xiàn),青鳉Sox9基因僅在卵巢的卵母細(xì)胞中表達(dá)。隨后Nakamoto等[5]在青鳉中得到了精巢型Sox9a2基因,該基因定位于精巢的精原細(xì)胞周圍體細(xì)胞中,而在卵巢中不存在。在許氏平鲉中,本試驗(yàn)中只發(fā)現(xiàn)一種Sox9基因,原位雜交結(jié)果分析顯示,許氏平鲉Sox9基因和其他硬骨魚(yú)類的細(xì)胞定位表達(dá)模式不同, 許氏平鲉Sox9基因綜合了斑馬魚(yú)和青鳉兩種硬骨魚(yú)Sox9基因的細(xì)胞定位表達(dá)模式,即許氏平鲉Sox9基因在精巢的生殖細(xì)胞和Sertoli細(xì)胞,以及在卵巢的卵母細(xì)胞和濾泡中均有表達(dá)。結(jié)合已有研究可以看出,Sox9在不同硬骨魚(yú)類中對(duì)性腺發(fā)育的貢獻(xiàn)有所不同,許氏平鲉Sox9基因可能在兩性性腺的發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

    猜你喜歡
    許氏精巢性腺
    王中柱
    男性腰太粗 性腺功能差
    水溫變化對(duì)近海網(wǎng)箱養(yǎng)殖中許氏平鲉攝食及生長(zhǎng)的影響
    草地貪夜蛾種群性誘測(cè)報(bào)方法研究
    滅多威脅迫下羅非魚(yú)精巢SSH文庫(kù)的構(gòu)建
    名醫(yī)妙用單方治好胃下垂
    鱗翅目昆蟲(chóng)精巢融合的研究
    基于MonoTrap捕集法檢測(cè)中華絨螯蟹性腺和肝胰腺中的香氣成分
    經(jīng)尿道等離子電切術(shù)治療女性腺性膀胱炎(附97例報(bào)告)
    許氏平鲉早期異速生長(zhǎng)模式的研究
    黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲成人国产一区在线观看| 精品国产国语对白av| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲成人免费av在线播放| 久久久久久久久免费视频了| 露出奶头的视频| 国产亚洲av高清不卡| 国产午夜精品久久久久久| 午夜福利视频在线观看免费| 国产在线一区二区三区精| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 老司机午夜十八禁免费视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 天天影视国产精品| 免费高清在线观看日韩| 老熟女久久久| 色综合婷婷激情| 国产单亲对白刺激| 在线看a的网站| 精品乱码久久久久久99久播| 国产亚洲av高清不卡| 高潮久久久久久久久久久不卡| 精品免费久久久久久久清纯 | 啦啦啦中文免费视频观看日本| 久久人妻熟女aⅴ| 99国产极品粉嫩在线观看| 免费在线观看日本一区| 黄片大片在线免费观看| 蜜桃在线观看..| 国产成人欧美| netflix在线观看网站| 国产亚洲欧美精品永久| a在线观看视频网站| 捣出白浆h1v1| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 不卡av一区二区三区| 在线播放国产精品三级| 欧美日韩视频精品一区| 老司机影院毛片| 亚洲精品美女久久av网站| 丁香欧美五月| 美国免费a级毛片| 国产男女内射视频| 黄片大片在线免费观看| 国产精品九九99| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲专区国产一区二区| 国产av国产精品国产| 夜夜夜夜夜久久久久| 天天操日日干夜夜撸| 1024香蕉在线观看| 18禁观看日本| 亚洲一区中文字幕在线| 久久人妻av系列| 日本vs欧美在线观看视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 男女午夜视频在线观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 精品国内亚洲2022精品成人 | 欧美激情极品国产一区二区三区| 亚洲专区中文字幕在线| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 最新美女视频免费是黄的| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲美女黄片视频| 国产精品免费视频内射| 乱人伦中国视频| 免费看a级黄色片| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产日韩欧美在线精品| 中文字幕制服av| 亚洲熟女毛片儿| 水蜜桃什么品种好| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 亚洲 欧美一区二区三区| 久久久久精品国产欧美久久久| 成年女人毛片免费观看观看9 | 成年人免费黄色播放视频| kizo精华| 精品一区二区三卡| 午夜免费成人在线视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲精品中文字幕在线视频| av免费在线观看网站| 老司机福利观看| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲黑人精品在线| 日韩视频一区二区在线观看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久久欧美国产精品| 国产真人三级小视频在线观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 亚洲专区国产一区二区| 我要看黄色一级片免费的| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲精品久久午夜乱码| www.熟女人妻精品国产| av网站在线播放免费| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 日本a在线网址| 亚洲七黄色美女视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 久久精品人人爽人人爽视色| av有码第一页| 一二三四社区在线视频社区8| 国产淫语在线视频| 嫩草影视91久久| 成人av一区二区三区在线看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 搡老熟女国产l中国老女人| 午夜91福利影院| 中文字幕高清在线视频| 国产精品一区二区免费欧美| 中文字幕最新亚洲高清| 伦理电影免费视频| 2018国产大陆天天弄谢| 日韩中文字幕视频在线看片| 色婷婷av一区二区三区视频| 一级片'在线观看视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久热在线av| av天堂久久9| 中文字幕最新亚洲高清| 国产精品电影一区二区三区 | 久久精品亚洲av国产电影网| 天天操日日干夜夜撸| 国产成人精品无人区| 精品免费久久久久久久清纯 | 国产在线视频一区二区| www.999成人在线观看| 久久久久精品人妻al黑| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 人妻 亚洲 视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 99re在线观看精品视频| 成年动漫av网址| av视频免费观看在线观看| 热99久久久久精品小说推荐| 亚洲视频免费观看视频| 国产伦理片在线播放av一区| 日韩欧美三级三区| 欧美激情 高清一区二区三区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲久久久国产精品| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 91精品三级在线观看| av有码第一页| 99精国产麻豆久久婷婷| 欧美激情高清一区二区三区| 51午夜福利影视在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 午夜福利在线观看吧| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲精品自拍成人| 99精品久久久久人妻精品| 99精品久久久久人妻精品| 操出白浆在线播放| 国产97色在线日韩免费| 国产亚洲欧美精品永久| 高清在线国产一区| 高潮久久久久久久久久久不卡| 精品国产国语对白av| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 午夜激情av网站| 亚洲精品国产区一区二| 亚洲国产成人一精品久久久| 日韩欧美国产一区二区入口| tube8黄色片| av欧美777| a级片在线免费高清观看视频| 黄片小视频在线播放| 国产在线视频一区二区| 国产在线免费精品| 香蕉丝袜av| 亚洲国产精品一区二区三区在线| av超薄肉色丝袜交足视频| 国产高清激情床上av| 国产精品免费一区二区三区在线 | 欧美精品啪啪一区二区三区| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 一级黄色大片毛片| 丰满饥渴人妻一区二区三| 婷婷成人精品国产| av线在线观看网站| 亚洲欧美色中文字幕在线| 日韩精品免费视频一区二区三区| 1024香蕉在线观看| 在线天堂中文资源库| 五月开心婷婷网| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 最近最新免费中文字幕在线| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 在线观看免费午夜福利视频| 天天操日日干夜夜撸| 精品国产乱码久久久久久小说| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 成年人黄色毛片网站| 日本vs欧美在线观看视频| 2018国产大陆天天弄谢| 久久国产精品人妻蜜桃| 成人精品一区二区免费| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 不卡一级毛片| 97在线人人人人妻| 亚洲欧美色中文字幕在线| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 十八禁高潮呻吟视频| 国产主播在线观看一区二区| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 免费高清在线观看日韩| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 最新的欧美精品一区二区| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 一个人免费在线观看的高清视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产精品成人在线| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| av网站在线播放免费| 91老司机精品| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 欧美成人午夜精品| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 亚洲国产看品久久| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 中国美女看黄片| 三级毛片av免费| 高清av免费在线| 国产精品电影一区二区三区 | 中文字幕av电影在线播放| 国产精品熟女久久久久浪| 一区二区三区激情视频| 99久久人妻综合| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 中亚洲国语对白在线视频| 美女主播在线视频| 精品欧美一区二区三区在线| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产成+人综合+亚洲专区| 又紧又爽又黄一区二区| 大型黄色视频在线免费观看| 国产在线观看jvid| 国产欧美日韩精品亚洲av| 免费观看人在逋| 成人黄色视频免费在线看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 在线播放国产精品三级| 在线观看免费高清a一片| 亚洲专区国产一区二区| 999久久久国产精品视频| avwww免费| 亚洲中文av在线| 亚洲一区二区三区欧美精品| 视频区图区小说| 国产人伦9x9x在线观看| 国产在视频线精品| 国产一区二区三区视频了| 免费少妇av软件| 日韩三级视频一区二区三区| 欧美精品一区二区大全| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 欧美国产精品一级二级三级| 色综合婷婷激情| 欧美成人午夜精品| 免费黄频网站在线观看国产| 捣出白浆h1v1| 69av精品久久久久久 | 国产精品亚洲一级av第二区| 精品亚洲成国产av| 51午夜福利影视在线观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 啦啦啦在线免费观看视频4| 超碰97精品在线观看| 精品一区二区三卡| videosex国产| 国产黄频视频在线观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 脱女人内裤的视频| 一二三四在线观看免费中文在| 涩涩av久久男人的天堂| 99国产精品免费福利视频| 大型av网站在线播放| 99久久国产精品久久久| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| tube8黄色片| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 久久精品91无色码中文字幕| 女人精品久久久久毛片| 精品少妇久久久久久888优播| a级毛片黄视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 精品福利永久在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 日本av手机在线免费观看| 国产精品1区2区在线观看. | 大片免费播放器 马上看| 中文亚洲av片在线观看爽 | 国产亚洲精品一区二区www | 下体分泌物呈黄色| 丁香六月天网| 在线天堂中文资源库| 大香蕉久久成人网| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 天天影视国产精品| 成在线人永久免费视频| 欧美日韩一级在线毛片| 在线播放国产精品三级| 女性被躁到高潮视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 色精品久久人妻99蜜桃| 精品久久蜜臀av无| 99九九在线精品视频| 好男人电影高清在线观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 日本一区二区免费在线视频| 免费av中文字幕在线| 黄色视频在线播放观看不卡| 日韩视频在线欧美| 性色av乱码一区二区三区2| 精品久久久久久电影网| 中文字幕高清在线视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 日韩大码丰满熟妇| 国产片内射在线| 久久国产精品影院| 两个人免费观看高清视频| 精品国产乱码久久久久久男人| bbb黄色大片| 成人精品一区二区免费| 国产在线一区二区三区精| 午夜福利在线免费观看网站| 国产国语露脸激情在线看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 12—13女人毛片做爰片一| 91精品三级在线观看| 久久午夜亚洲精品久久| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲精品在线美女| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲av国产av综合av卡| 黑人欧美特级aaaaaa片| 日韩中文字幕欧美一区二区| 精品人妻在线不人妻| 色精品久久人妻99蜜桃| 午夜久久久在线观看| 国产精品久久久久久精品电影小说| 美女午夜性视频免费| 精品免费久久久久久久清纯 | 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 黑人欧美特级aaaaaa片| 欧美 日韩 精品 国产| 国产一区二区三区综合在线观看| 中文字幕人妻熟女乱码| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 久久精品国产a三级三级三级| 大香蕉久久网| 夫妻午夜视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 无人区码免费观看不卡 | a级毛片在线看网站| bbb黄色大片| 国产精品久久久久成人av| 他把我摸到了高潮在线观看 | 在线观看人妻少妇| 精品福利永久在线观看| 欧美久久黑人一区二区| 黄色 视频免费看| 久久中文字幕一级| 亚洲国产中文字幕在线视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 久久久国产精品麻豆| 欧美国产精品一级二级三级| 中文字幕制服av| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产精品一区二区在线不卡| 97在线人人人人妻| 欧美精品一区二区大全| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 男女午夜视频在线观看| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲综合色网址| 欧美精品亚洲一区二区| 十八禁网站免费在线| 成人国语在线视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| h视频一区二区三区| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 久久久久精品人妻al黑| 久久九九热精品免费| 精品午夜福利视频在线观看一区 | 亚洲精品在线观看二区| 一级片免费观看大全| 精品高清国产在线一区| 搡老岳熟女国产| 91国产中文字幕| 91九色精品人成在线观看| 午夜福利乱码中文字幕| 制服诱惑二区| 国产亚洲精品一区二区www | 国产成人系列免费观看| 久久精品亚洲av国产电影网| netflix在线观看网站| 国产xxxxx性猛交| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 咕卡用的链子| 一区二区日韩欧美中文字幕| 精品熟女少妇八av免费久了| 又黄又粗又硬又大视频| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 亚洲成国产人片在线观看| 一区二区三区激情视频| 91av网站免费观看| 国产精品久久电影中文字幕 | 国产亚洲欧美精品永久| 悠悠久久av| 一夜夜www| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产老妇伦熟女老妇高清| 男女午夜视频在线观看| 亚洲av国产av综合av卡| 啦啦啦视频在线资源免费观看| av在线播放免费不卡| 亚洲熟女精品中文字幕| 一本久久精品| 黄片小视频在线播放| 老司机午夜十八禁免费视频| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 99re6热这里在线精品视频| 国产成人免费观看mmmm| 国产精品98久久久久久宅男小说| 一二三四社区在线视频社区8| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 国产精品98久久久久久宅男小说| 午夜福利免费观看在线| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲精品在线美女| 亚洲av日韩在线播放| 脱女人内裤的视频| 久久狼人影院| 免费在线观看黄色视频的| 一级a爱视频在线免费观看| 一个人免费在线观看的高清视频| 在线播放国产精品三级| 老司机靠b影院| 亚洲av电影在线进入| 2018国产大陆天天弄谢| 久久久精品区二区三区| 久久中文字幕一级| 免费av中文字幕在线| 久久久久久久国产电影| 在线看a的网站| 欧美精品av麻豆av| 丝袜在线中文字幕| 91成年电影在线观看| 91麻豆av在线| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产av精品麻豆| 久久香蕉激情| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 欧美黄色片欧美黄色片| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲精品美女久久av网站| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲中文字幕日韩| 大香蕉久久网| 日韩大片免费观看网站| 国产视频一区二区在线看| 久久国产精品大桥未久av| 婷婷丁香在线五月| 国产视频一区二区在线看| videosex国产| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 人人妻,人人澡人人爽秒播| 69av精品久久久久久 | 乱人伦中国视频| av网站免费在线观看视频| 黄色毛片三级朝国网站| 精品一区二区三卡| 欧美精品一区二区免费开放| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产主播在线观看一区二区| 黄色片一级片一级黄色片| 黄色视频在线播放观看不卡| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 这个男人来自地球电影免费观看| 精品一区二区三区av网在线观看 | 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 久久久久视频综合| 欧美日韩黄片免| 性色av乱码一区二区三区2| 日日夜夜操网爽| 精品视频人人做人人爽| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 男女免费视频国产| 国产一区二区 视频在线| 亚洲欧美色中文字幕在线| 久久久国产成人免费| 曰老女人黄片| 大香蕉久久网| 中文字幕最新亚洲高清| 日韩成人在线观看一区二区三区| 久久精品亚洲av国产电影网| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 日韩三级视频一区二区三区| 国产精品 欧美亚洲| 91成人精品电影| 成年人黄色毛片网站| 精品福利观看| 日本a在线网址| 国产成+人综合+亚洲专区| 露出奶头的视频| 久久青草综合色| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 精品久久久久久电影网| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 丝袜人妻中文字幕| 不卡av一区二区三区| 国产在线视频一区二区| 国产精品 欧美亚洲| 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲天堂av无毛| 亚洲专区国产一区二区| 99精国产麻豆久久婷婷| 黄片播放在线免费| 男女无遮挡免费网站观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 日韩一区二区三区影片| 99国产精品一区二区蜜桃av | 精品熟女少妇八av免费久了| 在线观看免费视频日本深夜| 18禁美女被吸乳视频| 精品国产乱子伦一区二区三区| avwww免费| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 欧美日韩黄片免| 久久久久国内视频| 欧美精品亚洲一区二区| 国产福利在线免费观看视频| 我要看黄色一级片免费的| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 一级毛片精品| 十八禁网站网址无遮挡| 久久青草综合色| 国产三级黄色录像| 真人做人爱边吃奶动态| 国产三级黄色录像| 一级毛片精品| 国产精品.久久久| 国产av国产精品国产| 国产在线视频一区二区| 精品国产乱子伦一区二区三区| 精品少妇黑人巨大在线播放| 最新美女视频免费是黄的| 宅男免费午夜| 两个人看的免费小视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 色视频在线一区二区三区| 99国产精品免费福利视频| 人人澡人人妻人| 十八禁网站免费在线| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | www.熟女人妻精品国产| avwww免费| svipshipincom国产片| 亚洲精品一二三| 最近最新中文字幕大全电影3 | 日韩大码丰满熟妇| 国产视频一区二区在线看| 免费看十八禁软件| 在线观看免费视频日本深夜| 中国美女看黄片| 一区二区三区激情视频| 91国产中文字幕| 超碰97精品在线观看| 久久久国产成人免费| 好男人电影高清在线观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲伊人色综图| 亚洲免费av在线视频| 在线观看一区二区三区激情| 日韩中文字幕视频在线看片| 国产在线观看jvid| 国产精品免费大片| 国产一卡二卡三卡精品| 两个人看的免费小视频| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲国产欧美网| 亚洲人成77777在线视频|