• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    卵胎生許氏平鲉Sox9基因的克隆、啟動(dòng)子分析、表達(dá)及其細(xì)胞定位研究

    2020-10-13 07:13:14馬麗曼張全啟齊潔盧夢(mèng)萱王文基
    關(guān)鍵詞:許氏精巢性腺

    馬麗曼,張全啟,齊潔,盧夢(mèng)萱,王文基

    (1.臺(tái)州學(xué)院 醫(yī)學(xué)院,浙江 臺(tái)州 318000; 2.中國(guó)海洋大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 青島 266003; 3.臺(tái)州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,浙江 臺(tái)州 318000)

    Sox(Sry-related high mobility group box)基因家族是能夠編碼哺乳動(dòng)物雄性決定基因Sry樣HMG box(兩者具有60% 以上氨基酸序列相似性)的一系列基因[1],之后這些基因在非哺乳動(dòng)物中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。研究表明,Sox基因在性腺分化和早期胚胎發(fā)育中具有重要作用,目前,Sox9基因已被許多學(xué)者作為研究脊椎動(dòng)物性別決定與性腺發(fā)育過(guò)程的關(guān)鍵基因。在哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類中,Sox9基因在性腺分化中的兩性差異表達(dá)模式表明了Sox9基因在其性別決定和性腺發(fā)育過(guò)程中的重要功能。與哺乳動(dòng)物不同,魚(yú)類的性別決定機(jī)制比較復(fù)雜,如在黃鱔Monopterusalbus[2]、斑馬魚(yú)Daniorerio[3]、青鳉Oryziaslatipes[4-5]、鯉Cyprinuscarpio[6]和黃顙魚(yú)Pelteobagrusfulvidraco[7]等一些硬骨魚(yú)類中發(fā)現(xiàn)有兩種Sox9基因,且它們?cè)谛韵僦械谋磉_(dá)模式有所不同。而在斜帶石斑魚(yú)Epinepheluscoioides[8]、尼羅羅非魚(yú)Oreochromisniloticus[9]、牙鲆Paralichthysolivaceus[10]、金錢(qián)魚(yú)Scatophagusargus[11]和圓斑星蝶Veraspervariegatus[12]中僅發(fā)現(xiàn)了一種Sox9基因,且其兩性差異表達(dá)模式均為精巢強(qiáng)于卵巢。這些研究結(jié)果表明,Sox9基因在魚(yú)類性別決定和性腺發(fā)育中可能發(fā)揮著重要的作用。

    許氏平鲉Sebastesschlegeli是中國(guó)北方重要的養(yǎng)殖魚(yú)類,具有個(gè)體大、生長(zhǎng)速度快、抗病力強(qiáng)、卵胎生、味質(zhì)鮮美等優(yōu)點(diǎn)。目前,許氏平鲉苗種主要來(lái)源于海捕野生苗,人工苗種供給率低,且長(zhǎng)期過(guò)度捕撈對(duì)其資源和遺傳多樣性也會(huì)造成一定程度的破壞。因此,大量人工繁育速生、抗病能力強(qiáng)的許氏平鲉苗種已成為保護(hù)許氏平鲉資源及養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必要手段[13]。目前,國(guó)內(nèi)外關(guān)于許氏平鲉的研究主要集中在人工育苗、胚胎發(fā)育及早期形態(tài)發(fā)育等方面[14-17]。而對(duì)于許氏平鲉性腺發(fā)育及性別決定等分子機(jī)制研究甚少。許氏平鲉是卵胎生魚(yú)類,其繁殖習(xí)性與卵生魚(yú)類有所差異,因此,對(duì)許氏平鲉Sox9性別相關(guān)基因的研究,將有利于豐富魚(yú)類性別決定及性腺發(fā)育的生物學(xué)知識(shí),也有利于許氏平鲉繁殖和育種工作的開(kāi)展。本研究中,通過(guò)同源克隆、RACE技術(shù)、實(shí)時(shí)定量 PCR、啟動(dòng)子序列生物信息學(xué)分析及其細(xì)胞定位等技術(shù)對(duì)許氏平鲉Sox9基因進(jìn)行了分析,旨在為魚(yú)類性別分化和分子調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    試驗(yàn)用成體許氏平鲉雌、雄魚(yú)各3尾,體長(zhǎng)為(27±2) cm,體質(zhì)量為(758±15)g,購(gòu)自山東省青島市南山水產(chǎn)市場(chǎng)。不同發(fā)育時(shí)期的仔魚(yú)各5尾,取自煙臺(tái)泰華海珍品有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 組織樣品的制備 成體許氏平鲉取樣當(dāng)天麻醉后立即解剖,取每尾魚(yú)(雌雄魚(yú)各3尾)的肌肉、 肝、全腦、 腎、 鰓、 脾、 腸、 心、 精巢、 卵巢組織,用于成體各組織定量表達(dá)分析。 Omoto 等[18]研究表明,許氏平鲉仔魚(yú)在25日齡時(shí)性腺開(kāi)始分化。本試驗(yàn)中根據(jù)性腺分化的關(guān)鍵時(shí)期(25 日齡) 選取出生后1、 5、 10、 15、 25、 35日齡的仔魚(yú)各5尾,取每尾魚(yú)的軀干部用于仔魚(yú)發(fā)育時(shí)期定量表達(dá)分析。各樣品用液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    用于Sox9基因細(xì)胞定位的材料取自上述成體許氏平鲉的精巢和卵巢,并將其放在1×PBS中漂洗3次,切成1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm的組織塊,放于4% PFA-1×PBS中4 ℃下固定過(guò)夜,固定后保存在100%甲醇中備用。

    1.2.2 總RNA和基因組DNA的提取 用Trizol法提取不同發(fā)育時(shí)期仔魚(yú)和成體各組織的總RNA,操作方法根據(jù)Trizol Reagent 使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取的總RNA樣品經(jīng)DNaseI(TaKaRa)處理后,利用跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)的β-actin引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,檢測(cè) DNA 是否去除干凈。用苯酚-氯仿法從肌肉組織中提取基因組DNA,并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)測(cè)定總RNA和基因組DNA的質(zhì)量和數(shù)量。隨后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒M-MLV(TaKaRa)對(duì)許氏平鲉成體組織和仔魚(yú)發(fā)育時(shí)期樣品的總 RNA進(jìn)行cDNA合成。

    1.2.3 許氏平鲉Sox9基因克隆 運(yùn)用同源克隆方法,根據(jù)已發(fā)表的魚(yú)類Sox9基因保守區(qū)序列,設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物Sox9-CP-FW/RV(表1),并以許氏平鲉精巢和卵巢組織的混合cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃下預(yù)變性5 min;95 ℃下變性30 s,65 ℃下退火30 s,72 ℃下延伸30 s,以后每個(gè)循環(huán)退火溫度降低1 ℃,共進(jìn)行10個(gè)循環(huán)(退火溫度從65 ℃降到55 ℃);隨后95 ℃下變性30 s,55 ℃下退火30 s,72 ℃下延伸30 s,共進(jìn)行25個(gè)循環(huán);最后再在72 ℃下延伸10 min。

    表1 試驗(yàn)所用引物Tab.1 Primers used in this study

    根據(jù)所獲得的核心cDNA片段序列,各設(shè)計(jì)一條特異引物和一條巢式引物用于5′RACE和3′RACE(表1)。用BD SMARTTMRACE cDNA Amplification kit (Clonetech) 進(jìn)行RACE反應(yīng),具體步驟可參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。根據(jù)許氏平鲉Sox9 基因全長(zhǎng)cDNA序列,設(shè)計(jì)跨越5′UTR和3′UTR的一對(duì)特異引物Sox9-gn-FW/RV用于內(nèi)含子序列擴(kuò)增(表1)。以許氏平鲉肌肉組織DNA為模板, 運(yùn)用LA Taq酶(TaKaRa)進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件同“1.2.3”節(jié),只是中間兩次延伸溫度由72 ℃變?yōu)?8 ℃,其他條件和程序不變。

    利用已克隆得到的許氏平鲉Sox9基因全長(zhǎng),在靠近基因的5′側(cè)翼區(qū)設(shè)計(jì)3個(gè)反向嵌套特異引物SP1、SP2、SP3 用于Sox9基因啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增。并運(yùn)用染色體步移試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行3次巢式PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件具體參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。以上反應(yīng)所得的PCR產(chǎn)物,均用15 g/L 的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè),并根據(jù)目的條帶大小,用DNA凝膠回收試劑盒(Zymo Research, Irvine CA, USA) 對(duì)目的DNA進(jìn)行回收純化。將回收產(chǎn)物連接到pMD18-T (TaKaRa)載體上,并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Trans5α (TransGenBiotech) 感受態(tài)細(xì)胞中,采用載體特異引物M13-47/48進(jìn)行菌落PCR陽(yáng)性檢測(cè), 挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序。

    1.2.4 許氏平鲉Sox9 cDNA序列及啟動(dòng)子序列分析 利用NCBI Blast工具(http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast),將得到的核心片段與GenBank中已有的核酸序列進(jìn)行相似性分析,進(jìn)一步確定所得的Sox9基因。運(yùn)用DNASTAR Lasergene及DNAMAN 7.0軟件分析Sox9基因cDNA序列,預(yù)測(cè)ORF。通過(guò)比對(duì)Sox9 DNA與cDNA序列,并結(jié)合其他硬骨魚(yú)類內(nèi)含子情況,確定許氏平鲉Sox9基因的內(nèi)含子位置及數(shù)目。同時(shí)采用ClustalX 1.81軟件比對(duì)不同物種間Sox9蛋白的氨基酸序列。運(yùn)用MEGA 5.0 軟件,采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

    運(yùn)用生物信息學(xué)軟件NNPP(Neural Network Promoter Prediction, http://www. fruitfly.org/seq_ tools/promoter.html)對(duì)所獲得的Sox9基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析,確定基因的轉(zhuǎn)錄起始結(jié)合位點(diǎn)(TSS)。并利用TFSEARCH (http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH. html)、Alibaba 2.1 program(http://www.generegulation.com/pub/programs/alibaba2/index. html)、Match Program(http://www. gene-regulation.com/pub/programs.html#match)、TESS(http://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess)等軟件對(duì)該基因的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

    1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR) 取許氏平鲉成體各組織和仔魚(yú)發(fā)育時(shí)期樣品各1 μg RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,取1 μL cDNA (10 ng/μL)產(chǎn)物進(jìn)行qPCR反應(yīng)。根據(jù)全長(zhǎng)Sox9 cDNA序列設(shè)計(jì)特異引物Sox9-RT-FW/RV(表1),并選用本實(shí)驗(yàn)室篩選出的比較穩(wěn)定的Rpl17為內(nèi)參基因[19]。qPCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系(20 μL)包括:cDNA模板(10 ng) 1 μL, 2×SYBR?Premix Ex TaqTM II (TaKaRa) 10 μL,正、反向引物(10 μmol/L)各0.4 μL, ROX Reference Dye II 0.4 μL,無(wú)菌水7.8 μL。qPCR反應(yīng)程序(兩步法)為:95 ℃下預(yù)變性30 s;95 ℃下變性15 s,60 ℃下退火/延伸45 s,共進(jìn)行40個(gè)循環(huán),并運(yùn)行熔解曲線確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。每一試驗(yàn)樣品重復(fù)擴(kuò)增3次?;蛳鄬?duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCT方法計(jì)算[21]。

    1.2.6 許氏平鲉Sox9基因在性腺組織中的細(xì)胞定位分析 采用原位雜交方法檢測(cè)許氏平鲉Sox9基因在成體性腺組織中的細(xì)胞定位情況。避開(kāi)Sox9基因保守區(qū),設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物Sox9-SP6-FW/Sox9-T7-RV(表1),并以含有目的基因的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,并使用凝膠回收試劑盒ZymocleanTM回收目的片段作為合成探針用的模板。探針的體外轉(zhuǎn)錄采用T7/SP6 RNA Polymerase(TaKaRa)試劑盒,詳細(xì)步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。合成的探針用NucAway Spin Columns進(jìn)行純化。經(jīng)10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,置于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

    取保存于甲醇中的性腺組織塊,用無(wú)水乙醇充分脫水,二甲苯梯度透明,并置于55 ℃蠟浴中透蠟。將經(jīng)過(guò)透蠟的組織進(jìn)行蠟塊包埋,用切片機(jī)制成厚度為7 μm的切片。將切片用乙醇梯度復(fù)水,蛋白酶K處理。用1×PBST洗去消化液,用4% PFA-1×PBS固定30 min,再用1×PBST浸洗3次。將切片置于60 ℃雜交爐中預(yù)雜交3 h,然后加入Sox9 RNA探針于60 ℃雜交爐中雜交過(guò)夜。雜交后第2天移走RNA探針雜交液,并用SSCT梯度清洗切片,加入按1∶2000比例稀釋的anti-Dig-AP抗體,4 ℃下孵育12~16 h。雜交后第3天用1×PBST洗去多余抗體,加入NBT-BCIP顯色液避光顯色。每隔10 min 觀測(cè)顯色情況。染色結(jié)束后,用1×PBST洗凈染液,用1%中性紅復(fù)染。使用顯微鏡(Nikon Eclipse Ti-U)觀察并記錄結(jié)果。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)及Duncan多重比較,顯著性水平設(shè)為0.05。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 許氏平鲉Sox9基因序列分析

    利用DNASTAR軟件將同源克隆得到的核心片段與RACE技術(shù)獲得的兩端側(cè)翼序列進(jìn)行全長(zhǎng)cDNA拼接,得到了許氏平鲉Sox9完整的cDNA序列(GenBank:KJ624404)。從圖1可見(jiàn):許氏平鲉Sox9 cDNA全長(zhǎng)2039 bp,包括5′非翻譯區(qū)(5′UTR)336 bp, 3′非翻譯區(qū)(3′UTR)242 bp,開(kāi)放閱讀框(ORF)1461 bp;在3′UTR中含有多聚腺苷酸加尾信號(hào)(aataaa)和PolyA尾。經(jīng)分析,許氏平鲉Sox9基因的ORF可編碼486個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量為53 090。通過(guò)Sox9全長(zhǎng)cDNA序列與其對(duì)應(yīng)基因組DNA序列比對(duì)分析可知,許氏平鲉Sox9基因含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子,內(nèi)含子大小分別為503 bp和265 bp,且內(nèi)含子和外顯子的邊界都符合“GT-AG”原則。

    2.2 氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

    通過(guò)與人類Homosapiens、小鼠Musmusculus、非洲爪蟾Xenopuslaevis及其他硬骨魚(yú)類的Sox9蛋白序列比對(duì),可以看出在許氏平鲉Sox9蛋白第107~178氨基酸位置有一個(gè)高度保守的HMG結(jié)構(gòu)域(圖2)。在該HMG盒內(nèi)存在一個(gè)特征性基序AQAARRKL,兩個(gè)核定位信號(hào)NLS1(KRPMNAFMVWAQAARRK)和NLS2(RRRK),同時(shí)還含有一個(gè)富含亮氨酸的核輸出信號(hào)NES(LSKTLGKLWRLL)。進(jìn)一步分析顯示,許氏平鲉Sox9氨基酸序列與哺乳動(dòng)物Sox9氨基酸序列的相似性較低,其中與人類的一致性為78.0%,與小鼠的一致性為78.2%,與硬骨魚(yú)類斑馬魚(yú)的Sox9b一致性最低,為73.2%,與其他硬骨魚(yú)類的Sox9氨基酸序列則具有較高的相似性,其中與牙鲆和斜帶石斑魚(yú)的一致性最高,分別為 93.9% 和94.1%。

    根據(jù)已發(fā)表的各個(gè)物種的Sox9氨基酸序列構(gòu)建NJ分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),結(jié)果顯示,哺乳類(如人類,小鼠)、鳥(niǎo)類(如雞)和兩棲類(如非洲爪蟾)的Sox9蛋白聚在一起,硬骨魚(yú)類的斑馬魚(yú)Sox9b則分出了較獨(dú)立的一支,而許氏平鲉、三棘刺魚(yú)等其他硬骨魚(yú)類的Sox9蛋白聚為一支(圖3)。

    2.3 Sox9基因啟動(dòng)子序列的生物信息學(xué)分析

    從圖4-A可見(jiàn):用染色體步移法得到了許氏平鲉Sox9基因的啟動(dòng)子序列(GenBank:KJ624401),長(zhǎng)度為2252 bp。運(yùn)用NNPP軟件對(duì)5′UTR序列及染色體步移得到的序列進(jìn)行分析,確定了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)TSS。在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游未檢測(cè)到典型的TATA box及GC box。

    從圖4-B可見(jiàn):利用TFSEARCH、Match Program、Alibaba 2.1和TESS等在線生物學(xué)軟件對(duì)Sox9基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(cè),預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,在得到的Sox9基因啟動(dòng)子中,存在特化蛋白Sp1、轉(zhuǎn)錄激活蛋白AP-1、八聚體結(jié)合蛋白Oct-1、叉頭框蛋白FOXD3、肝核因子HNF3β、雌激素受體ER、環(huán)磷酸腺苷應(yīng)答元件結(jié)合蛋白CREB、 GATA-2、GATA-3、VBP和核因子NF-κB等蛋白結(jié)合位點(diǎn)。此外,在Sox9基因啟動(dòng)子中還預(yù)測(cè)到了性別相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子SRY、Sox5和Sox9結(jié)合位點(diǎn)。

    2.4 Sox9基因在仔魚(yú)發(fā)育時(shí)期及成魚(yú)組織的表達(dá)

    從圖5-A可見(jiàn):許氏平鲉Sox9 mRNA在仔魚(yú)發(fā)育階段(出生后1、5、10、15、25、35日齡)均有不同程度的表達(dá);在出生后5日齡和10日齡時(shí)表達(dá)量有降低的趨勢(shì),15日齡和25日齡時(shí)表達(dá)量逐漸上升,隨后在35日齡時(shí)表達(dá)量又有所下降。

    從圖5-B可見(jiàn):許氏平鲉Sox9基因在成體肝、心、腦、腎、脾、鰓、肌肉、腸、精巢、卵巢等組織中均有不同程度的表達(dá),在腦、鰓和精巢組織中表達(dá)量較高,且顯著高于其他組織(P<0.05),在肌肉、心、腎和脾中表達(dá)量較低;許氏平鲉Sox9基因在成魚(yú)性腺中表現(xiàn)出性別兩相性差異,即在精巢中的表達(dá)水平要顯著高于卵巢(P<0.05)。

    2.5 Sox9基因在成魚(yú)性腺中的細(xì)胞定位分析

    采用組織切片原位雜交技術(shù)觀察許氏平鲉Sox9基因在成魚(yú)性腺細(xì)胞中的定位表達(dá)情況。圖6-A和圖6-D是性腺組織切片的H.E染色,可以看出,此階段性腺發(fā)育各時(shí)期細(xì)胞比較完全,適用于細(xì)胞定位分析。原位雜交結(jié)果顯示:許氏平鲉Sox9基因在精巢的生殖細(xì)胞(精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和精細(xì)胞)和Sertoli細(xì)胞中均有表達(dá)(圖6-C),且在生殖細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)于Sertoli細(xì)胞;在卵巢的卵母細(xì)胞中同樣檢測(cè)到了Sox9基因轉(zhuǎn)錄本,且在早期發(fā)育的卵母細(xì)胞中表達(dá)信號(hào)較強(qiáng),同時(shí)Sox9基因在卵巢濾泡細(xì)胞中有微弱表達(dá)(圖6-F)。

    3 討論

    3.1 Sox9基因的保守性

    本研究中從許氏平鲉性腺中克隆得到了Sox9基因全長(zhǎng)cDNA及基因組DNA序列。Sox9 mRNA全長(zhǎng)2039 bp,編碼486個(gè)氨基酸,在107~178氨基酸位置有一個(gè)保守的 HMG 盒。該HMG 盒與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中大多數(shù)物種Sox9氨基酸序列是一致的,均含有一個(gè)特征性基序AQAARRKL,兩個(gè)獨(dú)立的核定位信號(hào)NLS1和NLS2,以及一段富含亮氨酸的核輸出信號(hào)NES。許氏平鲉Sox9基因DNA序列包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子,這與哺乳類、鳥(niǎo)類、兩棲類及其他硬骨魚(yú)類的Sox9基因結(jié)構(gòu)相似。分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示,許氏平鲉Sox9與其他硬骨魚(yú)類的Sox9蛋白聚在一起,這說(shuō)明Sox9蛋白結(jié)構(gòu)在魚(yú)類中比較保守。

    3.2 許氏平鲉Sox9基因的命名

    Sox9基因在不同的物種中存在不同數(shù)目的亞型,在人類、小鼠和雞等高等脊椎動(dòng)物中僅找到了一種,而在硬骨魚(yú)如斑馬魚(yú)、青鳉等低等脊椎動(dòng)物中則找到了兩種Sox9基因,命名為Sox9a或Sox9b[3-5]。Volff[20]指出,在硬骨魚(yú)類中存在兩種類型的Sox9基因,也許是由魚(yú)類特有的基因組復(fù)制導(dǎo)致的。目前,Sox9基因亞型的命名無(wú)公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn),a或b僅用于區(qū)分同一物種內(nèi)的不同亞型,而無(wú)法用于鑒定真正的直系同源基因,因此,系統(tǒng)發(fā)生分析的結(jié)果往往比較混亂。本研究中對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn),許氏平鲉Sox9與三棘刺魚(yú)、石斑魚(yú)、牙鲆的Sox9和半滑舌鰨Sox9a在一簇上,同一簇上出現(xiàn)不同的分型,使得進(jìn)化樹(shù)看起來(lái)比較混亂。這與尼羅羅非魚(yú)[8]、斜帶石斑魚(yú)[9]、牙鲆[10]、金錢(qián)魚(yú)[11]和圓斑星蝶[12]情況相似,本研究在許氏平鲉中目前只發(fā)現(xiàn)了一種Sox9基因,系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示,與三棘刺魚(yú)Sox9b聚為一支,考慮到在許氏平鲉中有可能存在另外一種亞型,而此亞型的出現(xiàn)可能導(dǎo)致進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建時(shí)聚類發(fā)生改變,所以暫時(shí)命名為Sox9基因。

    3.3 許氏平鲉Sox9基因的啟動(dòng)子分析

    對(duì)啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)和功能的研究是基因調(diào)控機(jī)制的研究熱點(diǎn)之一。目前,魚(yú)類性別決定和分化相關(guān)的基因調(diào)控機(jī)制尚不明確。研究Sox9性別相關(guān)基因的啟動(dòng)子將有助于本試驗(yàn)中更好地理解相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在性腺發(fā)育中的作用機(jī)制。通過(guò)染色體步移法得到許氏平鲉Sox9基因啟動(dòng)子序列,綜合多個(gè)生物信息學(xué)軟件最終確定了多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。其中,與已發(fā)表的許氏平鲉Sox3基因啟動(dòng)子[21]有共同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),如AP-1、GATA-3、Oct-1、FOXD3及性別相關(guān)蛋白SRY、Sox5、Sox9等結(jié)合位點(diǎn)。這些轉(zhuǎn)錄因子有可能共同調(diào)控著Sox3和Sox9基因的表達(dá),從而影響性腺的發(fā)育。在人類中,SRY基因與Sox9、Sox3基因共同作用決定睪丸的形成[22]。 Kanai等[23]發(fā)現(xiàn),哺乳動(dòng)物SRY性別決定基因能夠直接調(diào)控Sox9基因的表達(dá)。比較有趣的是,本試驗(yàn)中不僅在許氏平鲉Sox3啟動(dòng)子中預(yù)測(cè)到了Sox9蛋白結(jié)合位點(diǎn)[21],而且發(fā)現(xiàn)該蛋白結(jié)合位點(diǎn)也存在于許氏平鲉Sox9基因自身啟動(dòng)子中。預(yù)測(cè)結(jié)果提示,Sox9基因在性別調(diào)控機(jī)制中也許作為Sox3基因的上游基因,對(duì)Sox3基因表達(dá)起調(diào)控作用的同時(shí),對(duì)自身也有一定的反饋調(diào)節(jié)作用。

    另外,在許氏平鲉Sox9基因啟動(dòng)子區(qū)還預(yù)測(cè)到了Sp1、CREB、NF-kB、ER等結(jié)合位點(diǎn)。有研究報(bào)道,人類Sox9基因近端啟動(dòng)子受Sp1和CREB結(jié)合蛋白的調(diào)控[24]。核因子NF-kB廣泛存在于各種細(xì)胞,在免疫應(yīng)答、炎癥、細(xì)胞增殖、分化及凋亡等許多生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮作用。Ushita等[25]發(fā)現(xiàn),NF-kB能夠強(qiáng)烈激活Sox9基因啟動(dòng)子。雌激素只有與雌激素受體ER結(jié)合才能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。Cheng等[26]發(fā)現(xiàn),小鼠ERβ能夠調(diào)控雄激素受體和排卵相關(guān)因子的表達(dá)。Lassiter等[27]發(fā)現(xiàn),ER在硬骨魚(yú)早期胚胎發(fā)育和性腺分化中起重要作用。因此,本試驗(yàn)中推測(cè)這些轉(zhuǎn)錄因子也許能夠直接作用于許氏平鲉Sox9基因的啟動(dòng)子,從而影響性腺的發(fā)育。本研究中完成的許氏平鲉Sox9基因的啟動(dòng)子序列的生物信息學(xué)分析結(jié)果,為今后進(jìn)一步研究Sox9基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

    3.4 Sox9基因的表達(dá)

    組織學(xué)觀察顯示,許氏平鲉在出生后大約25日齡(全長(zhǎng)約20 mm)左右性腺開(kāi)始分化[18]。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)顯示,許氏平鲉Sox9基因在仔魚(yú)發(fā)育時(shí)期各階段均有不同程度的表達(dá),在出生后5日齡和10日齡時(shí)表達(dá)量有降低趨勢(shì),15日齡和25日齡(性腺分化關(guān)鍵時(shí)期)時(shí)表達(dá)量逐漸上升。這與圓斑星鰈的表達(dá)模式相似,即圓斑星鰈Sox9基因在仔魚(yú)20~50日齡時(shí)表達(dá)量逐漸下降,在60日齡 (性腺分化時(shí)期) 時(shí)表達(dá)量上升[12]。因此,本試驗(yàn)中推測(cè)許氏平鲉Sox9基因在出生后25日齡(性腺分化時(shí)期)時(shí)的表達(dá)量達(dá)到較高的水平可能與仔魚(yú)性腺分化有關(guān)。

    目前,有關(guān)Sox9基因在各脊椎動(dòng)物中的組織差異表達(dá)模式已有研究報(bào)道。在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn),Sox9基因與雄性性別的決定和性腺發(fā)育相關(guān),有可能是SRY基因最靠近的下游基因[24]。在硬骨魚(yú)中,Sox9不同類型的基因在性腺中的表達(dá)模式有所不同,如斑馬魚(yú)有Sox9a和Sox9b兩個(gè)Sox9基因,Sox9a在腦、精巢等多種組織中表達(dá),在卵巢中不表達(dá),而Sox9b僅在卵巢中表達(dá)[3]。 Zhou等[2]在黃鱔中克隆得到Sox9a1和Sox9a2兩個(gè)Sox9a基因,它們?cè)诰病⒙殉埠烷g性性腺(精卵巢)中均有表達(dá)。在青鳉中先后發(fā)現(xiàn)了Sox9a基因(只在卵巢中表達(dá))和Sox9a2基因(精巢中表達(dá))[4-5]。俞菊華等[7]在黃顙魚(yú)中克隆得到了Sox9a1和Sox9a2兩個(gè)基因,Sox9a1基因在腦、精巢和卵巢中均有表達(dá),Sox9a2基因只在卵巢中表達(dá),Sox9a2可能參與了雌性性別決定和卵巢發(fā)育過(guò)程。另外,在尼羅羅非魚(yú)[9]、斜帶石斑魚(yú)[8]、牙鲆[10]和金錢(qián)魚(yú)[11]中目前僅找到一種Sox9基因,且主要在精巢中顯著表達(dá)。以上研究結(jié)果表明,不同類型Sox9基因在魚(yú)類中并未呈現(xiàn)出統(tǒng)一的性別差異表達(dá)模式。但通過(guò)已報(bào)道的研究可知,斑馬魚(yú)Sox9a、青鳉Sox9a2,以及斜帶石斑魚(yú)、尼羅羅非魚(yú)、牙鲆和金錢(qián)魚(yú)的Sox9基因的表達(dá)模式與哺乳類Sox9基因還是一致的,均在精巢中有較高水平的表達(dá),表明Sox9基因可能參與了精巢的分化和發(fā)育過(guò)程。本研究中在許氏平鲉中克隆得到了一種Sox9基因,該基因在精巢中的表達(dá)顯著高于卵巢,表現(xiàn)了性別兩相性差異,這與對(duì)尼羅羅非魚(yú)、斜帶石斑魚(yú)、牙鲆、金錢(qián)魚(yú)和圓斑星鰈等Sox9基因的研究結(jié)果是一致的。另外,在許氏平鲉的腦和鰓組織中檢測(cè)到了較高水平的Sox9轉(zhuǎn)錄本,這種現(xiàn)象在其他硬骨魚(yú)中也有報(bào)道,如金錢(qián)魚(yú)[11]和圓斑星鰈[12]。有關(guān)許氏平鲉Sox9基因是否在腦或鰓發(fā)育中起重要作用還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

    目前,Sox9基因在其他硬骨魚(yú)中的細(xì)胞定位研究已有相關(guān)報(bào)道。尼羅羅非魚(yú)Sox9基因在未分化性腺的生殖細(xì)胞周圍細(xì)胞中表達(dá),而性腺分化后僅在精巢的生殖細(xì)胞周圍細(xì)胞中表達(dá)[9]。斜帶石斑魚(yú)Sox9基因僅存在于精巢的Sertoli中[8]。斑馬魚(yú)Sox9a基因在精巢組織的Sertoli細(xì)胞中表達(dá),而Sox9b基因則在卵巢的卵母細(xì)胞中表達(dá)[3]。Yokoi等[4]發(fā)現(xiàn),青鳉Sox9基因僅在卵巢的卵母細(xì)胞中表達(dá)。隨后Nakamoto等[5]在青鳉中得到了精巢型Sox9a2基因,該基因定位于精巢的精原細(xì)胞周圍體細(xì)胞中,而在卵巢中不存在。在許氏平鲉中,本試驗(yàn)中只發(fā)現(xiàn)一種Sox9基因,原位雜交結(jié)果分析顯示,許氏平鲉Sox9基因和其他硬骨魚(yú)類的細(xì)胞定位表達(dá)模式不同, 許氏平鲉Sox9基因綜合了斑馬魚(yú)和青鳉兩種硬骨魚(yú)Sox9基因的細(xì)胞定位表達(dá)模式,即許氏平鲉Sox9基因在精巢的生殖細(xì)胞和Sertoli細(xì)胞,以及在卵巢的卵母細(xì)胞和濾泡中均有表達(dá)。結(jié)合已有研究可以看出,Sox9在不同硬骨魚(yú)類中對(duì)性腺發(fā)育的貢獻(xiàn)有所不同,許氏平鲉Sox9基因可能在兩性性腺的發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

    猜你喜歡
    許氏精巢性腺
    王中柱
    男性腰太粗 性腺功能差
    水溫變化對(duì)近海網(wǎng)箱養(yǎng)殖中許氏平鲉攝食及生長(zhǎng)的影響
    草地貪夜蛾種群性誘測(cè)報(bào)方法研究
    滅多威脅迫下羅非魚(yú)精巢SSH文庫(kù)的構(gòu)建
    名醫(yī)妙用單方治好胃下垂
    鱗翅目昆蟲(chóng)精巢融合的研究
    基于MonoTrap捕集法檢測(cè)中華絨螯蟹性腺和肝胰腺中的香氣成分
    經(jīng)尿道等離子電切術(shù)治療女性腺性膀胱炎(附97例報(bào)告)
    許氏平鲉早期異速生長(zhǎng)模式的研究
    亚洲成人中文字幕在线播放| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产成人精品久久久久久| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲国产欧美人成| 好男人在线观看高清免费视频| 国产精品久久电影中文字幕| 网址你懂的国产日韩在线| 久久99蜜桃精品久久| 少妇的逼好多水| 精品久久久久久久末码| 精品久久久久久久久久久久久| 内射极品少妇av片p| 欧美+亚洲+日韩+国产| 天堂√8在线中文| 日韩高清综合在线| 精品久久久久久久久久免费视频| 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲av男天堂| 国产亚洲精品久久久com| 免费黄网站久久成人精品| 久久亚洲国产成人精品v| 久久热精品热| 一边亲一边摸免费视频| 日本一二三区视频观看| 午夜久久久久精精品| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 免费av毛片视频| 91在线精品国自产拍蜜月| 日本黄大片高清| 亚洲欧洲国产日韩| 日韩高清综合在线| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 在线观看66精品国产| 在线观看一区二区三区| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲成av人片在线播放无| 中文字幕av成人在线电影| 国产av不卡久久| 国产精华一区二区三区| 联通29元200g的流量卡| ponron亚洲| 亚洲内射少妇av| 日韩亚洲欧美综合| 99精品在免费线老司机午夜| 波多野结衣高清无吗| 一级毛片电影观看 | 天天躁日日操中文字幕| 国产精品蜜桃在线观看 | 九色成人免费人妻av| 国内精品宾馆在线| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 久久久久久国产a免费观看| av女优亚洲男人天堂| 国内精品久久久久精免费| 国内精品美女久久久久久| 99热只有精品国产| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 午夜视频国产福利| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲无线在线观看| 女人被狂操c到高潮| 成人永久免费在线观看视频| 欧美bdsm另类| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产精品电影一区二区三区| 日韩人妻高清精品专区| 日本免费a在线| 免费看av在线观看网站| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲成人中文字幕在线播放| 日韩高清综合在线| 可以在线观看毛片的网站| 1000部很黄的大片| a级毛片免费高清观看在线播放| 三级毛片av免费| 亚洲人成网站在线观看播放| 男人舔奶头视频| 一级毛片电影观看 | 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产毛片a区久久久久| 26uuu在线亚洲综合色| 日韩av在线大香蕉| 真实男女啪啪啪动态图| 欧美精品一区二区大全| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 美女高潮的动态| 国产午夜精品论理片| 亚洲成人精品中文字幕电影| 六月丁香七月| 中文字幕久久专区| 国产精品综合久久久久久久免费| 免费大片18禁| 99久久成人亚洲精品观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 久久久久久久久大av| 亚洲精品国产av成人精品| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产精品一区二区性色av| 国产黄a三级三级三级人| 51国产日韩欧美| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 国产av一区在线观看免费| 日本成人三级电影网站| 国产一区二区在线av高清观看| 最近的中文字幕免费完整| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产一区二区在线观看日韩| 日韩亚洲欧美综合| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲成人精品中文字幕电影| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 最新中文字幕久久久久| 日本av手机在线免费观看| 国产精品伦人一区二区| 国产高清不卡午夜福利| 少妇的逼好多水| 最近中文字幕高清免费大全6| 女人被狂操c到高潮| 久久久精品大字幕| 麻豆久久精品国产亚洲av| 成年女人永久免费观看视频| 99久国产av精品| 久久久久久久久久久免费av| 精品久久久久久久久av| 欧美成人精品欧美一级黄| h日本视频在线播放| 亚洲av男天堂| 人妻系列 视频| 特级一级黄色大片| 美女国产视频在线观看| 午夜激情福利司机影院| 看十八女毛片水多多多| 97在线视频观看| 日本黄色片子视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 久久久久久国产a免费观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 伦理电影大哥的女人| 久久精品国产清高在天天线| 国产亚洲欧美98| 九草在线视频观看| 亚洲欧洲日产国产| 99热这里只有精品一区| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲国产欧美人成| 国产精品永久免费网站| 国产极品天堂在线| 亚洲国产精品成人综合色| 一本精品99久久精品77| 国产爱豆传媒在线观看| 一夜夜www| 久久久久久久久久久丰满| 国产成人精品久久久久久| 淫秽高清视频在线观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 精品一区二区三区人妻视频| av在线播放精品| 国产在视频线在精品| 天堂中文最新版在线下载 | 久久人妻av系列| 九九爱精品视频在线观看| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 深夜精品福利| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 三级经典国产精品| 高清日韩中文字幕在线| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 国产男人的电影天堂91| 成年av动漫网址| 亚洲成人av在线免费| 久久人人爽人人爽人人片va| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 日本成人三级电影网站| 青青草视频在线视频观看| 国产久久久一区二区三区| 国产一级毛片七仙女欲春2| or卡值多少钱| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 日韩人妻高清精品专区| 91久久精品国产一区二区成人| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产精品综合久久久久久久免费| 校园人妻丝袜中文字幕| 青春草视频在线免费观看| 亚洲欧美精品专区久久| 1024手机看黄色片| 一个人看的www免费观看视频| 国产av不卡久久| 国产精品伦人一区二区| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 一个人看视频在线观看www免费| 免费av毛片视频| 久久精品夜色国产| 插逼视频在线观看| 国产黄色小视频在线观看| 国产乱人偷精品视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| av卡一久久| 99精品在免费线老司机午夜| 精品久久久久久久久亚洲| 国产亚洲精品久久久com| 欧美日韩国产亚洲二区| 99在线人妻在线中文字幕| 欧美丝袜亚洲另类| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 天天躁日日操中文字幕| 尾随美女入室| 国产av不卡久久| 老司机福利观看| 国产极品精品免费视频能看的| 深爱激情五月婷婷| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲国产精品sss在线观看| 午夜福利视频1000在线观看| 白带黄色成豆腐渣| 九九热线精品视视频播放| 直男gayav资源| 男人舔奶头视频| videossex国产| 少妇的逼水好多| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 乱系列少妇在线播放| 网址你懂的国产日韩在线| 久久久久久久午夜电影| 中文在线观看免费www的网站| 午夜福利在线在线| 国产淫片久久久久久久久| 久久久久国产网址| 97在线视频观看| 直男gayav资源| av天堂在线播放| 日本一二三区视频观看| 亚洲经典国产精华液单| 一个人免费在线观看电影| 国产高清三级在线| 久久99热这里只有精品18| 日韩一区二区三区影片| 国产精品一区二区性色av| 91久久精品国产一区二区成人| 免费一级毛片在线播放高清视频| 免费电影在线观看免费观看| 欧美极品一区二区三区四区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 最近手机中文字幕大全| 国产精品.久久久| 国产精品爽爽va在线观看网站| 乱码一卡2卡4卡精品| 日本与韩国留学比较| 禁无遮挡网站| av福利片在线观看| 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产淫片久久久久久久久| 波野结衣二区三区在线| 综合色丁香网| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲在线观看片| 久久亚洲精品不卡| 老司机福利观看| 男人舔奶头视频| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲国产精品合色在线| 成人漫画全彩无遮挡| 亚洲在线观看片| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产午夜精品一二区理论片| 精品久久国产蜜桃| 黄色欧美视频在线观看| 我的女老师完整版在线观看| 国产久久久一区二区三区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 在现免费观看毛片| 永久网站在线| 亚洲欧美清纯卡通| av福利片在线观看| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国内精品一区二区在线观看| 18禁在线播放成人免费| 中文资源天堂在线| 我要看日韩黄色一级片| 人人妻人人看人人澡| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 九九爱精品视频在线观看| 黄片无遮挡物在线观看| 久久精品久久久久久久性| 两个人的视频大全免费| 美女cb高潮喷水在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 97在线视频观看| 久久久精品大字幕| 亚洲精品色激情综合| 99久久人妻综合| 精华霜和精华液先用哪个| 欧美色欧美亚洲另类二区| ponron亚洲| 国产精华一区二区三区| 欧美三级亚洲精品| 毛片女人毛片| 一级黄色大片毛片| 97热精品久久久久久| 亚洲最大成人中文| 天美传媒精品一区二区| 国产伦一二天堂av在线观看| 超碰av人人做人人爽久久| a级一级毛片免费在线观看| 亚洲国产欧美在线一区| 国产高清三级在线| 99热网站在线观看| 天堂影院成人在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 久久精品国产自在天天线| 免费看av在线观看网站| 成人三级黄色视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 日本欧美国产在线视频| 在线天堂最新版资源| 亚洲五月天丁香| 欧美不卡视频在线免费观看| 精品免费久久久久久久清纯| 国产午夜精品论理片| 淫秽高清视频在线观看| 91精品一卡2卡3卡4卡| 国产精品日韩av在线免费观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 99热网站在线观看| av在线老鸭窝| 亚洲自偷自拍三级| 久久久精品大字幕| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲人成网站在线观看播放| 91久久精品国产一区二区三区| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产av不卡久久| 乱码一卡2卡4卡精品| www.色视频.com| 直男gayav资源| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲人成网站在线播| 日韩中字成人| 99热这里只有精品一区| 久久久成人免费电影| 99热这里只有精品一区| 久久久成人免费电影| 色尼玛亚洲综合影院| 婷婷色综合大香蕉| 国产精品伦人一区二区| 国产不卡一卡二| 免费看av在线观看网站| eeuss影院久久| 极品教师在线视频| 亚洲欧洲国产日韩| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲av.av天堂| 午夜久久久久精精品| 美女国产视频在线观看| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲av免费在线观看| 男女那种视频在线观看| 亚洲内射少妇av| av专区在线播放| 精品久久国产蜜桃| 日韩在线高清观看一区二区三区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 久久亚洲国产成人精品v| 成人漫画全彩无遮挡| 91狼人影院| 免费大片18禁| 少妇高潮的动态图| 日韩欧美精品免费久久| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲av.av天堂| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 日日撸夜夜添| 天堂网av新在线| 国产亚洲91精品色在线| 成人欧美大片| 国产视频首页在线观看| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产高清有码在线观看视频| 夫妻性生交免费视频一级片| 性色avwww在线观看| 99视频精品全部免费 在线| 日韩高清综合在线| 1000部很黄的大片| 99热6这里只有精品| 日日啪夜夜撸| 欧美成人精品欧美一级黄| 在线观看一区二区三区| 中文在线观看免费www的网站| 在线免费观看的www视频| 天堂网av新在线| 床上黄色一级片| 麻豆一二三区av精品| 日韩强制内射视频| 内射极品少妇av片p| 成人午夜高清在线视频| 亚洲经典国产精华液单| 国产亚洲精品久久久com| 两个人的视频大全免费| 国产日本99.免费观看| 最好的美女福利视频网| 特大巨黑吊av在线直播| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 又爽又黄a免费视频| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国内精品久久久久精免费| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲成av人片在线播放无| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 一级毛片我不卡| 精品一区二区三区人妻视频| 久久精品国产亚洲网站| 国产不卡一卡二| 又爽又黄a免费视频| 亚洲国产欧美在线一区| 在线国产一区二区在线| 岛国在线免费视频观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频 | 变态另类成人亚洲欧美熟女| 免费观看的影片在线观看| 我的老师免费观看完整版| 国产人妻一区二区三区在| 欧美又色又爽又黄视频| 成人亚洲精品av一区二区| 99久久精品热视频| 99热精品在线国产| 男女啪啪激烈高潮av片| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产真实乱freesex| 亚洲中文字幕日韩| 一个人观看的视频www高清免费观看| 特级一级黄色大片| 欧美一区二区国产精品久久精品| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲自拍偷在线| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 亚洲欧美精品自产自拍| 日韩欧美精品免费久久| 看十八女毛片水多多多| 69人妻影院| 久久亚洲国产成人精品v| 国产精品三级大全| 亚洲av成人精品一区久久| 久久国产乱子免费精品| 嫩草影院入口| 色5月婷婷丁香| 日韩制服骚丝袜av| 久久精品国产清高在天天线| 成人无遮挡网站| 成人综合一区亚洲| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚洲经典国产精华液单| 麻豆国产97在线/欧美| 99久久成人亚洲精品观看| 日韩制服骚丝袜av| 精品久久久久久久久久久久久| 91麻豆精品激情在线观看国产| 观看免费一级毛片| 亚洲国产欧美在线一区| 精品国内亚洲2022精品成人| 精品久久国产蜜桃| 国产激情偷乱视频一区二区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产探花极品一区二区| 观看美女的网站| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 一本久久精品| 亚洲成人av在线免费| av视频在线观看入口| 国产精品乱码一区二三区的特点| 青青草视频在线视频观看| 91精品一卡2卡3卡4卡| 国产一区二区在线av高清观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产高清视频在线观看网站| 国产av一区在线观看免费| 搡女人真爽免费视频火全软件| 人妻久久中文字幕网| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 级片在线观看| 成人国产麻豆网| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 人妻少妇偷人精品九色| 国产高潮美女av| 欧美成人一区二区免费高清观看| 天天一区二区日本电影三级| 深爱激情五月婷婷| 中国美白少妇内射xxxbb| 色综合站精品国产| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 亚洲美女视频黄频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 精品久久久久久久久亚洲| 成年免费大片在线观看| 日本在线视频免费播放| 亚洲乱码一区二区免费版| av专区在线播放| 成年女人永久免费观看视频| 美女被艹到高潮喷水动态| 精品久久国产蜜桃| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产黄a三级三级三级人| 国产欧美日韩精品一区二区| 男女边吃奶边做爰视频| 一级毛片aaaaaa免费看小| 久久精品影院6| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲精品粉嫩美女一区| 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久久久久久午夜电影| 亚洲成av人片在线播放无| 18禁在线播放成人免费| 日本熟妇午夜| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 日韩欧美一区二区三区在线观看| 中文字幕熟女人妻在线| 麻豆成人av视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 成年版毛片免费区| 亚洲精品国产av成人精品| 永久网站在线| 久99久视频精品免费| 99国产极品粉嫩在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产真实伦视频高清在线观看| 成人二区视频| 久久精品国产自在天天线| 日本三级黄在线观看| 97超视频在线观看视频| 亚洲在线自拍视频| 精品久久久久久久久av| 日韩成人伦理影院| 丝袜美腿在线中文| 一级黄色大片毛片| 老司机影院成人| 22中文网久久字幕| 国产精品伦人一区二区| 在线观看一区二区三区| 观看免费一级毛片| 亚洲内射少妇av| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲七黄色美女视频| av天堂中文字幕网| 欧美成人一区二区免费高清观看| 九九在线视频观看精品| 简卡轻食公司| 中文字幕av成人在线电影| 中出人妻视频一区二区| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲在线自拍视频| 中国国产av一级| 岛国毛片在线播放| 午夜免费激情av| 久久久久久九九精品二区国产| 久久99热6这里只有精品| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产av一区在线观看免费| 少妇的逼好多水| 国产精品野战在线观看| 国产一区二区激情短视频| 91精品一卡2卡3卡4卡| 性插视频无遮挡在线免费观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 可以在线观看的亚洲视频| 黄片无遮挡物在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 在线观看av片永久免费下载| 三级毛片av免费| 免费观看a级毛片全部| 亚洲久久久久久中文字幕| 久久99热这里只有精品18| 国产在线精品亚洲第一网站| 色吧在线观看| 成人综合一区亚洲| 综合色av麻豆| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲自偷自拍三级| a级一级毛片免费在线观看| 欧美zozozo另类| 免费看光身美女| 久久久色成人| 久久欧美精品欧美久久欧美| 免费黄网站久久成人精品| 九色成人免费人妻av| www.av在线官网国产| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产一区二区三区av在线 | 亚洲欧美精品专区久久| 午夜久久久久精精品| 综合色av麻豆| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 日本欧美国产在线视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 精品日产1卡2卡| 色吧在线观看|