白及多糖超聲提取工藝及其抗氧化活性研究

吳詩惠 王劍波 開拓 朱寧 楊軍 季紹聰 張美 楊安東

摘要?目的：優(yōu)化白及多糖的超聲提取工藝，比較不同產(chǎn)地白及多糖含量差異，考察白及多糖穩(wěn)定性和抗氧化活性。方法：以多糖得率為考察指標(biāo)，料液比、超聲溫度、超聲時間為考察因素設(shè)計L9（34）正交試驗優(yōu)化白及多糖超聲波提取工藝;以苯酚-硫酸法測定白及多糖含量，考察陜西漢中、云南普洱、湖南洪江及四川綿陽白及多糖含量產(chǎn)地差異;以化學(xué)方法考察白及多糖穩(wěn)定性，并比較白及多糖對1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）和羥基自由基（·OH）的清除率以評價其體外抗氧化活性。結(jié)果：最佳超聲提取工藝條件為：料液比1∶25（g/mL）、超聲溫度80 ℃、超聲時間10 min;四川綿陽白及多糖含量最高，達(dá)到60.81%，湖南洪江次之，云南普洱最低;白及多糖在檸檬酸及中性溶液中的穩(wěn)定性較好，在苯甲酸鈉、過酸性或過堿性溶液中的穩(wěn)定性較差;白及多糖能有效地清除DPPH和羥基自由基，具有潛在的體外抗氧化活性。結(jié)論：白及多糖超聲波提取工藝的優(yōu)化及其抗氧化活性研究，可為白及多糖提取及綜合利用提供借鑒。

關(guān)鍵詞?白及;多糖;超聲波;穩(wěn)定性;抗氧化活性;提取工藝;正交試驗;自由基

Abstract?Objective：To optimize the ultrasonic extraction process of Bletillastriata polysaccharides， compare the content of Bletillastriata polysaccharides from different origins， and investigate the stability and antioxidant activity of Bletillastriata polysaccharides. Methods：Polysaccharide yield rate was taken as the investigation index， the material-liquid ratio， ultrasonic temperature， and ultrasonic time was as the investigation factors， L9 （34） orthogonal test was designed to optimize the ultrasonic extraction process of Bletillastriata polysaccharides; the content of Bletillastriata polysaccharides was determined by phenol-sulfuric acid method. the differences in polysaccharide content of Bletillastriata polysaccharides in Hanzhong in Shaanxi， Pu′er in Yunnan， Hongjiang in Hunan and Mianyang in Sichuan were investigated. The stability of Bletillastriata polysaccharides was investigated by chemical methods， and the clearance rate of 1， 1-diphenyl-2-picridyl radical （DPPH·） and hydroxyl radical （·OH） by Bletillastriata polysaccharides was compared to evaluate its in vitro antioxidant activity. Results：The optimum extraction conditions were：solid/liquid ratio 1∶25 （g/mL）， ultrasonic temperature 80 ℃， ultrasonic time 10 min. The content of Bletillastriata polysaccharides in Mianyang in Sichuan was the highest， reaching 60.81%， Hongjiang in Hunan Province was the second， Puer in Yunnan Province was the lowest; the stability test showed that the stability of Bletillastriata polysaccharides in citric acid and neutral solution was better than that in sodium benzoate， acid or alkaline solution. Bletillastriata polysaccharides can effectively remove DPPH and hydroxyl free radicals， and have potential antioxidant activity in vitro. Conclusion：Study on the optimization of the extraction process of Bletillastriata polysaccharides and its antioxidant activity can provide a reference for the extraction and comprehensive utilization of Bletillastriata polysaccharides.

Keywords?Bletillastriata;Polysaccharides; Ultrasonic extraction; Stability; Antioxidant activity; Extraction process; Orthogonal test; Free radical

中圖分類號：R282文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.17.007

白及（Bletillastriata（Thunb.）Reichb.f）別名連及草、雪如末、甘根，是蘭科白及屬多年生草本植物[1-2]，因具有收斂止血、消腫生肌的功效，被作為一種傳統(tǒng)中藥在臨床上廣泛使用[3]。白及在陜西、云南、四川等地區(qū)大量種植，不同產(chǎn)地的白及活性成分有較大差異。其中40%～50%的天然水溶性白及多糖，是白及的主要功效成分，其化學(xué)組成為葡甘聚糖[4]，可溶于水并形成黏稠的親水膠液。目前白及多糖主要的提取方法有超聲提取法[3]、酶提取法[4]、紅外輻射法[5]、浸提法[6]等。

白及多糖具有抗炎、促凝血、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等生物學(xué)活性[7]，對瘡瘍腫毒、胃潰瘍、內(nèi)外傷出血等癥具有治療作用[1]。除此以外，白及多糖是一種優(yōu)良的天然增稠劑，可以形成高濃度、低黏度膠液，同時白及多糖具有優(yōu)良的成膜性能，可以制備水果涂膜保鮮劑，減少水分蒸發(fā)達(dá)到保鮮目的?？偟膩碚f白及多糖是安全性較高的醫(yī)藥原料、藥用輔料和生物醫(yī)學(xué)材料[8]。

我們對白及多糖超聲提取條件進(jìn)行優(yōu)化研究，通過對料液比、超聲時間、超聲溫度等因素進(jìn)行正交設(shè)計，以多糖含量為指標(biāo)，確定最佳的提取條件，并比較不同產(chǎn)地白及多糖含量，考察其穩(wěn)定性和抗氧化活性，為白及藥材的綜合開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1?儀器與試藥

1.1?儀器?分析天平（蘇州江東精密儀器有限公司，型號：ESJ210-4A），電熱恒溫股份干燥箱（常州普天儀器制造有限公司，型號：DHG-9140A），數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，型號：KH5200DE），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠，型號：RE-2000A），紫外可見分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司，型號：752N），電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，型號：HWS-26），電子天平（賽多利斯公司，德國，型號：QUINTIX224-1CN），高速冷凍離心機(jī)（Heraeus Multifuge，美國，型號：XIR），臺式低速自動平衡離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗儀器開發(fā)有限公司，型號：L-420）梅特勒-托利多pH計（上海梅特勒-托利多儀器有限公司，型號：FE28-Standard），冷凍干燥機(jī)（北京松源華興科技發(fā)展有限公司，型號：LGJ-12），萬能粉碎機(jī)（天津泰斯特公司，型號：FW100）。

1.2?試劑?D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110833-201707）、1，1-二苯基-2-苦肼基（Sigma，美國，貨號：257621-100MG），其余試劑均為成都科龍化工有限公司生產(chǎn)，分析純。

1.3?分析樣品?白及藥材于2020年3月購自四川省成都荷花池中藥市場，產(chǎn)地分別為陜西漢中（批號：1901、1902、1903）、云南普洱（批號：1904、1905、1906）、湖南洪江（批號：1907、1908、1909）及四川綿陽（批號：1910、1911、1912），共12批次，經(jīng)四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所張超研究員鑒定為蘭科植物白及Bletillastriata（Thunb.）Reichb.f的塊莖。

2?方法與結(jié)果

2.1?對照品溶液的制備?葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：取D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品于105 ℃干燥至恒重，精密稱取20 mg于500 mL量瓶中，用水溶解并定容至刻度，搖勻，即得。濃度為0.04 g/mL，備用。

2.2?標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備?分別精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、1.4、1.6 mL于棕色試管中，加水補(bǔ)至2.0 mL，加入1.0 mL濃度為5%的苯酚溶液（臨用新配），迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，放置5 min后，至沸水浴中加熱30 min，冷卻至室溫，在490 nm處測定吸光值，同法制空白對照溶液，以吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3?供試品溶液的制備?將白及塊莖用清水洗凈，潤透，切薄片，40 ℃烘箱中干燥至恒重，粉碎，過80目篩，稱取100 g，置圓底燒瓶中，加入85%乙醇1.5 L，回流提取1 h，重復(fù)操作2次，棄去提取液，以除去脂溶性成分，殘渣揮干溶劑并晾干后，置于60 ℃烘箱中烘干備用。取上述預(yù)處理過的白及藥材粉末20 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加蒸餾水200 mL，80 ℃下超聲提取3次（超聲頻率50 kHz），10 min/次，合并提取液，離心，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至黏稠狀，冷卻后加入95%乙醇緩慢攪拌，使含醇量達(dá)到80%，4 ℃冰箱放置過夜，在12 000 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min，沉淀物再加95%乙醇攪拌，靜置，使之充分脫水，在3 000 r/min，離心半徑13.5 cm，離心5 min，揮干溶劑，再用少量蒸餾水溶解后，按體積比1∶4加入Sevage試劑充分振搖后，在3 000 r/min，離心半徑13.5 cm，離心5 min，重復(fù)3次，以除去游離蛋白質(zhì)（雙縮脲反應(yīng)呈陰性），沉淀置于-80 ℃預(yù)冷凍6 h，再冷凍干燥24 h，研細(xì)，即得白及粗多糖樣品。稱取干燥至恒重的白及多糖樣品25 mg，加入少量蒸餾水，加熱，攪拌使溶解，置于100 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，量取10 mL于100 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.4?測定法?精密吸取供試品溶液0.2 mL于棕色試管中，照2.2項下自“于棕色試管中”起，同法操作，測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中葡萄糖的含量并計算。

2.5?檢測波長選擇?精密吸取供試品溶液和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL，照測定法顯色后對200～600 nm范圍進(jìn)行波長掃描，結(jié)果顯示其最大吸收波長為490 nm。

2.6?線性關(guān)系考察?精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、1.4、1.6 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，照上述方法測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為Y=0.085 63X+0.001 52，R2=0.997 1，表明葡萄糖濃度在8.0～64 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7?供試品溶液穩(wěn)定性試驗?精密吸取白及多糖供試品溶液0.2 mL，按2.4項下顯色方法進(jìn)行測定，20 min測定1次，連續(xù)測定5次，結(jié)果顯示：在100 min時間內(nèi)，供試液的吸收度值RSD%分別為2.68%（n=5），表明穩(wěn)定性良好，在2 h內(nèi)測定結(jié)果可靠。

2.8?中間精密度試驗?取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、白及多糖供試品溶液0.2 mL，各平行5份，經(jīng)檢測葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液與白及多糖供試液的吸收度值（A490 nm）RSD%分別為0.28%、0.53%（n=5），表明該方法精密度符合要求。

2.9?回收率試驗?精密量取白及多糖供試品溶液3.0 mL于9支10 mL容量瓶中，分別按照高（5.0 mL）、中（3.0 mL）、低（1.0 mL）劑量加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.4 mg/mL），用蒸餾水定容后，混勻，精密吸取0.2 mL，置于比色管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項下進(jìn)行顯色并測定，加樣回收率測定結(jié)果平均值為98.86%，RSD%為1.32%，表明本法準(zhǔn)確性較高，符合含量測定的要求。

2.10?白及多糖超聲波提取法

采用超聲波提取法，擬定影響多糖得率的3個因素即料液比（g/mL）、超聲溫度（℃）和超聲時間（min）為優(yōu)選因素，每個因素設(shè)定3個水平進(jìn)行正交試驗。選L9（34）正交表進(jìn)行設(shè)計，并以多糖含量作為考察指標(biāo)。見表1。直觀分析可知影響白及多糖超聲波提取法的因素次序為：超聲溫度（B）>料液比（A）>超聲時間（C），最佳工藝條件組合為A3B3C1，即料液比1∶25（g/mL）、超聲溫度80 ℃、超聲時間10 min。見表2。方差分析結(jié)果可知，超聲溫度（B）和料液比（A）對白及多糖得率有顯著的影響，而超聲時間（C）無顯著影響。見表3。按最優(yōu)工藝進(jìn)行3次重復(fù)試驗，白及多糖得率為60.47%、60.39%、61.52%，平均60.79%，高于表2中的任意組合，表明優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可行。

2.11?樣品測定結(jié)果?各產(chǎn)地白及中多糖含量結(jié)果見表4。通過直觀分析可以看出，來源于不同地區(qū)的白及藥材中，其多糖含量存在較大差異，其中產(chǎn)地為四川綿陽的白及多糖含量最高，達(dá)60.81%，其他依次為湖南洪江、陜西漢中和云南普洱，說明地域性條件對白及藥材的內(nèi)在質(zhì)量影響明顯。

2.12?白及多糖穩(wěn)定性考察

2.12.1?食品添加劑對白及多糖穩(wěn)定性影響?取濃度為5.0 mg/mL的四川綿陽白及粗多糖溶液5 mL，平行2份，分別加入2.0 mL 0.05 mol/L苯甲酸鈉、2.0 mL 0.05 mol/L檸檬酸，搖勻密封，避光靜置2 h，加入苯酚-硫酸溶液顯色，冷卻20 min后測定其吸光度[9]，同時以水為空白，同上操作。結(jié)果見表5。檸檬酸組影響較小，接近對照組，而苯甲酸鈉組影響較大。

2.12.2?pH對白及多糖穩(wěn)定性影響?pH值對白及粗多糖穩(wěn)定性的影響：取濃度為5.0 mg/mL的四川綿陽白及粗多糖溶液5 mL，各6份，用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH，為2.0，4.0，6.0，8.0，10.0和12.0，振搖密封，避光處理2 h，用上述苯酚-硫酸比色法測其吸光度[10]，同時以蒸餾水為空白，同上操作，扣除溶劑的影響后，計算出吸光度值。結(jié)果如圖1所示，酸性與堿性對白及多糖均有一定的影響，其中酸性對白及多糖影響大于堿性，同時，白及多糖在pH=8時，相對穩(wěn)定。

2.13?白及多糖抗氧化活性試驗

2.13.1?白及多糖對DPPH·自由基的清除能力?DPPH·清除能力的測定：·參照Luo等[10]（2011）的方法，分別取濃度為0.001、0.01、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL產(chǎn)地為四川綿陽的白及粗多糖樣品供試液各2.0 mL，分別加入2.0 mL 0.1 mmol/L的DPPH·-80%甲醇溶液，室溫反應(yīng)30 min，在517 nm處測定吸光度值，并按以下公式計算白及多糖對DPPH·的清除率（I%）。式中A1為供試液吸光度值;A0為水代替白及多糖組;A2為水代替DPPH·。以同濃度抗壞血酸（維生素C）為陽性對照，做相同處理并計算結(jié)果。

隨著濃度升高，白及多糖對DPPH·自由基的清除能力逐漸提高，在白及多糖濃度≤0.6 mg/mL時，提升較為明顯，具有明顯的濃度依賴性。當(dāng)濃度達(dá)到5 mg/mL時，白及多糖和維生素C對DPPH·自由基清除率分別達(dá)到69.73%和95.64%。見圖2。

2.13.2?白及多糖對羥基（·OH）自由基的清除能力?羥基自由基（·OH）清除率的測定：參照Sun等[11]的方法，取產(chǎn)地為四川綿陽的白及粗多糖樣品，分別配置成0.001、0.01、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL的供試品溶液，各取1.0 mL，依次分別加入9 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL、9 mmol/L的水楊酸溶液1.0 mL以及0.1%的H2O2溶液0.5 mL，混勻，置于37 ℃反應(yīng)30 min，在510 nm下測定吸光度值，記為A1，以去離子水代替樣品作為待測溶液，記為A0，以去離子水代替FeSO4、水楊酸和H2O2溶液，記為A2對同樣濃度的維生素C（Vc）作同樣處理作為陽性對照，按上述同樣公式計算（·OH）清除率（I%）。

結(jié)果如圖3所示：白及多糖對·OH自由基的清除能力跟多糖濃度呈正相關(guān)趨勢，當(dāng)白及多糖濃度≥3 mg/mL時，清除能力增加變緩。

3?討論

本研究采用較為成熟的苯酚-硫酸法顯色，UV-VIS測定不同產(chǎn)地白及中多糖的含量，經(jīng)方法學(xué)驗證，本法靈敏度高、顯色穩(wěn)定且結(jié)果準(zhǔn)確。從試驗結(jié)果可知，不同產(chǎn)地的白及多糖含量存在差異，其中四川綿陽的白及多糖含量遠(yuǎn)高于湖南洪江、陜西漢中和云南普洱，說明白及藥材因來源不同，由于其生長環(huán)境的不同等因素，其內(nèi)在質(zhì)量存在一定的差異。對白及多糖的提取，利用超聲波輔助處理，采用正交實(shí)驗得出白及多糖的最優(yōu)提取條件為：料液比1∶25（g/mL）、超聲溫度80 ℃、超聲時間10 min，白及多糖收率可達(dá)60%，與傳統(tǒng)溶劑提取法比較，多糖含量及轉(zhuǎn)移率都有所提高，且具有便捷、高效、環(huán)保、節(jié)能等特點(diǎn)。白及多糖穩(wěn)定性研究結(jié)果表明，白及多糖在酸性條件下穩(wěn)定性較差，在中性溶液中穩(wěn)定性較好，堿性溶液中影響低于酸性。同時，食品添加劑苯甲酸鈉對白及多糖的穩(wěn)定性影響較大，檸檬酸中較穩(wěn)定，這對白及多糖在食品加工領(lǐng)域的應(yīng)用具有一定指導(dǎo)意義。因此，在開發(fā)利用白及多糖時，應(yīng)盡量控制影響白及多糖穩(wěn)定性的不良因素，避免白及多糖與苯甲酸鈉等食品添加劑直接接觸。據(jù)報道，多糖糖醛酸含量、分子量大小等因素對其清除DPPH·自由基的能力強(qiáng)弱有影響[12-13]?？寡趸芯拷Y(jié)果表明，白及多糖具有清除羥基自由基（·OH）和二苯基苦酰肼基自由基（DPPH·）的能力，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性，但清除能力不同，且弱于陽性藥物維生素C。以上研究結(jié)果為白及多糖在自由基清除劑、食品添加劑等中的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)，也為白及藥材的綜合開發(fā)利用提供了供參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]孫達(dá)鋒，史勁松，張衛(wèi)明，等.白芨多糖膠研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2009，30（3）：296-298.

[2]韓欣，王文蘋，隋宏，等.白芨多糖的提取與除蛋白研究[J].寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013，35（5）：536-538.

[3]王芳，李東.白芨多糖的超聲提取條件優(yōu)選[J].產(chǎn)業(yè)與科技論壇，2013，12（16）：106-107.

[4]孔俊豪，史勁松，孫達(dá)峰，等.白芨多糖的酶法精制工藝條件研究[J].食品科學(xué)，2009，30（14）：52-56.

[5]Qu Y，Li C，Zhang C，et al.Optimization of infrared-assisted extraction of Bletilla striata polysaccharides based on response surface methodology and their antioxidant activities[J].Carbohydr Polym，2016，148：345-353.

[6]舒任庚，蔣躍平，蔡永紅.植物多糖的提取分離方法探討[J].中國藥房，2011，22（11）：1052-1055.

[7]趙文昌，宋麗軍，許健煌.天然高分子白芨多糖在藥物制備中的應(yīng)用[J].今日藥學(xué)，2010，20（3）：2-3.

[8]王軼，于國英，高振珅.正交試驗法優(yōu)化白及粗多糖的提取工藝[J].中藥材，2012，35（2）：314-316.

[9]史娟.微波預(yù)處理-超聲波提取山茱萸多糖及穩(wěn)定性研究[J].食品研究與開發(fā)，2014，35（1）：1-5.

[10]Luo Q，Zhang J，Yan L，et al.Composition and antioxidant activity of water-soluble polysaccharides from Tuber indicum[J].J Med Food，2011，14（12）：1609-1616.

[11]Sun L，Wang C，Shi Q，et al.Preparation of different molecular weight polysaccharides from Porphyridium cruentum and their antioxidant activities[J].Int J Biol Macromol，2009，45（1）：42-47.

[12]Sun L，Wang L，Li J，et al.Characterization and antioxidant activities of degraded polysaccharides from two marine Chrysophyta[J].Food Chem，2014，160：1-7.

[13]Zeng WC，Zhang Z，Jia LR.Antioxidant activity and characterization of antioxidant polysaccharides from pine needle（Cedrus deodara）[J].Carbohydr Polym，2014，108：58-64.

（2020-07-10收稿?責(zé)任編輯：楊覺雄）