補(bǔ)腎助孕方對腎虛薄型子宮內(nèi)膜大鼠內(nèi)膜容受性的影響及機(jī)制研究

楊斌 周文清 陳莎 郭宇潔 謝京紅

摘要?目的：觀察補(bǔ)腎助孕方對腎虛薄型大鼠子宮內(nèi)膜容受性的影響，探討中藥的作用機(jī)制。方法：雌性SD大鼠30只，隨機(jī)分為對照組10只，造模組20只，通過羥基脲灌胃建立腎虛合并著床障礙型子宮內(nèi)膜大鼠模型。隨后將20只造模組大鼠隨機(jī)分為模型組和補(bǔ)腎助孕方組，每組10只。對照組、模型組均灌服蒸餾水10 mL/kg;補(bǔ)腎助孕方組灌服中藥0.3 mg/kg，均1次/d，持續(xù)3個動情周期（15 d）。在第3個動情期后處死大鼠，酶聯(lián)免疫吸附法檢測動脈血中雌二醇、孕酮的水平。取子宮標(biāo)本，光鏡下觀察子宮內(nèi)膜形態(tài)，測量子宮內(nèi)膜厚度、子宮間質(zhì)厚度、子宮腺體數(shù)、子宮血管數(shù)。免疫組化法檢測各組內(nèi)膜組織中整合素β3和白血病抑制因子的表達(dá)。結(jié)果：與正常對照組比較，模型組大鼠動脈血雌二醇、孕酮的水平減少;子宮內(nèi)膜腺體稀少，上皮變薄，間質(zhì)致密，血管少;子宮內(nèi)膜厚度、子宮間質(zhì)厚度、子宮腺體數(shù)、子宮血管數(shù)均減少;整合素β3和白血病抑制因子的表達(dá)減少。補(bǔ)腎助孕方組較之模型組，有明顯的改善。結(jié)論：補(bǔ)腎助孕方可改善腎虛合并著床障礙型狀態(tài)大鼠子宮內(nèi)膜的容受性，可能與提高血中激素水平，增加內(nèi)膜中整合素aβ3和白血病抑制因子的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞?補(bǔ)腎助孕方;子宮內(nèi)膜容受性;子宮內(nèi)膜形態(tài);整合素β3;白血病抑制因子

Abstract?Objective：To observe the effects of Bushen Zhuyun Formula on the endometrial receptivity of?rat model with kidney deficiency and?thinner endometrial， for exploring the possible mechanism of the Chinese medicine. Methods：A total of 30 female SD rats were randomly divided into a control group （10 rats） and a model group （20 rats）. Rats model with kidney deficiency and embryo implantation dysfunction were established by intragastric administration of hydroxyurea. Then 20 rats in the modeling group were randomized into a model group， Bushen Zhuyun group with 10 in each.The control group and the model group was given oral administration of distilled water 10 ml/kg; the Bushen Zhuyun Formula group was given Chinese medicine 0.3 mg/kg， respectively. All these rats were intervened once daily， and the intervention lasted for 3 consecutive estrous cycles （15 days）. Rats were sacrificed after the third estrus period. Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the levels of estradiol and progesterone in arterial blood. Take a specimen of the uterus， observe the morphology of the endometrium under a light microscope， measure the thickness of the endometrium， the thickness of the interstitium， the number of uterine glands， and the number of uterine blood vessels. Immunohistochemical method was used to detect the expression of integrin β3 and leukemia inhibitory factor in the inner membrane tissue of each group. Results：Compared with the normal control group， the arterial blood estradiol and progesterone levels of rats in the model group were reduced; the endometrial glands were sparse， the epithelium became thin， the interstitium was dense， and the blood vessels were less; the thickness of the endometrium， the thickness of the interstitium， the number of uterine glands and uterine blood vessels decreased; the expression of integrin β3 and leukemia inhibitory factor decreased. Compared with the model group， the Bushen Zhuyun Formula group has obvious improvement. Conclusion：Bushen Zhuyun Formula can improve the endometrial receptivity of rat model with kidney deficiency and embryo implantation dysfunction， and the mechanism is related to increasing hormone levels in the serum and ？increasing the expressions of integirn β3 and leukemia inhibitory factor （LIF） in the endometrium.

Keywords?Bushen Zhuyun Formula; Endometrial receptivity; Endometrial morphology; Integrin β3; Leukemia inhibitory factor

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.17.009

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（Recurrent Spontaneous Abortion， RSA）是指與同一性伴侶在孕20周以內(nèi)連續(xù)發(fā)生2次及2次以上的自然流產(chǎn)，發(fā)病率約占育齡期婦女的5%[1]，再發(fā)生風(fēng)險高達(dá)70%～80%[2]。RSA發(fā)病機(jī)制多樣，可能的因素包括遺傳、解剖、感染、內(nèi)分泌因素等等[1]，子宮內(nèi)膜容受性（ER）異常也是引起RSA發(fā)生的高危因素之一[3]。子宮內(nèi)膜容受性差是指子宮內(nèi)膜對胚胎定位、黏附、侵入的接受能力低，可以直接導(dǎo)致胚胎的植入失敗[4]。因此，改善子宮內(nèi)膜容受性亦是降低RSA復(fù)發(fā)風(fēng)險的有效措施。補(bǔ)腎助孕方是國醫(yī)名師蔡連香主任治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、不孕癥等的經(jīng)驗方，臨床應(yīng)用效果顯著，可明顯降低復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的再發(fā)生率，機(jī)制可能與子宮內(nèi)膜厚度增加，內(nèi)膜容受性得到改善有關(guān)[5-6]。本研究擬觀察補(bǔ)腎助孕方對腎虛復(fù)發(fā)性流產(chǎn)大鼠子宮內(nèi)膜容受性及其影響因素的作用，研究中藥對復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的防治機(jī)制，并探索補(bǔ)腎助孕方對子宮內(nèi)膜容受性的作用靶點(diǎn)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物?SPF級SD雌性大鼠30只，體質(zhì)量（235±15）g，北京維通利華實(shí)驗動物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2016-0001。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，室溫20～24 ℃，濕度40%～60%。本研究已通過西苑醫(yī)院倫理委員會的審核批準(zhǔn)（倫理審批號：2018XL088）。

1.1.2?藥物?1）補(bǔ)腎助孕方（由菟絲子30 g、太子參20 g、制龜甲20 g、續(xù)斷20 g、熟地黃10 g、白術(shù)10 g、當(dāng)歸10 g、陳皮10 g組成），煎制成含生藥量3.0 g/mL的溶液。按照大鼠體表面積換算方法，大鼠的使用劑量為0.3 mg/（kg·d）;2）羥基脲片（齊魯制藥有限公司，批號：H37021289），在蒸餾水藥片溶解藥片，大鼠的灌胃劑量為450 mg/（kg·d）。

1.1.3?試劑與儀器?大鼠雌二醇（Estradiol，E2）、孕酮（Progesterone，P）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（伊萊瑞特生物科技有限公司，貨號分別為E-EL-RO348c，E-EL-RO775c）;整合素β3多克隆抗體（abcam公司，貨號：ab119992，批號：79785-2）;白血病抑制因子LIF（abcam公司，貨號：ab113262，批號：74231-1）;酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG聚合物（中杉金橋生物科技有限公司，貨號PV6000，批號1919D0516）;顯微鏡（Olympus公司，型號：BX51）;圖像處理軟件（Media Cybernetics公司，型號：Image-Pro Plus 6.5）。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備?30只雌性SD大鼠隨機(jī)分為2組，正常組（10只）、造模組（20只）。陰道涂片觀察月經(jīng)周期，確保在非動情期開始給藥。造模組大鼠采用羥基脲450 mg/（kg·d）連續(xù)灌胃9 d（約為2個動情周期），當(dāng)大鼠出現(xiàn)進(jìn)食、運(yùn)動減少，體質(zhì)量下降，毛發(fā)枯槁欠光澤以及大便糖稀時，表明腎虛模型成功。隨即造模組大鼠在雙側(cè)宮角處注入95%乙醇0.5 mL，保持宮腔充盈狀態(tài)5 min后，生理鹽水反復(fù)沖洗宮腔后關(guān)腹，構(gòu)造薄型子宮內(nèi)膜大鼠模型。待內(nèi)膜組織取材、固定、HE染色后，顯微鏡下觀察內(nèi)膜組織形態(tài)，確認(rèn)薄型內(nèi)膜模型是否成功。

1.2.2?干預(yù)方法?造模結(jié)束后，造模組隨機(jī)分為模型組，中藥組，每組10只。正常組及模型組給予蒸餾水10 mL/（kg·d）灌胃，中藥組按大鼠體表面積系數(shù)法計算，給予補(bǔ)腎助孕方劑量0.3 mg/（kg·d）灌胃，干預(yù)周期為3個動情周期，約為15 d，觀察陰道涂片，在動情期處死各組大鼠，取血并取出子宮，稱重后部分放入10%中性福爾馬林液中固定，部分-80°C冰箱凍存。

1.3?觀察指標(biāo)與方法

1.3.1?酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定血清E2、P水平?水合氯醛麻醉大鼠，分離一側(cè)頸總動脈，動脈取血5 mL，3 000 r/min，離心半徑8 cm，離心10 min，取上層血清保存于-80 ℃冰箱備用。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測大鼠E2、P的水平。

1.3.2?各組大鼠子宮內(nèi)膜組織學(xué)觀察?宮內(nèi)膜組織在10%的中性福爾馬林液固定36 h，取材，自動脫水機(jī)脫水，浸蠟，石蠟包埋，常規(guī)切片，厚度4 μm，蘇木素-伊紅（HE）染色，在光鏡下觀察宮內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)變化。

1.3.3?測量子宮內(nèi)膜被覆上皮的厚度、子宮內(nèi)膜厚度、子宮間質(zhì)厚度、子宮腺體數(shù)、子宮血管數(shù)?在中倍（×200）下找到子內(nèi)膜被覆上皮最厚的區(qū)域，采用Image-Pro Plus 6.0圖形圖像分析系統(tǒng)測量子宮基底膜到宮腔的垂直距離，每只大鼠計數(shù)5個視野，平均值表示該只大鼠子宮內(nèi)膜被覆上皮的厚度。統(tǒng)計子宮內(nèi)膜腺體及血管數(shù)目，同樣采用中倍下5個視野的平均值方法來操作。

1.3.4?免疫組化法檢測整合素β3及白血病抑制因子的蛋白表達(dá)情況?切厚度4 μm白片，70 ℃烤片1 h，二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，3%的雙氧水避光10 min滅活內(nèi)源性酶，pH值6.0枸櫞酸鹽修復(fù)液高壓熱修復(fù)3 min，在切片上滴加兔抗整合素β3和LIF抗體（濃度均為1∶100），4 ℃冰箱孵育過夜;次日復(fù)溫并PBS水洗后，滴加PV 6000通用型二抗，常溫孵育30 min，PBS水洗后，DAB顯色，在鏡下根據(jù)目標(biāo)蛋白的著色控制反應(yīng)時間，自來水洗終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、封片。兩目標(biāo)蛋白的陽性信號均為胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒，光鏡高倍鏡下（×400）每張切片隨機(jī)取5個視野，用Image-Pro Plus 6.5軟件測定目標(biāo)蛋白在子宮內(nèi)膜上的陽性信號積分光密度（IOD）值。

1.4?統(tǒng)計學(xué)方法?采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?3組大鼠血清內(nèi)性激素水平比較?與空白對照組比較，模型組大鼠血清血清中E2和P明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;中藥組較模型組血清中E2和P明顯升高（P<0.05）;中藥組與空白對照組之間比較，E2和P均為輕度減低。可見補(bǔ)腎助孕方能有效調(diào)節(jié)模型大鼠性激素水平，使得E2和P水平上升。見表1。

2.2?各組大鼠子宮內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)變化?光鏡觀察發(fā)現(xiàn)：正常對照組大鼠子宮內(nèi)膜腺體密集，腺管增生、擴(kuò)張迂曲，上皮細(xì)胞呈高柱狀，管腔內(nèi)可見分泌，間質(zhì)細(xì)胞排列疏松，間質(zhì)細(xì)胞大、水腫，蛻膜樣變，血管增多;模型組大鼠子宮內(nèi)膜腺體稀少，腺腔較直并且狹小，腺上皮細(xì)胞呈立方狀，間質(zhì)細(xì)胞變小變少，血管數(shù)量減少;中藥組大鼠子宮內(nèi)膜腺體增多，腺體較迂曲，管腔擴(kuò)張，分泌物增多，間質(zhì)輕度疏松、水腫，血管輕度增生。見圖1。

2.3?各組大鼠子宮內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)測量?與空白對照組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜厚度、間質(zhì)厚度以及腺體、血管數(shù)目均有明顯的減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;與模型組比較，中藥組在上述指標(biāo)均有不同程度的提升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這些形態(tài)學(xué)指標(biāo)都是屬于衡量子宮內(nèi)膜容受性的“金指標(biāo)”，說明中藥補(bǔ)腎助孕方能夠有效的提高大鼠子宮內(nèi)膜的容受性，發(fā)揮促進(jìn)胚胎種植，增加妊娠機(jī)率的作用。見表2。

2.4?各組大鼠子宮內(nèi)膜整合素β3及白血病抑制因子的表達(dá)?免疫組化結(jié)果表明，各組大鼠子宮內(nèi)膜組織內(nèi)整合素β3及白血病抑制因子均有不同程度的表達(dá)，表達(dá)部位在腺上皮細(xì)胞及部分間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)。組化結(jié)果顯示：與正常對照組比較，模型組2目標(biāo)蛋白表達(dá)水平均呈明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。中藥組較模型組，表達(dá)呈顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。見圖2。

3?討論

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是目前婦科領(lǐng)域備受關(guān)注的疑難病癥之一，本病在我國的發(fā)病率呈增長趨勢。針對目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療本病臨床療效欠佳的難題，發(fā)揮中醫(yī)藥在增加子宮內(nèi)膜厚度改善子宮內(nèi)膜容受性的優(yōu)勢，為臨床提供有效安全的藥物，防止自然流產(chǎn)的反復(fù)發(fā)生是很有意義的。

除了需要發(fā)育良好的胚泡外，容受性高的子宮內(nèi)膜是成功胚胎種植必要條件。正常情況下，子宮內(nèi)膜在雌孕激素的作用下發(fā)生一系列形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，這種變化是與胚泡發(fā)育同步，配合胚泡著床。包括內(nèi)膜增厚，腺體增生、分泌旺盛，間質(zhì)細(xì)胞增多、蛻膜樣變，血液供應(yīng)豐富，構(gòu)成良好的著床微環(huán)境，使胚泡順利著床。反之，若子宮內(nèi)膜發(fā)育較遲緩，出現(xiàn)諸如內(nèi)膜變薄，腺體稀疏，間質(zhì)細(xì)胞小而緊密，血運(yùn)較差等形態(tài)變化時，則胚泡難以著床導(dǎo)致致流產(chǎn)或不孕[8]。由于子宮內(nèi)膜容受性是個動態(tài)的變化過程，盡管與雌激素、孕激素水平的變化密切相關(guān)，但對于子宮內(nèi)膜容受性改變做一準(zhǔn)確評估，目前尚無比較明確、統(tǒng)一的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。有研究者發(fā)現(xiàn)，某些蛋白的表達(dá)高低與子宮內(nèi)膜種植窗時期的狀態(tài)相關(guān)，因而可以被臨床作為預(yù)測子宮內(nèi)膜容受性高低的標(biāo)志分子[9]。其中，最為關(guān)鍵的2個蛋白分子即為整合素β3和白細(xì)胞抑制因子（LIF）。整合素β3屬于細(xì)胞黏附分子，為Ca2+通道跨膜受體，表達(dá)在子宮內(nèi)膜上皮及腺體細(xì)胞膜上，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外信號的傳遞。隨著月經(jīng)周期的改變其表達(dá)出現(xiàn)升降變化，高表達(dá)的時限與“種植窗”的開啟的時間相一致[10]。LIF屬于白細(xì)胞介素6家族分子，是一種分泌型糖蛋白配體，與相應(yīng)的受體結(jié)合后在細(xì)胞生長、增殖和分化中發(fā)揮廣泛的作用[11]。臨床研究發(fā)現(xiàn)：正常LIF的表達(dá)量具有時效性，隨著月經(jīng)周期的變化而變化;處于分泌期的子宮內(nèi)膜LIF的mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)量呈上升趨勢，在晚期時可達(dá)到峰值，而間期的轉(zhuǎn)錄量處于峰底。RSA患者及正常對照的蛻膜測定發(fā)現(xiàn)，前者的的LIFmRNA濃度明顯低于其對照組[12]。有實(shí)驗證明，小鼠在LIF基因敲除后，胚胎種植不能發(fā)生，而將外源性的LIF基因給予敲除小鼠，或者將基因敲除小鼠的胚胎種植在其他正常小鼠，兩者均可使胚胎正常種植[13]。

我們吸納前人“治未病”“預(yù)培其損”觀點(diǎn)，提出“培補(bǔ)養(yǎng)胎之源，孕前干預(yù)”是治療本病的關(guān)鍵，腎精為胚胎的先天之源，若母體稟賦不足，房勞多產(chǎn)，多次胎停育，可傷及沖任、胞宮，從而傷及腎中精氣，使胎失所固，腎虛是發(fā)病之本。同時，脾為胚胎的后天之源，若脾胃虛弱，氣血虧虛，胎失所養(yǎng)。根據(jù)首都國醫(yī)名師蔡連香教授的經(jīng)驗，創(chuàng)制了滋補(bǔ)腎精、益氣健脾的補(bǔ)腎助孕方。藥物組成：君藥：菟絲子：歸肝、腎、脾經(jīng)，補(bǔ)腎益精、養(yǎng)肝明目;太子參：歸脾、肺經(jīng)，補(bǔ)氣，健脾、生津潤肺。臣藥：炙龜甲：歸腎、肝、心經(jīng)，滋陰潛陽、益腎健骨、養(yǎng)血補(bǔ)心;熟地黃：歸肝、腎經(jīng)，補(bǔ)血養(yǎng)陰、填精益髓;續(xù)斷：歸肝、腎經(jīng)，補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋健骨、止血安胎;白術(shù)：歸脾、胃經(jīng)，健脾益氣，益腎固精。佐使藥：當(dāng)歸：歸肝、心、脾經(jīng)，補(bǔ)血調(diào)經(jīng)、活血止痛;陳皮：歸脾、肺經(jīng)，理氣健脾、燥濕化痰。全方共奏：補(bǔ)腎填精，健脾養(yǎng)血。使用該方孕前干預(yù)治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的臨床療效觀察結(jié)果顯示：可以有效改善患者再次妊娠后妊娠結(jié)局，并可提高孕后保胎的成功率，已產(chǎn)胎兒健康[14-15]。

本次研究結(jié)果證實(shí)，補(bǔ)腎助孕方能夠提高腎虛胚胎著床障礙大鼠的子宮內(nèi)膜容受性，從而達(dá)到預(yù)防流產(chǎn)、增加妊娠率的目的。首先對于形態(tài)學(xué)的觀察和測量，發(fā)現(xiàn)模型組表現(xiàn)為大鼠子宮內(nèi)膜腺體稀少，腺腔分泌功能減低，間質(zhì)小而致密，內(nèi)膜薄、腺體數(shù)、血管數(shù)目均減少，都表明內(nèi)膜容受性差，不利于胚胎植入。而在給予助孕方中藥干預(yù)后，鏡下發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜厚度增加，腺體增多，間質(zhì)疏松呈蛻膜樣改變，血管數(shù)目亦增加，說明中藥能明顯通過提高內(nèi)膜容受性，改善種植窗子宮內(nèi)膜，促進(jìn)妊娠的發(fā)生。其次，在機(jī)制研究中我們發(fā)現(xiàn)，模型組中血清中雌二醇、孕酮的水平均顯著下調(diào)，而中藥組有明顯提升，提示二者協(xié)調(diào)表達(dá)可作為子宮內(nèi)膜容受性的客觀標(biāo)志，整合素β3及白血病抑制因子在模型組大鼠子宮內(nèi)膜上的蛋白表達(dá)均下調(diào)，而補(bǔ)腎助孕方能夠顯著，改善子宮內(nèi)膜組織形態(tài)，潛在機(jī)制或與升高整合素β3及白血病抑制因子的蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，補(bǔ)腎助孕增方可以增加腎虛薄型子宮內(nèi)膜大鼠種植窗口期子宮內(nèi)膜組織中整合素β3及白血病抑制因子的表達(dá)，進(jìn)一步改善子宮內(nèi)膜的組織形態(tài)，提升雌孕激素水平表達(dá)。從而通過提高子宮內(nèi)膜容受性，降低流產(chǎn)率，提高妊娠率。

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（2019-10-17收稿?責(zé)任編輯：王明）