微波消解-原子熒光光譜法測定糧食蔬菜類農(nóng)產(chǎn)品中硒的方法優(yōu)化

王書言 馬 明 寇太記 鄧旭先 代紅兵 黃向東

（1. 洛陽市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測中心， 河南洛陽471023； 2. 洛陽市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務中心， 河南洛陽471000； 3. 河南科技大學， 河南洛陽471023； 4. 洛陽市種業(yè)發(fā)展中心， 河南洛陽471023； 5. 洛陽理工學院， 河南洛陽471023)

硒（Se） 具有清除體內(nèi)自由基、 保護羥基不受氧化[1]、 增強人體免疫力、 拮抗重金屬毒性、 抗癌等生物功能[2]， 是谷胱甘肽過氧化物酶的必需組分。硒缺乏是克山病發(fā)病的基本因素， 但硒攝入過量可致中毒[3]。 農(nóng)產(chǎn)品中硒的含量關(guān)系著人體健康， 糧食蔬菜類農(nóng)產(chǎn)品中硒元素的檢測成為研究重點。

硒元素的準確檢測方法有原子吸收光譜法、 原子熒光光譜法、 電感耦合等離子體質(zhì)譜 （ICPMS） 法等。 其中， 氫化物原子熒光光譜 （HGAFS） 法測定硒具有靈敏度高、 譜線簡單、 校正曲線線性范圍寬、 分析速度快等優(yōu)點[4]。 硒屬于揮發(fā)性非金屬元素， 前處理方法有濕消化法、 微波消解法。 微波能使離子間發(fā)生局部的內(nèi)加熱， 并引起酸和試樣更有效的接觸， 從而使樣品迅速被溶解[5]。

目前， 檢測食品中硒所依據(jù)的方法標準有GB 5009.93-2017 《食品安全國家標準 食品中硒的測定》（第一法為HG-AFS 法）[6]、 GB 5009.268-2016 《食品安全國家標準 食品中多元素的測定》（第一法為ICP-MS 法）[7]。 ICP-MS 設備昂貴， 耗材試劑等使用成本高， 很多基層檢測中心不具備條件， 而HG-AFS 法因其價廉而應用廣泛。 HGAFS 國家標準方法（以下簡稱國標法） 步驟多， 且加入鐵氰化鉀， 與酸接觸生成劇毒氣體[8]。 石文偉等[8]在測定食品中硒元素的方法研究中， 改進了國標法， 消解液中未加入鐵氰化鉀， 消除了液相干擾，使用電熱板濕法消解。 本研究結(jié)合已有研究成果，在國標法的基礎上， 進行優(yōu)化試驗， 探討在糧食蔬菜類農(nóng)產(chǎn)品中干擾元素含量不高的情況下， 不加鐵氰化鉀而用其他方法消除液相干擾的可行性， 驗證檢測結(jié)果的準確度是否滿足要求， 旨在為糧食蔬菜類農(nóng)產(chǎn)品中硒元素測定提供更有力的技術(shù)支撐。

一、 材料與方法

（一） 主要儀器設備 MARS Xpress 微波消解系統(tǒng) （美國CEM 公司）； AFS-933 型雙道原子熒光光譜儀 （北京吉天儀器有限公司）； EDH-40 型恒溫加熱器（北京東航科儀儀器有限公司）。

（二） 試劑和標準物質(zhì) 硒標準工作液： 用1 000 mg/L 硒標準貯備液 （中國計量科學研究院）逐級稀釋得到。 試驗用水均為去離子水。 試驗用鹽酸 （HCl）、 硝酸 （HNO3）、 過氧化氫 （H2O2）、 高氯酸 （HClO4）、 氫氧化鉀 （KOH）、 硼氫化鉀（KBH4） 均為優(yōu)級純。 生物成分分析標準物質(zhì)： 小麥GBW10011（GSB-2）、 玉米GBW10012 （GSB-3）、 圓 白 菜GBW10014 （GSB-5）、 黃 芪GBW 10028 （GSB-19）、 湖南大米GBW10045 （GSB-23）、 河南小麥GBW10046 （GSB-24）， 均購于中國地質(zhì)科學院地球物理地球化學勘查研究所。

（三） 試驗方法

1. 樣品消解及制備。 準確稱取糧食類干樣0.2～0.5 g、 蔬菜類濕樣2～3 g （必要時可烘干），精確至0.000 1 g， 置于聚四氟乙烯（PTFE）微波消解罐中， 加入6.0 mL HNO3、 2.0 mL H2O2， 加蓋擰緊至合適的松緊度 （松緊度影響罐內(nèi)消解壓力）[9]，放置過夜。 將消解罐放入微波消解系統(tǒng)中， 按表1的工作程序進行消解。 消解結(jié)束后放入多孔加熱器中， 120℃趕酸至約余1 mL。 再加入5 mL 濃HCl，加熱還原30 min。 用去離子水將溶液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中， 加水沖洗消解罐內(nèi)壁3～4 次， 定容，靜置， 準備上機測試。 同時做全程空白試驗。

表1 微波消解程序

本方法與國標法相比較， 改進了5 點。 （1） 調(diào)節(jié)用酸體系。 改 “加入10.0 mL HNO3、 2.0 mL H2O2” 為 “加入6.0 mL HNO3、 2.0 mL H2O2”。 減低HNO3用量， 可以減少殘留氮氧化物的干擾。 硝酸反應方程式為3C+4HNO3→3CO2↑+4NO↑+2H2O，NO 等對HG-AFS 法測定硒存在明顯的干擾[10]。H2O2的氧化比率高， 同體積的H2O2可氧化較多的有機物， 且H2O2的高純試劑更容易得到， 氧化終止后， 只余下陽離子氫。 在HNO3中加入H2O2可減少酸用量， 從而減少雜質(zhì)干擾， 降低試劑空白。調(diào)整HNO3和H2O2的體積比例至3∶1， 可減少HNO3用量， 減少NO 干擾， 充分利用H2O2的優(yōu)勢。 （2） 改變趕酸裝置。 改 “消解結(jié)束待冷卻后，將消化液轉(zhuǎn)入錐形瓶中， 加幾粒玻璃珠， 在電熱板上繼續(xù)加熱至近干， 切不可蒸干[6]”為“消解結(jié)束后放入多孔加熱器中， 120℃趕酸至約余1 mL”。 消解結(jié)束后， 直接在罐內(nèi)加熱趕酸， 減少了等待和轉(zhuǎn)移步驟， 使試驗操作更加簡便， 且降低了轉(zhuǎn)移損失或引入雜質(zhì)干擾的風險。 120℃精確控溫趕酸至約余1 mL 可減小蒸干的風險 （硝酸的恒沸點是120℃， 屬低沸點酸， 消化完畢后易于驅(qū)除多余的硝酸）， 降低對“近干” 把握的經(jīng)驗要求。（3） 改變還原用酸濃度。 改“再加5 mL HCl 溶液（6 mol/L），繼續(xù)加熱至溶液變?yōu)榍辶翢o色并伴有白煙出現(xiàn)[6]”為“再加入5 mL濃HCl， 加熱還原30 min”。 直接使用濃HCl， 省去HCl 溶液 （6 mol/L） 的配置過程。 增加HCl 濃度 （HCl 是弱還原性酸， 其中Cl-具有一定絡合能力， 經(jīng)常和其他酸混合使用， 最常見的是王水）， 消耗氧化性酸， 充分將六價硒全部還原成四價硒， 且樣品待測液在HCl 環(huán)境， 與載流［6%（V/V） HCl］ 相同， 有利于硒的檢測。 試驗確定加熱還原時間為30 min， 減少觀察溶液加熱至“清亮、 產(chǎn)生白煙” 的步驟。 （4） 適當加大定容體積。 將溶液移入25 mL 容量瓶中， 便于操作， 降低干擾雜質(zhì)濃度。 （5） 不加鐵氰化鉀。 刪除“加入2.5 mL 鐵氰化鉀溶液” 的步驟， 人體吸入、 攝入或經(jīng)皮膚吸收鐵氰化鉀都有可能對身體造成傷害，不加鐵氰化鉀可增加試驗安全性。 同時和汞砷的檢測方法 （其國家標準方法中不加鐵氰化鉀） 統(tǒng)一，為實現(xiàn)硒汞砷等元素的同時檢測提供可行性。

2. 儀器條件。 原子熒光光譜儀工作條件： 載流為6%（V/V） 鹽酸， 還原劑為0.8%（m/V） KBH4+0.5%（m/V） KOH； 硒燈電流90 mA； 光電倍增管負高壓290 V； 原子化器高度8 mm； 原子化器溫度200 ℃； 載氣流量400 mL/min； 屏蔽氣流量800 mL/min； 采用順序注射泵進樣。

本方法在國標法的基礎上對燈電流、 光電倍增管負高壓、 原子化器高度等作了優(yōu)化。（1） 燈電流。在一定范圍內(nèi)， 燈電流增加， 熒光強度增大。 燈電流過低不穩(wěn)定， 過高噪聲增加。 不同元素燈的燈電流與熒光強度的關(guān)系不盡相同， 從測定靈敏度、 穩(wěn)定性和燈使用壽命綜合等方面考慮， 選擇硒燈電流90 mA， 在該條件下可以得到很好的線性和靈敏度。 （2） 光電倍增管負高壓。 負高壓指加于光電倍增管兩端的電壓。 光電倍增管和打拿極是放大檢測設備。 負高壓大， 靈敏度高， 暗電流等噪聲增大[11]。據(jù)已有研究， 當光電倍增管負高壓在200～500 V之間時， 光電倍增管的信號噪聲比是恒定的[12]。 在滿足分析要求的前提下， 盡量不要將光電倍增管的負高壓設置太高。 綜合考慮靈敏度和使用壽命， 本方法采用負高壓290 V。 （3） 原子化器高度。 原子化器高度是指原子化器頂端到透鏡中心水平線的垂直距離， 其一定程度上決定了激發(fā)光源照射在氬氫火焰的位置。 原子化器高度影響氬氫火焰位置， 與原子化率和背景值有關(guān)， 影響檢測靈敏度及重現(xiàn)性。 通過試驗比較， 本方法采用原子化器高度8 mm。 （4） 原子化器溫度。 原子化器溫度是指石英爐芯內(nèi)的預加熱溫度， 預加熱可以提高原子化效率。 本方法采用原子化器溫度200℃。 （5） 載氣和屏蔽氣流量。 載氣流量小， 火焰不穩(wěn)， 且流速過低時難以迅速將氫化物帶入石英爐； 流量大， 火焰可能被沖斷， 且會稀釋原子蒸氣。 屏蔽氣流量小， 火焰肥大； 過大， 火焰細長。 同時， 氣流量影響信號穩(wěn)定性和靈敏度。 本方法采用載氣流量400 mL/min， 屏蔽氣流量800 mL/min。 試驗表明， 該條件可滿足試樣測定要求。 （6） KBH4濃度。 硒需要生成硒化氫（SeH2） 氣體才能被載氣帶入原子化器， KBH4的用量影響氫化物的生成過程和氬氫火焰的質(zhì)量， 濃度過低還原不充分， SeH2不能全部生成并帶入原子化器； 濃度過高稀釋SeH2濃度。栗晹?shù)萚13]發(fā)現(xiàn)KBH4濃度在10～12 g/L 之間時， 硒熒光強度達到最高點且比較穩(wěn)定； 當KBH4濃度＞12 g/L 時熒光強度反而減弱， 重現(xiàn)性變差。 考慮到高酸度低KBH4濃度下， 可以消除反應產(chǎn)生的大量氫氣對氫化物的稀釋， 并能降低液相干擾， 因此本方法選用0.8%（m/V）KBH4。 試驗表明， 該條件下熒光強度穩(wěn)定且干擾影響小。（7） 載流種類及酸度。載流種類及酸度影響熒光強度。 選擇還原性HCl作為硒檢測中氫化物發(fā)生的介質(zhì)有利于SeH2的生成。 較大酸度可溶解還原出的細小沉淀物， 且可影響還原反應的電位。 但如果酸度過高， 將與還原劑劇烈反應， 產(chǎn)生過量的氫氣， 影響SeH2的濃度，導致結(jié)果偏低。 已有研究顯示， HCl 濃度在5%～20%范圍時， 熒光強度隨酸度增加而增加， 超過20%時熒光強度變化不大[14]。 綜合考慮檢測靈敏度與信噪比， 本方法選用6%（V/V） HCl 作為載流。

二、 結(jié)果與分析

（一） 微波消解條件的優(yōu)化

1. 樣品稱樣量。 稱樣量過大使消解反應劇烈，且容易消解不完全， 或?qū)е聶z測液濃度過高； 稱樣量過小， 試劑等基體雜質(zhì)干擾較大， 檢測準確度在待測物含量低時較差。 本研究綜合考慮硒含量、 稀釋定容體積及檢測靈敏度等因素， 選擇糧食類農(nóng)產(chǎn)品干樣稱樣量為0.2～0.5 g， 蔬菜類農(nóng)產(chǎn)品濕樣稱樣量為2～3 g （必要時烘干）。

2. 消解用酸體系及用量。 消解用酸體系及用量對于檢測精密度和準確度影響較大， 需要充分考慮和優(yōu)化。 HNO3是一種氧化性酸， 常用來破壞有機物質(zhì)、 分解金屬化合物； HCl 是弱還原性酸；H2O2是氧化效率高的易得高純試劑； HClO4是氧化性較強的酸。 微波消解通常使用混合酸， 這種混合酸的組合必須根據(jù)樣品基體的化學性質(zhì)加以選定。不但要考慮是否能消解完全， 還要考慮是否帶入雜質(zhì)及反應產(chǎn)物是否存在干擾。

GB 5009.93-2017[6]采用10 mL HNO3+2 mL H2O2消 解； GB 5009.268-2016[7]采 用5～10 mL HNO3消解； 劉俐君等[1]采用8 mL HNO3微波消解；石文偉等[8]采用10 mL HNO3+HClO4（9∶1，V/V）濕法消解； 王張民[15]采用1 mL HNO3+2 mL H2O2預加熱， 5 mL HNO3微波消解。 本研究比較了反王水（HNO3+HCl， 3∶1，V/V）、 HNO3+H2O2、 HNO3+H2O2+HClO4、 HNO3等消解體系對糧食蔬菜類農(nóng)產(chǎn)品中硒檢測的影響， 試驗結(jié)果表明， 采用6 mL HNO3+2 mL H2O2微波消解樣品時， 可消解完全，試劑空白含量低。

消解趕酸后， 加入HCl 加熱還原六價硒為四價硒。 GB 5009.93-2017[6]采用“再加5 mL HCl 溶液 （6 mol/L）， 繼續(xù)加熱至溶液變?yōu)榍辶翢o色并伴有白煙出現(xiàn)” 的方法； 王正等[16]采用 “加入5 mL 50%鹽酸還原， 設置100℃加熱1 h” 的方法； 郝江山[17]采取加入4.0 mL HCl， 繼續(xù)加熱約2 min，以完全將六價硒還原成四價硒。 考慮到消解液中硒以無機鹽形態(tài)存在， 并考慮基體干擾， 本研究選擇加入5 mL 濃HCl， 加熱還原30 min。

3. 微波消解溫度及時間。 設計得當?shù)南夥ㄊ潜M量在最低溫度下， 較快分解基體中主要有機組分。 有機樣品的分解溫度從140～180℃不等[18]。以HNO3為消解液， 淀粉類樣品分解溫度在140℃，蛋白質(zhì)類樣品分解溫度在145～150℃， 糖類樣品分解溫度在150℃， 脂肪類樣品分解溫度在160～165℃。 本研究消解有機干樣采用程序升溫模式，分4 步消解 （見表1）。 試驗表明， 針對小麥等以含淀粉、 糖類為主要成分的糧食蔬菜類農(nóng)產(chǎn)品干樣， 可以消解完全且硒含量不損失。

（二） 方法學驗證

1. 標準曲線及線性范圍。 以熒光強度 （y） 為縱坐標， 以硒標準溶液質(zhì)量濃度 （x） 為橫坐標繪制標準曲線（見圖1）。 如圖1 所示， 硒在0～30 μg/L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好， 回歸方程為y＝74.274x-16.148， 相關(guān)系數(shù) （R2） 為0.999 8。國標法與本方法相比， 空白高、 截距大。

圖1 Se 元素測定標準曲線

2. 檢出限及定量限。 對試劑空白溶液連續(xù)測定11 次， 得到11 次測定數(shù)據(jù)的標準偏差為0.76，根據(jù)公式 “DL＝3×SD/k（DL 為檢出限， SD 為空白溶液熒光值的標準偏差，k為標準曲線的斜率）”， 求得儀器檢出限為0.031 μg/L。 當稱樣量為0.2 g 時， 定容體積為25 mL， 方法檢出限為0.003 9 mg/kg， 定量限為0.012 mg/kg。 當稱樣量為1 g 時，定容體積為10 mL， 國標法的檢出限為0.002 mg/kg， 定量限為0.006 mg/kg[6]。 換算至與本方法同樣的稱樣量和定容體積， 國標法的檢出限為0.025 mg/kg， 定量限為0.075 mg/kg。 本方法檢出限低于國標法。

3. 準確度和精密度。 使用本方法對小麥、 玉米、 圓白菜、 黃芪、 湖南大米和河南小麥生物成分分析標準物質(zhì)進行連續(xù)測定。 測定結(jié)果均在標準物質(zhì)認定值的不確定度范圍內(nèi)， 準確度較好， 相對標準偏差（RSD）均在5%以內(nèi)， 精密度良好（見表2）。

表2 生物成分分析標準物質(zhì)中硒含量測定結(jié)果

（三） 干擾試驗

1. 不加鐵氰化鉀干擾掩蔽劑對比試驗。 分別使用本方法（不加鐵氰化鉀） 和國標法（消解加熱還原結(jié)束后加入6 mL 的100 g/L 鐵氰化鉀溶液定容至25 mL）， 用小麥、 玉米和河南小麥生物成分分析標準物質(zhì)做對比試驗， 結(jié)果見表3。 結(jié)果顯示， 兩種方法的測定結(jié)果RSD 均小于5%， 而且測定值均在認定值的不確定度范圍內(nèi)。 該結(jié)果表明， 通過調(diào)節(jié)酸度等方式可消除干擾， 方法可行。

表3 本方法與國標法硒含量測定結(jié)果比較

2. 共存離子干擾試驗。 配制未加干擾離子的10 μg/L 硒標準溶液及試劑空白， 同時配制添加干擾離子的10 μg/L 硒標準溶液及試劑空白， 添加濃度為Pb、 Cd、 Cr、 Hg、 As 各600 μg/L， Cu、 Mn、Ni 各320 μg/L， Zn 3 000 μg/L， Fe 6 000 μg/L， 檢測數(shù)據(jù)見表4。 結(jié)果顯示， 添加與未加干擾離子的測定結(jié)果相對偏差為2.1%， 在允許誤差范圍內(nèi)。從硒標準溶液譜圖 （見圖2） 看， 添加與未加干擾離子的硒標準溶液譜圖峰形良好， 其中添加干擾離子對應譜圖的峰稍低， 峰面積小， 熒光值小。 試驗結(jié)果表明， 下列離子共存時不干擾硒的測定（濃度倍數(shù)）： Pb、 Cd、 Cr、 Hg、 As （60）， Cu、 Mn、 Ni（32）， Zn （300）， Fe （600）。

圖2 未加干擾離子 （A） 與添加干擾離子 （B） 的硒標準溶液譜圖

圖3 還原用濃HCl 用量對硒檢測結(jié)果的影響

表4 共存離子干擾試驗結(jié)果比較

3. 還原用濃HCl 用量試驗。 以河南小麥生物成分分析標準物質(zhì)作試驗樣品， 經(jīng)消解趕酸后， 分別考察了加入不同用量 （0、 1、 2、 5、 10 mL） 的濃HCl 加熱還原對檢測結(jié)果的影響。 結(jié)果顯示，濃HCl 加入量達到2 mL 及以上時， 硒測定值結(jié)果趨于穩(wěn)定， 考慮到較大用量濃HCl 對消除干擾有利， 但太大用量容易引入試劑雜質(zhì)， 故選用5 mL。

（四） 實際樣品測定 對抽取的基地糧食蔬菜類農(nóng)產(chǎn)品樣品， 使用本方法檢測， 結(jié)果見表5。 結(jié)果顯示， 本方法的測定結(jié)果相對偏差均在10%以內(nèi)， 精密度滿足GB 5009.93-2017[6]中“在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的20%”的要求， 表明本方法可以應用于實際糧食蔬菜類農(nóng)產(chǎn)品鮮樣和干樣中硒的測定。

表5 糧食蔬菜類農(nóng)產(chǎn)品樣品硒含量測定結(jié)果

三、 結(jié)論

本研究通過理論分析和試驗研究， 對測定硒的國標法 （GB 5009.93-2017 中第一法——HGAFS 法） 進行了改進。 針對糧食蔬菜類農(nóng)產(chǎn)品中硒的測定， 采取增加酸度 （載液）、 降低硼氫化鉀濃度、 改變干擾元素的價態(tài) （加入過量濃HCl 加熱還原六價硒為四價硒） 和順序注射泵進樣等措施，舍棄了加入鐵氰化鉀掩蔽劑的操作， 有效克服了糧食蔬菜類農(nóng)產(chǎn)品中鐵、 銅、 鎳等元素的干擾， 且在檢測中不增加步驟、 不添加新的試劑， 操作簡單，降低空白。 本方法在0～30 μg/L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2為0.999 8， 方法檢出限為0.003 9 mg/kg， 定量限為0.012 mg/kg。 使用本方法測定小麥、 玉米等6 種生物成分分析標準物質(zhì)， 其測定值均在認定值的不確定度范圍內(nèi)， RSD 均在5%以內(nèi)。 應用本方法檢測小麥、 白菜等實際樣品， 測定結(jié)果的相對偏差均在10%以內(nèi)。

綜上所述， 本方法的準確度和精密度滿足要求， 且具有更好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性， 操作過程簡便安全， 適用于糧食蔬菜類農(nóng)產(chǎn)品中硒的測定。 不加鐵氰化鉀， 可對研究農(nóng)產(chǎn)品中硒汞砷同時檢測提供有益參考。