泛素特異性蛋白酶7研究進展

曾頔 陳小菊

川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科,南充637000

泛素-蛋白酶途徑 (ubiquitin-protease pathway,UPP)是一個常見的多步驟反應的蛋白翻譯后修飾過程,有多種不同蛋白質參與,含有蛋白酶體、 去泛素化酶(deubiquitinase,DUB)、泛素 (Ub)、泛素激活酶 (E1)、泛素結合酶 (E2)及泛素蛋白連接酶 (E3)6個關鍵的組分,可分為泛素化和去泛素化2個可相互轉換過程,該途徑參與調控了包括信號轉導、DNA 損傷修復、蛋白質分解合成、炎癥及免疫等在內的幾乎所有生命過程的調控,因此UPP正確表達對正常細胞功能尤為重要。泛素大部分存在于真核生物中,是由76個氨基酸組成的小分子蛋白。在各級酶的作用下對目標的蛋白進行針對性的翻譯后修飾過程稱為泛素化 (圖1[1])。一開始由泛素激活酶在ATP 幫助下將第一個泛素分子腺苷酸化,隨即將泛素轉移至泛素激活酶活性中心的半胱氨酸殘基上,緊跟隨著第二個泛素分子的腺苷酸化,已經活化的第一個泛素分子接著被轉移到泛素結合酶的半胱氨酸殘基上形成E2-Ub;最后一步,高度保守的泛素蛋白連接酶高度識別被泛素化的靶蛋白,同時與E2-Ub相互作用,促成泛素分子從泛素結合酶上遷移到靶蛋白上,進而形成單聚或多聚的泛素分子,結果就是介導靶蛋白被26S 蛋白酶體降解,而去泛素化則是DUBs通過催化作用與泛素羧基末端的異肽鍵等結合來抵消泛素蛋白連接酶的活性,從目標蛋白質上裂解泛素或泛素類似蛋白,達到逆轉泛素化的過程。泛素化和去泛素化必須及時、協(xié)調地發(fā)生,以維持細胞生命活動的最佳狀態(tài)。

100多種基因編碼了人類的DUB基因,目前發(fā)現(xiàn)DUB主要有馬查多-約瑟夫病蛋白域蛋白、卵巢腫瘤蛋白酶、JAMM/MPN 域相關的金屬肽酶、泛素C 末端水解酶、泛素特異性蛋白酶 (ubiquitin-specific protease,USP)和近期發(fā)現(xiàn)的單核細胞趨化蛋白誘導的蛋白六類 (圖2[2]),或者簡單分為半胱氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶兩大類。絕大部分的DUB存在催化結構域、泛素結合結構域和異種蛋白間互相作用結構域,故其不僅對底物的選擇存在特異性,對泛素鏈亦然,以此來達到對目標蛋白有序、精準調控的目的。它們可進行泛素前體的加工,在泛素化時對泛素鏈進行編輯、回收泛素分子,以及逆轉泛素結合;鑒于其在生物體的關鍵作用,若出現(xiàn)畸變會引起臨床多種疾病[3],故DUB的生物活性是被基因表達的轉錄、翻譯后修飾等方式嚴格調控的[4]。迄今為止,DUB最大系列就是屬于半胱氨酸蛋白酶類的USP家族,在人體中它包含有50多個成員,并且有證據顯示其在人體各組織中廣泛分布,其中USP7是目前研究最多的成員之一,具有多種調控細胞周期、DNA 修復、蛋白質合成降解、參與基因表達、細胞凋亡等生物學功能,現(xiàn)在將其結構功能及研究進展進行綜述。

圖1 泛素化的過程[1]

1 USP7的結構與功能

1.1 USP7結構 USP7也稱為皰疹病毒相關泛素特異性蛋白酶,得名于1997年發(fā)現(xiàn)其可與單純皰疹病毒早期蛋白作用,從而促進病毒生長[5]。USP7共有1 102個氨基酸殘基,相對分子質量為135 000,其基因定位于人體中16p13.2,總長為4 013 bp。目前發(fā)現(xiàn)人體內存在USP7 m RNA 的廣泛表達,且在男性睪丸中表達水平最高[6]。

USP7共含有3種結構域 (圖2),包括氨基末端的腫瘤壞死因子受體相關因子 (tumor necrosis factor receptor associated factor,TRAF)域、作為催化中心的高度保守USP域和包含5 個羧基末端泛素樣結構域,即UBL1-5。其中TRAF區(qū)域和UBL域是USP7識別各種蛋白并與之結合的重要部位。TRAF域主要功能是直接與底物蛋白如腫瘤抑制基因p53、鼠雙微粒體2 (murine double minute 2,MDM2)蛋白等相結合;c域的變構調節(jié)則被認為是加強USP7催化活性的關鍵[7]。它含有2個泛素連接酶和5 個UBL,2個泛素連接酶能與泛素相互作用;5個UBL 中的UBL4/5是直接活化USP7 酶活性的關鍵區(qū)域,而UBL1、UBL2和UBL3 對USP7 的活化起間接作用,是通過與GMP合成酶結合引起一系列反應。DUB 的催化核心結構域位于TRAF樣和UBL 結構域之間,它采用類似于由手指、手掌和拇指組成右手的所有USP 酶折疊的特征,C223、h464和D481形成了該酶的催化三聯(lián)體,它們位于被稱為Thumb和Palm 的2個蛋白質區(qū)域之間的縫隙中,核心區(qū)域的功能是結合泛素并切割泛素和底物之間的異肽鍵,但通常狀態(tài)下三聯(lián)體殘基相距甚遠,不具有催化活性,可同泛素結合誘導變構調節(jié)后執(zhí)行其蛋白酶活性功能[8]。

圖2 USP7的結構域[2]

1.2 USP7的生物學功能 截至目前已發(fā)現(xiàn)USP7的許多功能,且在不同環(huán)境中變得越來越復雜,這取決于其豐富的底物庫,已確定泛素化底物包括抑癌基因p53、MDM2、磷酸酶和肌腱蛋白同源物、核轉錄因子κB (nuclear factor-κB,NF-κB)、炎性小體等?，F(xiàn)有的多種研究已證實USP7的過度表達通過調節(jié)不同的底物在細胞DNA 損傷修復、病毒蛋白復制降解、神經系統(tǒng)疾病調控、機體免疫應答、腫瘤相關信號通路的調節(jié)及炎癥疾病轉歸等方面發(fā)揮著關鍵作用[9-11]。

1.2.1 USP7與細胞 眾多研究表明在細胞生存凋亡、細胞周期及染色體重組過程中,USP7 可調控DNA 甲基化、DNA 復制、DNA 損傷修復等過程中多種關鍵蛋白的表達水平以此調節(jié)細胞功能。USP7 可響應氧化應激從而與叉頭轉錄因子4相互作用并使其去泛素化,而FOXO 轉錄因子則是細胞代謝、細胞周期進程及細胞死亡的重要調節(jié)劑。Lecona等[12]證明USP7 作為一種復制異構相關的DUB,可通過抑制DNA 復制時泛素化,使DNA 復制功能相對活躍。Czech-Sioli 等[10]研 究 發(fā) 現(xiàn) USP7 TRAF 域 可 與MCPy V LT 的N 和C末端區(qū)域結合,以此增加LT 對復制起點的結合親和力,對病毒DNA 的復制起到負向調控的作用。Peng等[13]通過使用P5091對USP7的抑制作用可促進Polo樣蛋白激酶1蛋白質降解誘導細胞凋亡及細胞周期G2/M 停滯,從而誘導細胞有絲分裂中染色體錯位。

1.2.2 USP7與信號通路

1.2.2.1 p53 信號通路 50%以上人類的惡性腫瘤存在p53基因突變,在正常狀態(tài)下p53 是一種半衰期短、穩(wěn)定性欠佳的蛋白,包括泛素化在內的翻譯后修飾調節(jié)其降解,MDM2則是針對p53的E3-連接酶,可負調控調節(jié)p53活性,USP7可致MDM2去泛素化,使其細胞內的表達水平增加,進而導致細胞內p53 水平下降,則細胞正常衰老、凋亡平衡被打破,惡性腫瘤產生的概率就會大大提高。Sun等[14]證實WDR79 可與USP7 相互作用調節(jié)MDM2、p53穩(wěn)定性來促進非小細胞肺癌 (non-small cell lung cancer,NSCLC)細胞增殖。

1.2.2.2 NLRP3炎性體通路 NLRP3炎性體的信號通路激活參與多種嚴重的慢性炎癥性疾病,炎癥的慢性化與癌癥、阿爾茨海默癥等關系匪淺。主要開始于細胞內外的刺激產生細胞外信號因子與細胞膜上的受體結合,包括NF-κB在內級聯(lián)信號被激活,觸發(fā)細胞信號開啟一系列下游的反應,由不同刺激觸發(fā)的多蛋白復合物組裝信號介導的炎癥相關半胱氨酸天冬氨酸特異蛋白酶活化以及IL-1β、IL-18等促進炎因子的成熟。最近的一項Palazon-Riquelme等[15]研究表明通過在巨噬細胞中抑制USP7和USP47可減少ASC寡聚和斑點化來阻止炎性小體的形成與激活,該過程獨立于啟動信號,從而使得炎癥反應被削弱,因此USP7在NLRP3炎性小體通路中的去泛素化作用對炎癥疾病的價值值得進一步研究,對臨床治療炎癥疾病,如COPD、肺結核、肺炎等都有積極臨床意義。

1.2.2.3 NF-κB信號通路 NF-κB 是一種核內轉錄因子,靜息狀態(tài)下存在于細胞質,激活后進入細胞核啟動炎性靶基因的轉錄如IL、腫瘤壞死因子等介導免疫、炎癥、細胞凋亡、生長和增殖等過程的信息傳遞,目前已確定其激活轉錄受到了UPP 調節(jié)。泛素觸發(fā)蛋白酶體降解限制了NF-κB及下游炎癥因子表達,USP7可對抗E3活性,并與NF-κB的亞基相互作用,穩(wěn)定并促進NF-κB介導的轉錄過程,使用USP7抑制劑P22077 可增加NF-κB 的泛素化和降解,阻止TOLL樣受體誘導的其下游相關促炎細胞因子釋放,為減輕或控制炎癥提出了新策略,雖然其具體機制仍有待繼續(xù)深入研究。

2 USP7相關疾病及關系研究

2.1 病毒復制 除了許多細胞過程外,USP7在病毒感染中也起一定作用。USP7 最初因可與單純皰疹病毒基因表達激活劑ICPO 強烈作用而被發(fā)現(xiàn),它可調控ICPO 的泛素化讓其在機體更為穩(wěn)定[5]。在逐漸深入的研究中發(fā)現(xiàn)USP7除皰疹病毒外,對Epstein-Barr病毒、埃博拉病毒、人巨細胞病毒、腺病毒及人類免疫缺陷病毒等病毒復制均有影響,例如其與Epstein-Barr病毒的核抗原1蛋白親和力更強而破壞USP7與p53作用,從而對Epstein-Barr病毒致癌起輔助作用[16]。在針對人類免疫缺陷病毒泛素相關研究中發(fā)現(xiàn),USP7抑制劑P22077可協(xié)同蛋白酶體抑制劑誘導多聚泛素化蛋白累積來協(xié)助降低人類免疫缺陷病毒復制能力,共同抵抗逆轉錄病毒活性[17]。近期一項研究表明埃博拉病毒可利用泛素或類似物增強復制能力防御宿主自身免疫能力,在其中起關鍵作用的就是病毒基質蛋白VP24蛋白,而USP7介導的VP24 蛋白去泛素化可干擾病毒蛋白引起的免疫應答[18]。USP7與各種病毒蛋白增殖期與潛伏期的相互作用,突現(xiàn)其在宿主-病毒關系之間重要性,對尋找新的抗病毒方案也許是一個機會。

2.2 腫瘤 在過去十多年里,USP7的多種作用中研究最多的就是腫瘤。在前列腺癌、肝細胞癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、白血病及骨髓增生異常綜合征等疾病中,多項研究發(fā)現(xiàn)常存在USP7過度表達的問題,且與預后不良存在一定相關性。

2.2.1 乳腺癌 組蛋白去甲基化酶PHF8屬于組蛋白去甲基化家族成員之一,參與腫瘤發(fā)生進展和神經系統(tǒng)發(fā)育等多種病理生理過程。目前Wang等[19]研究發(fā)現(xiàn)USP7可與PHE8相互作用,并通過自身去泛素化酶活性來去除PHE8上多聚泛素鏈,從而穩(wěn)定PHF8并上調細胞周期蛋白A2表達。此外,調查還發(fā)現(xiàn)USP7的表達量與組蛋白甲基化轉移酶EZH2的活性呈正相關,而高表達的EZH2與乳腺癌的惡性進展及預后不良息息相關。上述種種表明功能活躍的USP7對乳腺癌發(fā)生發(fā)展相當重要。

2.2.2 肺癌 肺癌是目前人類癌癥相關死亡主要原因之一。根據生物學特征可分為NSCLC 和小細胞肺癌兩大類型,其中NSCLC占所有肺癌類型的絕大部分,故USP7與肺癌相關性研究以NSCLC 為主。有研究表明Ki-67 抗原(Ki-67)是評估NSCLC細胞增殖的最可靠的免疫組織化學標記,USP7沉默的細胞中Ki-67的泛素化水平急劇增加,在體內外均可觀察到腫瘤細胞生長速度明顯減緩。在對非吸煙肺腺癌患者中新的致病基因融合CCDC6-RET 的研究中發(fā)現(xiàn),USP7在細胞周期中可調節(jié)CCDC6的轉化,通過對USP7的抑制可下調腫瘤抑制因子促凋亡蛋白CCDC6,可使得腫瘤細胞對化療藥物敏感性增加。研究最多的還是p53途徑,Zhao等[20]發(fā)現(xiàn)肺鱗癌及大細胞癌內均存在高水平的USP7,它可以通過MDM2負調控p53水平來介導細胞凋亡,且可誘導上皮-間質轉換以此增強細胞侵襲能力,在腫瘤侵襲及轉移中起重要的作用。

2.2.3 血液系統(tǒng)腫瘤等 USP7與腫瘤相關性不僅僅局限于p53,還包括FOXO、人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因等。Agathanggelou等[21]發(fā)現(xiàn)在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中,USP7 可調節(jié)慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)細胞中的同源重組修復,通過抑制USP7可引起CLL 細胞DNA 損傷累積和CLL細胞死亡,而與p53無關。目前以UPP為導向藥物研究已經進行甚久,針對蛋白酶體抑制劑硼替佐米也早已用于臨床多發(fā)性骨髓瘤及套細胞淋巴瘤的治療。因此,針對USP7相關諸多研究提示若可通過對USP7抑制治療可能是臨床腫瘤治療的新靶點,對于臨床治療癌癥可能是一條新的道路[22]。

2.3 神經系統(tǒng)病變 雖然眾多研究明確指出USP7功能活躍對于癌癥的發(fā)生發(fā)展有利,但是通過基因敲除USP7的方式引起p53水平增加,反而會促進細胞凋亡,從而使得機體神經元平衡失調、功能失衡和新生兒致死性[23]。USP7是MAGE-L2-TRIM27 連接酶復合物的關鍵組成部分,通過阻止TRIM27自身泛素化,促進激動蛋白成核促進因子泛素化,保持機體內纖維狀肌動蛋白及穩(wěn)態(tài)的平衡[11],已發(fā)現(xiàn)USP7 單倍體功能不足而引起多種神經疾病,如發(fā)育緩慢、智力殘疾、肌張力下降、自閉、癲癇發(fā)作和性腺功能減退等,與沙夫-楊綜合征和普拉德-威利綜合征非常相似[24]。

2.4 炎癥 隨著研究深入,USP7對炎癥的作用也開始逐漸浮現(xiàn)。NF-κB和NLRP3 都是機體控制炎癥反應、免疫應答等關鍵生物過程的主要調節(jié)劑,機體受感染后可激活相關信號通路,通過介導細胞因子作用來抵御清除入侵的病原菌,而NF-κB 和NLRP3 的轉錄活性受到包括USP7在內的轉錄后泛素化調控[25]。USP7可抑制NF-κB 信號通路中關鍵分子NF-κB必需調節(jié)蛋白的多聚泛素化,從而負向調控NF-κB活性[26],但對USP7酶活性阻斷可引起p65泛素化及蛋白酶體降解急劇增多,也可以抑制NF-κB 活性[25]。近期研究表明炎癥小體的組裝也受到泛素的調節(jié),USP7和USP47 可激活炎性小體引起炎癥介質IL-18 及IL-1β釋放增多,在包括呼吸系統(tǒng)在內的多種炎癥反應中起積極作用[15]。雖然目前其具體機制尚需進一步探查,但研究已經發(fā)現(xiàn)USP7在炎癥疾病治療中具有一定的潛力。

3 USP7抑制劑研究

USP7作為一個表達高且廣的泛素化酶,負責調節(jié)諸多的細胞過程。鑒于其在DNA 損傷、病毒復制、神經系統(tǒng)病變、腫瘤、炎癥等病變中的作用,決定了選擇性化學抑制USP7是極有前途的藥物靶點。近年來針對USP7 抑制研究一直是熱門話題。目前所報告的抑制劑主要為吡嗪類、吡啶類、噻吩類、喹唑啉類和吖啶類[27]。文獻報道的第一個USP7抑制劑HBX41108屬于吡嗪類的一員,它通過非競爭性抑制機制抑制USP7介導的p53的去泛素化過程,其促進凋亡作用依賴于p53的水平。選擇性抑制USP7的吡啶衍生物以GNE-6640 和GNE-6776 為代表,它們可與USP7通過非共價結合的方式在催化半胱氨12? 位置進行結合以減弱泛素結合,進而反向抑制USP7去泛素化的活力,誘導腫瘤細胞凋亡[28]。早先發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤細胞中USP7處于高表達狀態(tài),而噻吩衍生物P5091可通過抑制USP7蛋白表達促進HDM2降解,從而誘導瘤細胞的凋亡并減少硼替佐米耐藥性。作為P5091類似物的P22077也在兒童神經母細胞瘤中發(fā)現(xiàn)了相似的現(xiàn)象,并且新的研究還觀察到P22077抑制USP7 和USP47 激活巨噬細胞炎性體,盡管其機制尚未明確[15]。USP7的特異性抑制劑喹唑啉衍生物共價結合的FT671和非共價結合的FT827可增加p53表達及MDM2的降解,從而達到抑癌作用。吖啶衍生物的代表HBX19818和HBX28258與USP7作用時,由于共價鍵形成,故產生不可逆轉的抑制,且其抗腫瘤活性與p53狀態(tài)無關。既往有細胞實驗結果顯示HBX19818 對其他去泛素化酶無影響,僅對USP7特異性作用。但最近一項研究發(fā)現(xiàn),HBX19818通過抑制USP10可引起脾酪氨酸激酶和FMS樣的酪氨酸激酶3雙重降解,來誘導AML 細胞死亡[29]。這提示USP7抑制劑的研究遠未達到終點。

4 小結與展望

USP7作為DUB家族成員之一,其去泛素化作用可以調節(jié)機體復雜生物功能,由于與已知的致癌途徑和其他疾病建立了聯(lián)系而引起了特別的關注。越來越多的證據顯示,抑制USP7可能對治療病毒復制、炎性疾病、神經系統(tǒng)病變、癌癥等有益,雖然目前針對USP7的小分子抑制劑越來越多,但大部分都針對腫瘤治療,對其他疾病的研究投入甚少,USP7抑制劑相關的研究還有巨大的空間。到目前為止USP7抑制劑僅在科學研究中使用,尚未進入臨床研究階段,故仍需進一步研究來評估USP7抑制劑作為治療藥物的安全性及有效性。盡管如此,USP7 的小分子抑制劑抗腫瘤的效果已然顯露,在其他疾病研究中也已經開始取得相應進展,其在諸多疾病的未來治療中將擁有巨大的潛力。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突