脫氫/還原酶及其輔酶再生循環(huán)的研究進展

杜美妮,許 超,黃 金

(浙江工業(yè)大學 藥學院,浙江 杭州 310014)

由于傳統(tǒng)化學工業(yè)造成了環(huán)境嚴重污染以及人們對生物基化學品、生物能源和藥物安全性需求的增加,化學工業(yè)已顯現(xiàn)出從石油基到生物基的快速轉變趨勢。利用微生物細胞或酶的生物催化功能,進行大規(guī)模的物質(zhì)加工與轉化生產(chǎn)人類所需的化學品,已成為各國研究者研究與關注的焦點,其關鍵核心為生物催化技術[1]。在生物催化技術領域的化學品工業(yè)化生產(chǎn)過程中,微生物或酶往往需要在一些不利于生理狀態(tài)的環(huán)境脅迫條件中進行高效的生物合成或轉化,而這些環(huán)境條件往往成為生化反應順利進行的限制性因素;同時,在進行篩選適應于反應的輔助底物及其最優(yōu)條件時往往存在一定的盲目性,費時費力;而通過介質(zhì)工程的手段對生物催化過程進行革新,近年來雖不斷取得新進展,但由于溶媒存在的諸如生物相容性和利用度等問題,通常會降低整個生產(chǎn)過程的效率,增加生產(chǎn)成本[2-3]。因此,如何有效地對生物催化劑進行改造,提高它們在惡劣環(huán)境中的生產(chǎn)能力已成為生物催化技術應用亟待解決的關鍵問題。

1 介導雙酮基還原的脫氫/還原酶

脫氫/還原酶在輔酶NAD(H)或NADP(H)的存在下進行羰基的立體選擇性還原,因其具有高度的區(qū)域和立體選擇性,常用于生物催化合成在化學、醫(yī)藥和精細化學品等領域有重要應用價值的手性化合物。與典型的脫氫/還原酶不同,另有一類脫氫/還原酶可以同時還原2個酮基,被命名為雙酮基還原酶,其還原過程是先形成穩(wěn)定的單羥基中間體,再連續(xù)地形成雙手性醇基化合物,該雙手性醇基化合物是他汀類藥物的重要手性砌塊,其中具有2個手性醇砌塊的制備和生產(chǎn)技術已成為制約他汀類藥物生產(chǎn)成本的瓶頸技術[4]。該手性砌塊的化學法制備具有較大的技術挑戰(zhàn)性,如何經(jīng)濟高效地合成該手性砌塊已成為國內(nèi)外化學及生物催化合成研究的熱點和難點。生物催化技術具備立體選擇性和區(qū)域選擇性高、過程高效、反應溫和、環(huán)境友好等特點,利用生物催化技術實現(xiàn)該手性砌塊2個手性中心的一步法制備,具有重要的應用價值。但迄今為止,很難將已發(fā)現(xiàn)的自然界存在的脫氫/還原酶介導的雙酮基還原生物催化過程轉化為高效的工業(yè)化生產(chǎn)過程,其根本原因在于生物催化過程相對于其他工藝路線,如化學合成,并沒有顯著的經(jīng)濟競爭優(yōu)勢[1],具體表現(xiàn)在:1) 生物的多樣性和輔酶產(chǎn)生/利用途徑的多樣性特點,致使輔酶的利用機制仍無統(tǒng)一性規(guī)律可循,進而在催化過程中表現(xiàn)為額外添加輔酶所帶來的生產(chǎn)成本上升;2) 環(huán)境脅迫條件下菌體或酶進行改造的步伐緩慢,致使生物催化劑介導雙酮基還原的生物催化過程在惡劣環(huán)境中的生產(chǎn)能力,如反應體系底物濃度和產(chǎn)率等工業(yè)化指標,仍遠不能與化學合成方法相媲美。

縱觀介導雙酮基還原的脫氫/還原酶,可分為3類:墨蝶呤還原酶(sepiapterin reductase,SR)、α-乙酰酮基還原酶(Gre2p)、雙酮基還原酶(diketoreductase,DKR),而具備生物催化工業(yè)化生產(chǎn)潛力和最新研究的焦點在后兩種酶,表1列舉了介導雙酮基還原的脫氫/還原酶Gre2P和DKR的最新研究進展。其中,來自面包酵母Saccharomycescerevisiae的Gre2p可以顯著地將二羰基化合物,特別是α-和β-二酮和酮酯,還原成具有高ee的手性醇,但時空產(chǎn)率較低,且該酶是NADPH依賴性酶,再生需要大量的共底物。Gre2P反prelog規(guī)則,其往往催化酮基底物得到S型手性醇[5-6]。Peschke等[7]利用微流控技術來實現(xiàn)(R)-選擇性醇脫氫酶、(S)-選擇性α-乙酰酮基還原酶和酶葡萄糖脫氫酶的級聯(lián)反應,控制二酮基底物的選擇性不對稱還原。Muller等[8]通過重組DNA技術將面包酵母中編碼Gre2p的基因克隆至大腸中進行重組表達,提高了目標蛋白的表達量,用丁基瓊脂糖凝膠純化后,純酶催化2,5-己二酮不對稱還原制備(2S,5S)-己二醇,時空產(chǎn)率為70 g/(L·d),相較于面包酵母全細胞轉化提高了17倍。除此之外,DKR介導的β,δ-二酮酯的立體選擇性雙酮基還原“一鍋法”生物催化工藝也為他汀類側鏈的制備提供了簡單有效的途徑,Wu等[9-10]發(fā)現(xiàn)不動桿菌AcinetobacterbaylyiATCC 33305中存在DKR,可不對稱催化還原3,5-雙羰基-6-芐氧基-己酸乙酯得到手性雙醇3R,5S-二羥基-6-芐氧基己酸乙酯,并通過DNA重組技術將其DKR基因在大腸桿菌中過量表達,純化后得到的純酶具有高度的立體選擇性,產(chǎn)物的對映體過量值ee和非對映體過量值de均達到99.5%以上。以AcinetobacterbaylyiATCC 33305中的DKR為研究對象,Lu等[11]進行高效催化制備他汀類藥物的重要中間體手性雙醇砌塊的催化機理研究,結合結構測定、分子對接和生化分析等方法對DKR轉化雙酮基底物產(chǎn)手性雙醇的過程進行研究,發(fā)現(xiàn)在雙酮基還原及其逆反應過程中均生成2個單羥基中間產(chǎn)物,證明DKR催化的雙羰基還原是兩步反應過程。

表1 關于介導雙酮基還原的脫氫/還原酶的報道

2 介導羰基立體選擇性還原過程的輔酶再生

如何構建微生物細胞內(nèi)介導脫氫/還原酶進行羰基的立體選擇性還原的輔酶再生循環(huán)系統(tǒng),已成為生物催化法制備手性醇類藥物砌塊過程的核心問題[13-14],針對此問題的研究一般從酶偶聯(lián)和底物偶聯(lián)2個方向開展。介導羰基立體選擇性還原的輔酶再生循環(huán)系統(tǒng)如圖1所示。

圖1 介導羰基立體選擇性還原的輔酶再生循環(huán)系統(tǒng)

在圖1(a)所示的酶偶聯(lián)系統(tǒng)中,通過脫氫/還原酶和輔酶NADP(H)在同一個細胞中共同表達,來實現(xiàn)氧化還原反應和輔酶再生的同時進行,而偶聯(lián)酶用于酶偶聯(lián)系統(tǒng)中來強化輔酶NADP(H)的再生,常見的偶聯(lián)酶有葡萄糖脫氫酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、甲酸脫氫酶和乙醇脫氫酶。Muller等[8]為克服來源于Thermoanaerobactersp.的醇脫氫酶在體內(nèi)一步法制備雙醇手性砌塊催化效率過低的問題,即80 mmol/L雙酮底物,125 g/L濕菌體,反應2～3 d,產(chǎn)率90%,純化了來自于面包酵母的Gre2p,在體外條件下通過添加輔酶NADP(H)和偶聯(lián)酶葡萄糖脫氫酶,過程體積產(chǎn)率可達80 g/(L·d),但20 mmol/L的較低的雙酮底物濃度、昂貴的輔酶添加及外源葡萄糖脫氫酶的添加,無疑降低了其工業(yè)化應用價值。據(jù)報道[15],通過酶促還原叔丁基(5R)-6-氰基-5-羥基-3-氧代己酸叔丁酯來合成(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羥基己酸叔丁酯是目前生物催化工業(yè)化制備阿托伐他汀手性側鏈的主要方法,但該工藝必須額外添加輔酶NADP(H),工業(yè)化成本較高。基于此,Wu等[16]構建了同時表達羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶的全細胞生物催化系統(tǒng),優(yōu)化后,在35 g/L的底物質(zhì)量濃度下轉化7 h,無需外源添加輔酶,(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羥基己酸叔丁酯的產(chǎn)率高達到120 g/(L·d),對映體過量值ee和非對映體過量值de均大于99.5%,大大提高了制備他汀類側鏈的總效率。

在圖1(b)所示的底物偶聯(lián)系統(tǒng)中,單一酶既充當目標反應的催化劑又充當輔酶再生的催化劑。為了有效地合成(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(S)-CHBE,Xu等[17]通過基因組挖掘技術發(fā)現(xiàn)了一種來自解脂耶氏酵母的NADPH依賴性羰基還原酶Y1CR2,其在大腸桿菌中過表達,可將3 000 mmol/L 4-氯-3-羰基丁酸乙酯COBE還原為(S)-CHBE,其產(chǎn)率為90%,ee為99%,并通過添加偶聯(lián)底物山梨糖醇或甘露醇可以實現(xiàn)NADPH的再生,大大降低了(S)-CHBE的生產(chǎn)成本。Tan等[18]也通過基因挖掘技術發(fā)現(xiàn)了可不對稱還原COBE得到(S)-CHBE的短鏈脫氫酶SgCR,在水/甲苯雙相系統(tǒng)中,使用異丙醇作為NADH再生循環(huán)的輔助底物,COBE轉化率達到99%,產(chǎn)物ee>99%,(S)-CHBE時空產(chǎn)率達到22.5 g/L/h。醇脫氫酶與經(jīng)濟的底物偶聯(lián)來再生輔酶在手性醇的不對稱合成中起著關鍵作用,然而,由于酶對異丙醇的耐受性差以及副產(chǎn)物丙酮的不利影響限制了其應用,Yang等[19]通過傳統(tǒng)的基因組挖掘技術從嗜麥芽單胞菌中鑒定出1種新的醇脫氫酶基因,該酶顯示出較高的異丙醇耐受性,不添加輔酶的情況下,可以在>150 g/L的高底物負載情況下合成結構多樣的手性醇。其中,約780 g/L的乙酰乙酸乙酯僅在2.5 h內(nèi)即可完全轉化為(R)-3-羥基丁酸乙酯,ee為99.9%,時空產(chǎn)率為7 488 g/(L·d)。另據(jù)報道,在E.Coli中異源表達來源于Acinetobacterbaylyi可原位再生輔酶的重組DKR,該酶顯示出雙輔酶依賴型(NAD(H)和NADP(H)),且具有NAD(H)偏好性。通過輔酶的外源添加,并借助輔助底物異丙醇的添加來增加輔酶再生循環(huán)強度,可進一步提高催化效率[14,20]。有報道指出[21],大腸桿菌細胞可以通過糖酵解途徑和膜內(nèi)嵌葡萄糖脫氫酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶同時再生NADH和NADPH,在以葡萄糖為輔助底物時,細胞被認為能夠提供足夠多的輔酶用于雙酮基底物的還原反應。

因此,通過添加偶聯(lián)輔助底物或加強偶聯(lián)葡萄糖脫氫酶基因的表達可強化催化效率,但輔酶再生是還原途徑與氧化途徑偶聯(lián)的結果,單方面強化還原途徑或氧化途徑均會打破反應平衡。因此,如何拓展可利用的還原力,強化在環(huán)境脅迫條件下雙酮基還原酶介導的還原途徑,成為提高催化效率的根本性問題。

3 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動態(tài)分析

因介導脫氫/還原酶的輔酶的合成涉及數(shù)百個體內(nèi)代謝途徑,例如NAD(H)全程參與微生物胞內(nèi)300多個氧化還原反應[22],并且從理論上來說人們認為微生物經(jīng)過生長代謝已經(jīng)積累了足夠量的不同類型的輔酶來應用于不對稱還原反應[23],例如通過共表達葡萄糖脫氫酶進行偶聯(lián)反應,加速后,輔酶的TTN即每摩爾NAD(P)H生成產(chǎn)物的量可高達21 600,不需外加任何輔酶即可完成,所以對輔酶再生循環(huán)的理性改造往往從3個方面來進行,輔酶再生方案如圖2所示。

圖2 輔酶再生循環(huán)改進方案

1) 輔酶依賴性的改變:如圖2(a)所示,即改造或置換脫氫/還原酶的分子,一般是輔酶結合區(qū),即:臨近N端的甘氨酸富集區(qū)的特定殘基,實現(xiàn)共底物依賴性的改變[24];利用不同輔酶依賴性的酶,實現(xiàn)NADH和NADPH甚至是多種輔酶的高效利用,達到高效催化制備他汀類藥物的重要中間體手性雙醇砌塊的目的,但針對此方面的報道卻較為鮮見。大部分醛酮還原酶蛋白N端含有高度保守的輔酶結合區(qū)域LxxxGxxxPxxGxG,導致醛酮還原酶更偏愛利用NADPH作為共底物[25],而NADPH價格比NADH貴10倍且穩(wěn)定性比NADH差,所以NADH作為還原酶的共底物更經(jīng)濟。野生型的5β-孕酮還原酶(P5βRs)通過依賴NADPH作為輔酶能夠選擇性地還原多種底物,例如類固醇和烯酮。Li等[26]通過酶的理性設計技術成功地確定了決定該酶輔酶特異性的2個關鍵氨基酸殘基,R63K和R64H突變使酶能夠以NADH作為輔酶,同時將酶的活性提高了13.8倍。迄今為止,所有報道的7β-羥基類固醇脫氫酶都是NADPH依賴性酶,You等[27]基于結構信息和保守序列的比對合理的設計了5個酶突變體,其中突變體G39D使酶的輔酶特異性從NADPH變?yōu)镹ADH,并且酶的活性增強了223倍。

2) 構建共表達系統(tǒng):如圖2(b)所示,即構建串聯(lián)表達脫氫/還原酶和偶聯(lián)酶的表達系統(tǒng)或雙質(zhì)粒表達系統(tǒng),使生物轉化過程中輔酶得到高效利用;昂貴的NAD(P)H添加阻礙了還原酶不對稱還原1-boc-3-哌啶酮來生產(chǎn)(S)-N-boc-3-羥基哌啶((S)-NBHP),為了原位再生輔酶,Chen[28]等將來自布氏熱厭氧菌屬的乙醇脫氫酶基因和枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因重組到大腸桿菌BL21(DE3)中,以500 mmol/L的底物濃度制備(S)-NBHP(ee>99%),(S)-NBHP的轉化率僅在3 h內(nèi)就達到了96.2%,時空產(chǎn)率約為774 g/(L·d)。Zhou等[29]為解決近平滑假絲酵母中NADH依賴性(R)-羰基還原酶對2-羥基苯乙酮的生物轉化反應緩慢且轉化產(chǎn)物(R)-1-苯基-1,2-乙二醇收率低的問題,構建了一個共表達(R)-羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶的酶偶聯(lián)系統(tǒng),以增強大腸桿菌中的NADH循環(huán)途徑,在最佳條件下(R)-1-苯基-1,2-乙二醇光學純度達到了99.9%,且產(chǎn)率為99.9%,葡萄糖脫氫酶的引入使(R)-1-苯基-1,2-乙二醇的光學純度和收率分別提高了23.8%和63.8%,同時使反應時間縮短到原來的一半。通過上述研究發(fā)現(xiàn),構建共表達系統(tǒng)可通過蛋白表達和生物轉化優(yōu)化來平衡羰基還原反應和輔酶再生反應,以達到強化目標反應的目的。

3) 拓展偶聯(lián)酶利用度:如圖2(c)所示,即依據(jù)脫氫/還原酶不對稱還原順序催化機理[30],針對單一輔酶提供有限的還原力已成為脫氫/還原酶介導的全細胞生物催化反應的問題,通過拓展可利用的再生輔酶資源可有效提高催化效率。輔酶再生方案的應用價值一般通過TTN來評估,具有工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)潛力的輔酶再生方案中,TTN應達到104～106[31]。當前,有許多可有效回收NADPH的原位再生系統(tǒng),包括工程葡萄糖/葡萄糖6-磷酸脫氫酶[32],甲酸脫氫酶[33]和亞磷酸酯脫氫酶[34]。而回收NADP+的系統(tǒng)在工業(yè)上受到限制,目前使用最廣泛的偶聯(lián)酶是谷氨酸脫氫酶,但谷氨酸脫氫酶介導的氧化還原反應會生成副產(chǎn)物谷氨酸使產(chǎn)物的分離純化復雜化,為此還開發(fā)了其他再生方案,包括D-乳酸脫氫酶[35]、NADPH氧化酶[36]和漆酶/介質(zhì)體系[37],但后三者的TTN值很低,因此迫切需要開發(fā)新的輔酶再生體系。Antonio等[31]構建了基于谷胱甘肽的NADP+回收體系,該體系需要使用兩種協(xié)同作用的酶:來自大腸桿菌的谷氧還蛋白和來自啤酒酵母的谷胱甘肽還原酶,該體系通過谷胱甘肽再循環(huán)來再生NADP+,TTN超過5×105,具有工業(yè)化應用潛力。

4 結 論

由以上研究結果可知針對雙酮基還原酶為代表的脫氫/還原酶高效催化相關反應的研究大都集中在酶活性中心的改造和催化工藝優(yōu)化上。由于生物的多樣性和輔酶產(chǎn)生/利用途徑的多樣性特點,使輔酶的利用機制仍無統(tǒng)一規(guī)律可循,大都是在利用輔酶的偏好性方面進行輔酶依賴性的相關研究,進而使研究進展仍未取得令人滿意的結果,比如輔酶的額外添加帶來的生產(chǎn)成本上升;反應體系底物濃度和產(chǎn)率等指標仍遠不能與化學合成方法相媲美;單純地通過單脫氫酶(偶聯(lián)酶)基因的表達來增加NAD(P)+或NAD(P)H的供給,往往得不到預想的效果。因此,依據(jù)全細胞可催化脫氫/還原過程且能進行輔酶再生的自然規(guī)律,針對構建新型輔酶再生循環(huán)體系、微生物細胞自身對外界環(huán)境的適應和調(diào)節(jié)能力方面進行研究,揭示雙酮基還原酶及其同工酶輔酶依賴性的分子基礎和目標產(chǎn)物雙手性醇在最大化的情況下雙酮基還原酶利用兩種輔酶的機制,賦予輔酶再生循環(huán)更清晰的生物學意義,揭示環(huán)境脅迫條件下蛋白催化結構域的變化規(guī)律,闡述環(huán)境擾動因子和催化效率的因果關系,對促進人工調(diào)控生物制備過程和源自微生物的重要手性藥物中間體的生產(chǎn)具有重要的應用價值。