不同消泡劑對(duì)裂殖壺菌生長(zhǎng)的影響

張 良,羅 杰,樊 濤,高啟平

(通威股份有限公司,四川 成都 610200)

二十二碳六烯酸DHA是一種重要的ω-3系列多不飽和脂肪酸,具有促進(jìn)嬰幼兒智力和視力發(fā)育、預(yù)防心血管疾病、抗癌、抗炎、增強(qiáng)免疫力等功效[1-4]。裂殖壺菌(Schizochytriumsp.)因其胞內(nèi)DHA含量高、生長(zhǎng)快和易于培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn),是工業(yè)產(chǎn)DHA的理想菌株之一[5-7]。裂殖壺菌在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量油脂，結(jié)合其他多種因素導(dǎo)致泡沫的形成,而泡沫過(guò)量將會(huì)造成原料浪費(fèi)[8]，影響菌體正常呼吸代謝[9]及引起雜菌污染[10],因此為保證發(fā)酵的正常進(jìn)行,需要及時(shí)控制發(fā)酵體系中的泡沫。

目前,發(fā)酵工業(yè)中常采用添加消泡劑的方法控制泡沫,考慮到消泡劑的熱穩(wěn)定性、安全性、消泡能力、耐酸耐堿能力和成本等因素,常用的消泡劑主要有聚醚類消泡劑、有機(jī)硅類消泡劑和新型聚醚改性硅類消泡劑。聚醚類消泡劑屬非離子表面活性劑,主要分為聚氧丙烯甘油GP型、聚氧乙烯氧丙烯甘油GPE型和GPES型3類。其中GP型消泡劑以甘油為起始劑,由環(huán)氧丙烷或環(huán)氧乙烷與環(huán)氧丙烷的混合物進(jìn)行加成聚合而制成,親水性差,在發(fā)泡介質(zhì)中的溶解度小,抑泡能力強(qiáng),消泡能力較弱;GPE型聚醚消泡劑是在GP型消泡劑的聚丙二醇鏈末端再加成環(huán)氧乙烷,成為鏈端親水基的聚氧乙烯氧丙烯甘油,親水性較好,在發(fā)泡介質(zhì)中易鋪展,消泡能力較強(qiáng),但消泡活性維持時(shí)間短。GPES型聚醚類消泡劑是在GPE型消泡劑鏈端用疏水基硬脂酸酯封頭,形成兩端是疏水鏈,中間隔有親水鏈的嵌段共聚物。這種結(jié)構(gòu)的分子易于平臥狀聚集在氣液界面,因而表面活性強(qiáng),消泡效率高。有機(jī)硅消泡劑是由硅脂、乳化劑、防水劑和稠化劑等配以適量水經(jīng)機(jī)械乳化而成[11],其主要的消泡活性組分是二甲基硅油,該類型消泡劑涵蓋“抑泡”和“破泡”的雙重功能,通過(guò)降低水溶液、懸浮液等的表面張力,以防止泡沫形成或使原有的泡沫減少,但在較高溫度下容易出現(xiàn)破乳、漂油等現(xiàn)象。聚醚改性硅消泡劑通過(guò)在聚硅氧烷鏈段上引入聚醚鏈端制成聚醚-硅氧烷共聚物[12],兼具聚醚類消泡劑和有機(jī)硅消泡劑兩種消泡劑的優(yōu)點(diǎn),表面張力低,消泡迅速、抑泡時(shí)間長(zhǎng)、成本低和用量少。消泡劑的添加會(huì)部分影響到菌體的正常生長(zhǎng),不同的消泡劑對(duì)微生物細(xì)胞生長(zhǎng)速率,細(xì)胞形態(tài)和產(chǎn)物合成的影響不同,因此筆者對(duì)有機(jī)硅類消泡劑、聚醚改性硅消泡劑1(D120-GA)、聚醚改性硅消泡劑2(D125-GA)、聚醚消泡劑237-2和聚醚消泡劑237-5這5種消泡劑對(duì)裂殖壺菌菌體生長(zhǎng)的影響進(jìn)行探究,以期篩選出適合裂殖壺菌工業(yè)發(fā)酵的消泡劑。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

菌種:裂殖壺菌Schizochytriumsp.STW3,來(lái)源于通威股份有限公司微生物研發(fā)項(xiàng)目組實(shí)驗(yàn)室。

活化培養(yǎng)基:葡萄糖5 g/L,酵母浸粉1 g/L,蛋白胨1 g/L,海鹽15 g/L,瓊脂17 g/L,pH 6.0,121 ℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L,酵母浸粉10 g/L,蛋白胨5 g/L,海鹽15 g/L,pH 6.0,121 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖90 g/L,玉米漿干粉15 g/L,酵母膏20 g/L,蛋白胨5 g/L,海鹽15 g/L,添加無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液至發(fā)酵培養(yǎng)基體積為12 L,pH 6.0,121 ℃滅菌30 min。

1.2 消泡劑種類及添加量

消泡劑添加量均為12 L發(fā)酵體積的0.1%,即12 mL,消泡劑種類及添加方式見(jiàn)表1。

表1 消泡劑種類及對(duì)應(yīng)發(fā)酵罐

1.3 培養(yǎng)方法

菌種活化:將保藏于-70 ℃的菌種轉(zhuǎn)接至平板中,28 ℃培養(yǎng)2 d。

一級(jí)種子培養(yǎng):用接種環(huán)挑取活化的菌種轉(zhuǎn)接至裝液量為50 mL/250 mL種子培養(yǎng)基中,28 ℃,200 r/min培養(yǎng)24 h。

二級(jí)種子培養(yǎng):將一級(jí)種子接種至裝液量為200 mL/1 000 mL種子培養(yǎng)基中,28 ℃,200 r/min培養(yǎng)20 h,用于發(fā)酵罐接種。

1.4 發(fā)酵罐發(fā)酵工藝

按發(fā)酵體積12 L的5%作為接種量,將培養(yǎng)好的二級(jí)種子液分別通過(guò)火焰接種于裝液量為60%的20 L發(fā)酵罐中。初始pH 6.0,溫度28 ℃,前48 h通過(guò)控制轉(zhuǎn)速(200～600 r/min)和通氣量(0.72～4.0 m3/h)控制溶氧,使其維持在20%以上,在48 h后通過(guò)補(bǔ)料、調(diào)整通氣量和轉(zhuǎn)速聯(lián)動(dòng)控制溶氧在10%～20%。

1.5 檢測(cè)方法

1.5.1 菌體濃度及生物量的測(cè)定

OD測(cè)定法測(cè)定菌體濃度:取1 mL發(fā)酵液稀釋后檢測(cè)600 nm波長(zhǎng)下的吸光度。

干重測(cè)定法測(cè)定生物量:取10 mL發(fā)酵液,7 000 r/min離心8～10 min,棄上清收集菌體,80 ℃干燥8～16 h至恒重后稱量。

1.5.2 葡萄糖含量測(cè)定

發(fā)酵過(guò)程中,取適量發(fā)酵液7 000 r/min離心8～10 min,取上清液,稀釋至一定濃度后,采用DNS法[13]測(cè)定發(fā)酵液中的剩余葡萄糖質(zhì)量濃度。

1.5.3 氨基氮的測(cè)定

采用甲醛滴定法[14]測(cè)定發(fā)酵過(guò)程發(fā)酵液的氨基氮質(zhì)量濃度。

1.6 數(shù)據(jù)分析

每隔8 h取樣測(cè)定,所有實(shí)驗(yàn)均做3次平行,用Origin 2018繪制成圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 24 h菌體形態(tài)檢查

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室之前研究,裂殖壺菌在發(fā)酵前16 h生長(zhǎng)緩慢,16～24 h呼吸代謝作用較強(qiáng),生長(zhǎng)較為旺盛,因此對(duì)24 h時(shí)不同發(fā)酵罐的裂殖壺菌在100倍油鏡下進(jìn)行顯微鏡檢,菌體形態(tài)如圖1所示。通過(guò)顯微鏡對(duì)添加不同消泡劑的發(fā)酵罐中的裂殖壺菌在24 h時(shí)進(jìn)行形態(tài)觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)有機(jī)硅類消泡劑對(duì)裂殖壺菌生長(zhǎng)基本無(wú)影響,菌體細(xì)胞形態(tài)完整,部分呈現(xiàn)分裂狀,結(jié)果如圖1(a)所示;圖1(b)中裂殖壺菌細(xì)胞分裂并不顯著,說(shuō)明聚醚改性硅消泡劑1(D120-GA)對(duì)裂殖壺菌的生長(zhǎng)存在一定程度的抑制作用;圖1(c)中裂殖壺菌細(xì)胞分裂較明顯,說(shuō)明聚醚改性硅消泡劑2(D125-GA)對(duì)裂殖壺菌生長(zhǎng)無(wú)顯著的影響;由圖1(d)可知:聚醚消泡劑237-2對(duì)裂殖壺菌的生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用,菌體生長(zhǎng)遲緩,無(wú)明顯的分離細(xì)胞,且觀察到細(xì)胞壁破裂;而在添加聚醚消泡劑237-5的發(fā)酵罐中,24 h時(shí)可觀察到部分處于分裂期的裂殖壺菌細(xì)胞,結(jié)果如圖1(e)所示,說(shuō)明雖然其對(duì)裂殖壺菌的生長(zhǎng)存在抑制作用,但抑制作用比較弱。

圖1 不同發(fā)酵罐中24 h時(shí)裂殖壺菌鏡檢結(jié)果

2.2 發(fā)酵過(guò)程中參數(shù)的測(cè)定

為滿足裂殖壺菌的生長(zhǎng)需求,在發(fā)酵過(guò)程中需提高攪拌速度,提高發(fā)酵罐中的空氣量,從溶氧、轉(zhuǎn)速和通氣量三者之間的變動(dòng)來(lái)大致判定發(fā)酵罐中菌細(xì)胞生長(zhǎng)與否。對(duì)發(fā)酵過(guò)程中溶氧、溫度、pH和轉(zhuǎn)速及通氣量的變化進(jìn)行監(jiān)測(cè),結(jié)果如圖2所示。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中,不同發(fā)酵罐中溫度變化差異較小,基本控制在28 ℃,但溶氧、轉(zhuǎn)速、通氣量和pH在不同發(fā)酵罐中表現(xiàn)出了不同程度的變化。1) 各發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速變化趨勢(shì)如圖2(a)所示,添加有機(jī)硅消泡劑罐的轉(zhuǎn)速在前4 h緩慢增加,8 h后迅速增加至460 r/min,隨后保持穩(wěn)定;在添加聚醚改性硅消泡劑1(D120-GA)和添加聚醚消泡劑237-5的兩個(gè)發(fā)酵罐中整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中,轉(zhuǎn)速恒定為200 r/min;在添加聚醚改性硅消泡劑2(D125-GA)和添加聚醚消泡劑237-2的兩個(gè)發(fā)酵罐中,轉(zhuǎn)速隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加,直至32 h時(shí)達(dá)到480 r/min。轉(zhuǎn)速和溶氧成正比,轉(zhuǎn)速增加會(huì)增加發(fā)酵罐中溶氧,說(shuō)明裂殖壺菌生長(zhǎng)很好,迅速生長(zhǎng)消耗氧氣。從轉(zhuǎn)速來(lái)看:添加有機(jī)硅、聚醚改性硅消泡劑2(D125-GA)、聚醚消泡劑237-2這3種消泡劑是發(fā)酵罐裂殖壺菌比添加聚醚改性硅消泡劑1(D120-GA)和聚醚消泡劑237-5更耗氧,生長(zhǎng)更好。2) 各發(fā)酵罐通氣量變化趨勢(shì)如圖2(b)所示,在添加有機(jī)硅消泡劑和聚醚改性硅消泡劑2(D125-GA)的發(fā)酵罐中,通氣量從最開(kāi)始1.0 L逐漸增加12 h時(shí)的4.0 L,隨后保持穩(wěn)定;在添加聚醚改性硅消泡劑1(D120-GA)和聚醚消泡劑237-5的2個(gè)發(fā)酵罐中,通氣量前期保持1.0 L恒定,16 h后增加至1.5 L,隨后保持穩(wěn)定;在添加聚醚消泡劑237-2的發(fā)酵罐中,通氣量恒定為1.0 L。通氣量和溶氧成正比,通氣量越大發(fā)酵罐內(nèi)溶氧越高,說(shuō)明裂殖壺菌生長(zhǎng)很好,迅速生長(zhǎng)，消耗氧氣。從通氣量看,在添加有機(jī)硅消泡劑和聚醚改性硅消泡劑2(D125-GA)的發(fā)酵罐中,裂殖壺菌生長(zhǎng)好于添加聚醚改性硅消泡劑1(D120-GA)、聚醚消泡劑237-5和聚醚消泡劑237-2的3個(gè)發(fā)酵罐。3) 各發(fā)酵罐剩余溶氧變化趨勢(shì)如圖2(c)所示,在添加有機(jī)硅消泡劑和聚醚改性硅消泡劑2(D125-GA)的發(fā)酵罐,發(fā)酵罐內(nèi)溶氧從最開(kāi)始的100%逐漸下降,在16 h時(shí)分別下降到16.5%和12.5%,隨后基本保持穩(wěn)定;在添加聚醚改性硅消泡劑1(D120-GA)、聚醚消泡劑237-5和聚醚消泡劑237-2的3個(gè)發(fā)酵罐中,發(fā)酵罐內(nèi)溶氧從最開(kāi)始的100%分別逐漸下降至81.7%,81.5%和81.2%,下降幅度均很小。發(fā)酵罐剩余溶氧越低裂殖壺菌耗氧就越高,裂壺菌生長(zhǎng)越好耗氧越高。從溶氧看:添加有機(jī)硅消泡劑和聚醚改性硅消泡劑2(D125-GA)的發(fā)酵罐中裂殖壺菌生長(zhǎng)的更好。4) 各發(fā)酵罐pH變化趨勢(shì)如圖2(d)所示,添加有機(jī)硅消泡劑和聚醚改性硅消泡劑2(D125-GA)的發(fā)酵罐中,pH在16 h前基本維持在6.0左右,在16 h后整體上逐漸升高至8.36,裂殖壺菌細(xì)胞合成大量次級(jí)代謝產(chǎn)物,且呼吸作用增強(qiáng),伴隨著體系營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡,pH升高;在添加聚醚改性硅消泡劑1(D120-GA)、聚醚消泡劑237-5和聚醚消泡劑237-2的3個(gè)發(fā)酵罐中,pH基本維持穩(wěn)定在6.0左右,說(shuō)明次級(jí)代謝產(chǎn)物不多,pH整體不大,3種消泡劑均對(duì)裂殖壺菌細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用。

圖2 不同消泡劑對(duì)裂殖壺菌發(fā)酵過(guò)程中環(huán)境參數(shù)的影響

2.3 OD600、生物量、殘?zhí)羌鞍被臏y(cè)定

通過(guò)生物量、OD600、殘?zhí)呛桶被淖兓厔?shì),可快速判斷發(fā)酵罐中裂殖壺菌的生長(zhǎng)情況,結(jié)果如圖3所示。總體上,生物量、OD600、殘?zhí)呛桶被?個(gè)發(fā)酵罐中變化趨勢(shì)保持一致,生物量與OD600測(cè)定值顯著上升,而殘?zhí)桥c氨基氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)均逐漸下降,不同發(fā)酵罐的變化程度不同。1) 各發(fā)酵罐生物量變化趨勢(shì)如圖3(a)所示。在添加有機(jī)硅消泡劑發(fā)酵罐中,隨著發(fā)酵的進(jìn)行,菌體生長(zhǎng),生物量從發(fā)酵初期的2.9 g/L迅速上升至45.28 g/L。在添加聚醚改性硅消泡劑2(D125-GA)的發(fā)酵罐中,生物量變化趨勢(shì)與有機(jī)硅發(fā)酵罐類似,生物量從2.81g/L迅速上升至32 h時(shí)的48.93 g/L;在添加聚醚改性硅消泡劑1(D120-GA)的發(fā)酵罐中,生物量從2.77 g/L上升到10.27 g/L;在添加聚醚消泡劑237-2的發(fā)酵罐中,生物量從初始2.84g/L增長(zhǎng)到14.02 g/L;在添加聚醚消泡劑237-5的發(fā)酵罐中,生物量從2.87 g/L逐漸增加至15.02 g/L。生物量能直接反應(yīng)菌體生長(zhǎng)情況,生物量越高,菌體大量繁殖，生長(zhǎng)越好。從生物量來(lái)看,5種消泡劑中有機(jī)硅和聚醚改性硅消泡劑2(D125-GA)對(duì)發(fā)酵罐生物量的影響很接近,且遠(yuǎn)高于其他3種消泡劑。2) 各發(fā)酵罐OD600變化趨勢(shì)如圖3(b)所示。添加有機(jī)硅消泡劑發(fā)酵罐中,OD600從0.98增加至43.31。在添加聚醚改性硅消泡劑2(D125-GA)的發(fā)酵罐中,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)OD600從0.981增加至46.25,與有機(jī)硅消泡劑發(fā)酵罐變化趨勢(shì)類似。在添加聚醚改性硅消泡劑1(D120-GA)的發(fā)酵罐中,OD600從0.973增加到9.18，增長(zhǎng)幅度很小。在添加聚醚消泡劑237-2的發(fā)酵罐中,OD600從0.978增加到9.04，同樣增幅很小。在添加聚醚消泡劑237-5的發(fā)酵罐中,OD600從0.985增加到12.04。OD600能直觀反映菌體生長(zhǎng)情況,OD600越高裂殖壺菌生長(zhǎng)越好。從OD600來(lái)看,添加有機(jī)硅消泡劑和聚醚改性硅消泡劑2(D125-GA)的OD600遠(yuǎn)高于聚醚改性硅消泡劑1(D120-GA)、聚醚消泡劑237-2和聚醚消泡劑237-5 3種消泡劑。3)各發(fā)酵罐殘?zhí)琴|(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢(shì)如圖3(c)所示。添加有機(jī)硅消泡劑和聚醚改性硅消泡劑2(D125-GA)發(fā)酵罐中,由于菌體大量生長(zhǎng)會(huì)消耗大量糖類,發(fā)酵液中的殘?zhí)橇侩S發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低,從最開(kāi)始的93 g/L左右降低到5 g/L左右。在添加聚醚改性硅消泡劑1(D120-GA)、聚醚消泡劑237-2和聚醚消泡劑237-5 3種消泡劑發(fā)酵罐中,殘?zhí)琴|(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢(shì)很接近,降低很少,說(shuō)明耗糖低,菌體生長(zhǎng)受限制。裂殖壺菌在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)大量消耗葡萄糖,菌種生長(zhǎng)越好,發(fā)酵液中殘?zhí)琴|(zhì)量分?jǐn)?shù)越低。從殘?zhí)琴|(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢(shì)來(lái)看,5種消泡劑中,有機(jī)硅消泡劑和聚醚改性硅消泡劑2(D125-GA)對(duì)菌體抑制作用最小,裂殖壺菌能正常生長(zhǎng)。4)各發(fā)酵罐氨基氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢(shì)如圖3(d)所示。菌體大量生長(zhǎng)需要足夠的氮源,大量消耗含氮類物質(zhì)。在添加有機(jī)硅消泡劑和聚醚改性硅消泡劑2(D125-GA)發(fā)酵罐中,發(fā)酵液中的氨基氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低,從最開(kāi)始的5.6 g/L左右降低到0.9 g/L左右。在添加聚醚消泡劑237-2和聚醚消泡劑237-5 2種消泡劑的發(fā)酵罐中,氨基氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)也在逐漸減少,從最開(kāi)始的5.6 g/L左右降低到3.0 g/L左右,降低幅度不大。在添加聚醚改性硅消泡劑1(D120-GA)發(fā)酵罐中,全過(guò)程氨基氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本無(wú)變化,維持在6.0 g/L左右。裂殖壺菌正常生長(zhǎng),會(huì)消耗發(fā)酵液中的氮源,發(fā)酵液中氨基氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)就會(huì)相應(yīng)降低。從氨基氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢(shì)看,有機(jī)硅消泡劑和聚醚改性硅消泡劑2(D125-GA)對(duì)裂殖壺菌生長(zhǎng)影響較小,其能夠正常生長(zhǎng),聚醚改性硅消泡劑1(D120-GA)、聚醚消泡劑237-2和聚醚消泡劑237-5 3種消泡劑均對(duì)裂殖壺菌有一定程度上的抑制作用。

圖3 不同消泡劑對(duì)裂殖壺菌生長(zhǎng)的影響

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)裂殖壺菌發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行形態(tài)鏡檢、發(fā)酵參數(shù)和生長(zhǎng)參數(shù)測(cè)定，研究了有機(jī)硅消泡劑、聚醚改性硅消泡劑1(D120-GA)、聚醚改性硅消泡劑2(D125-GA)、聚醚消泡劑237-2和聚醚消泡劑237-5等5種不同的消泡劑對(duì)裂殖壺菌生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明:裂殖壺菌在添加有機(jī)硅類消泡劑的發(fā)酵罐中能正常生長(zhǎng),有機(jī)硅類消泡劑對(duì)裂殖壺菌生長(zhǎng)的毒害作用較低,可用于裂殖壺菌發(fā)酵的備選消泡劑;不同聚醚改性硅類消泡劑對(duì)裂殖壺菌生長(zhǎng)影響不同,聚醚改性硅消泡劑2(D125-GA)對(duì)裂殖壺菌生長(zhǎng)影響較小,可作為裂殖壺菌發(fā)酵生長(zhǎng)的消泡劑,而聚醚改性硅消泡劑1(D120-GA)對(duì)裂殖壺菌生長(zhǎng)有一定抑制作用,暫不推薦使用此消泡劑;聚醚類消泡劑(聚醚消泡劑237-2、聚醚消泡劑237-5)均會(huì)抑制裂殖壺菌的生長(zhǎng),所以在裂殖壺菌聚發(fā)酵過(guò)程中也不推薦添加聚醚類消泡劑。后續(xù)可對(duì)有機(jī)硅類消泡劑和聚醚改性硅消泡劑的使用濃度、對(duì)泡沫的消減能力、對(duì)裂殖壺菌生物量及DHA積累的影響等方面需展開(kāi)深入研究,以確定裂殖壺菌發(fā)酵生長(zhǎng)的最佳消泡劑。